基于試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法優(yōu)化香薷揮發(fā)油的提取工藝

陳海鷹，左 晶，左小明，朱珊梅

(1. 常州市第三人民醫(yī)院 藥事科，江蘇 常州 213000；2. 常州市第三人民醫(yī)院 急診科，江蘇 常州 213000）

香薷為唇形科植物石香薷Mosla chinensisMaxim.或江香薷M. chinensis‘Jiangxiangru’的干燥地上部分，具有發(fā)汗解表、化濕和中的功效[1]。揮發(fā)油是香薷藥材的主要藥效部位，存在于香薷藥材的莖、葉、花部位，氣味芳香，除了可以調(diào)節(jié)胃腸道功能和水液代謝，具有化濕和中的功效[2]，還對多種菌株和病毒的生長具有抑制作用[3-4]，可作為防疫消毒產(chǎn)品的原料[5-6]。香薷揮發(fā)油大多由水蒸氣蒸餾法制得，提取過程受眾多因素的影響，文獻(xiàn)報道的提取香薷揮發(fā)油的工藝較多，但存在不同學(xué)者優(yōu)化的提取工藝參數(shù)不一致的情況[6-8]，不同的工藝參數(shù)下制得的香薷揮發(fā)油質(zhì)量可能存在差異。

試驗(yàn)設(shè)計(jì)（Design of experiment, DOE）方法主要應(yīng)用于提高試驗(yàn)效率、改進(jìn)工藝技術(shù)、優(yōu)化產(chǎn)品設(shè)計(jì)、強(qiáng)化質(zhì)量管理等方面，近年來越來越多地運(yùn)用于中藥領(lǐng)域[9-10]。適宜的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法在中藥提取工藝參數(shù)優(yōu)化中起著事半功倍的作用。對影響香薷揮發(fā)油提取率所有因素進(jìn)行全因子試驗(yàn)的可行性較差，因此，本研究采用DOE 方法中的Plackett-Burman 設(shè)計(jì)篩選主要影響因素，Box-Behnken 設(shè)計(jì)聯(lián)合響應(yīng)面分析法優(yōu)化香薷揮發(fā)油的提取工藝參數(shù)，驗(yàn)證提取工藝的可行性，以期為改進(jìn)香薷揮發(fā)油的生產(chǎn)工藝和其它中藥揮發(fā)油提取工藝的優(yōu)化提供參考。

1 儀器和材料

XP105 型十萬分之一電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司）；ME104 型萬分之一電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司）；揮發(fā)油提取器（上海建強(qiáng)玻璃儀器有限公司）；ZNHW型控溫電熱套（上海錦賦實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備有限公司）；RE-52CS 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海雅榮生化設(shè)備儀器有限公司）；YL-060S 型超聲波清洗機(jī)（深圳語路清洗設(shè)備有限公司）。

香薷（批號：200817，產(chǎn)地：湖南省邵陽市），購自安徽省亳州市永剛飲片廠有限公司，經(jīng)常州市第三人民醫(yī)院范正達(dá)主任中藥師鑒定，符合《中國藥典》2020 年版（一部）“香薷”項(xiàng)下規(guī)定。正己烷（批號：20181018）、氯化鈉（批號：20181123）、無水硫酸鈉（批號：20160201）均為分析純，購自國藥化學(xué)試劑有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 水蒸氣蒸餾法提取香薷揮發(fā)油

將香薷藥材的花、葉、莖混合均勻，取香薷藥材50 g，精密稱定，置2 000 mL 圓底燒瓶中，按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)參數(shù)采用 《中國藥典》2020 年版（四部） （2204）“揮發(fā)油測定方法”[11]項(xiàng)下方法提取揮發(fā)油。收集揮發(fā)油，用正己烷沖洗溶解黏在測定器壁上的揮發(fā)油，合并所有揮發(fā)油，用正己烷分次萃取，合并萃取液，加入適量無水硫酸鈉脫水，2 ～ 8℃靜置24 h 后過濾，減壓除去正己烷，得到香薷揮發(fā)油，精密稱定重量，計(jì)算提取率。香薷揮發(fā)油提取率（%） = 香薷揮發(fā)油重量/香薷藥材重量×100%。

2.2 單因素試驗(yàn)方法考察影響香薷揮發(fā)油提取率的因素

2.2.1 浸泡時間 取香薷藥材5 份，每份50 g，精密稱定，按照“2.1”方法提取揮發(fā)油，在提取溶劑為1%氯化鈉溶液，液料比為12 mL/g，超聲時間為30 min，電熱套溫度為240℃，提取時間為4 h 的條件下，分別考察浸泡時間（0、15、30、45、60 min）對香薷揮發(fā)油提取率的影響，結(jié)果見圖1A。由圖1A可看出，香薷揮發(fā)油提取率隨浸泡時間的延長變化幅度較小，浸泡時間為30 min 時提取率最高。

2.2.2 超聲時間 取香薷藥材5 份，每份50 g，精密稱定，按照“2.1”方法提取揮發(fā)油，在提取溶劑為1%氯化鈉溶液，液料比為12 mL/g，浸泡時間為30 min，電熱套溫度為240℃，提取時間為4 h 的條件下，分別考察超聲時間（0、15、30、45、60 min）對香薷揮發(fā)油提取率的影響，結(jié)果見圖1B。由圖1B可看出，在0 ～ 60 min 范圍內(nèi)，香薷揮發(fā)油提取率隨超聲時間的延長不斷升高，超聲時間達(dá)30 min 后提取率變化幅度變小。

2.2.3 氯化鈉溶液濃度 取香薷藥材6 份，每份50 g，精密稱定，按照“2.1”方法提取揮發(fā)油，在液料比為12 mL/g，浸泡時間為30 min，超聲時間為30 min，電熱套溫度為240℃，提取時間為4 h 的條件下，分別考察氯化鈉溶液濃度（0、0.25%、0.5%、1.0%、2.0%、4.0%）對香薷揮發(fā)油提取率的影響，結(jié)果見圖1C。由圖1C 可看出，香薷揮發(fā)油的提取率隨氯化鈉溶液濃度的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，氯化鈉溶液濃度在1%時揮發(fā)油的提取率最高。

2.2.4 液料比 取香薷藥材6 份，每份50 g，精密稱定，按照“2.1”方法提取揮發(fā)油，在提取溶劑為1%氯化鈉溶液，浸泡時間為30 min，超聲時間為30 min，電熱套溫度為240℃，提取時間為4 h 的條件下，分別考察液料比（8、10、12、14、16、18 mL/g）對香薷揮發(fā)油提取率的影響，結(jié)果見圖1D。由圖1D可看出，液料比低于12 mL/g 時香薷揮發(fā)油的提取率隨液料比的增加而升高，當(dāng)液料比高于12 mL/g 后提取率有一定程度的下降。

2.2.5 提取時間 取香薷藥材5 份，每份50 g，精密稱定，按照“2.1”方法提取揮發(fā)油，在提取溶劑為1%氯化鈉溶液，液料比為12 mL/g，浸泡時間為30 min，超聲時間為30 min，電熱套溫度為240℃的條件下，分別考察提取時間（1、2、4、6、8 h）對香薷揮發(fā)油提取率的影響，結(jié)果見圖1E。由圖1E可看出，香薷揮發(fā)油的提取率隨提取時間的延長而增加，但提取時間達(dá)到4 h 后，提取率變化幅度變小。

2.2.6 電熱套溫度 取香薷藥材6 份，每份50 g，精密稱定，按照“2.1”方法提取揮發(fā)油，在提取溶劑為1%氯化鈉溶液，液料比為12 mL/g，浸泡時間為30 min，超聲時間為30 min，提取時間為4 h 的條件下，分別考察電熱套溫度（200、220、240、260、280、300℃）對香薷揮發(fā)油提取率的影響，結(jié)果見圖1F。由圖1F 可看出，在200 ～ 260℃范圍內(nèi)，香薷揮發(fā)油的提取率隨電熱套溫度的增加而升高，當(dāng)電熱套溫度高于260℃后提取率有一定程度的下降。

圖1 各因素對香薷揮發(fā)油提取率的影響Fig. 1 Effects of each factor on the extraction yield of Moslae Herba volatile oil

2.3 Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選對香薷揮發(fā)油提取率影響較為顯著的因素

2.3.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果 參考單因素試驗(yàn)結(jié)果，以香薷揮發(fā)油提取率為指標(biāo)，浸泡時間（A）、超聲時間（B）、氯化鈉濃度（C）、液料比（D）、提取時間（E）、電熱套溫度（F）為考察因素，每個因素取兩個水平（-1，1）。按Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)隨機(jī)生成12個試驗(yàn)組合，根據(jù)試驗(yàn)組合按照“2.1”項(xiàng)下方法提取香薷揮發(fā)油，計(jì)算香薷揮發(fā)油提取率，每個試驗(yàn)組合重復(fù)三次，取平均值，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表1。

表1 Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab. 1 Scheme and results of Plackett-Burman design

2.3.2 顯著性分析 采用Minatab 16.0 軟件對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行顯著性分析，選擇顯著性水平達(dá)到0.1 的因子作為重要因子，結(jié)果見圖2。由圖2 可看出，六個因素對香薷揮發(fā)油提取率的影響從大到小分別為電熱套溫度、超聲時間、液料比、提取時間、氯化鈉濃度、浸泡時間。其中，電熱套溫度、超聲時間和液料比是影響香薷揮發(fā)油提取率的顯著因素，其余因素對香薷揮發(fā)油提取率的影響不顯著，后續(xù)實(shí)驗(yàn)將固定浸泡時間為30 min，氯化鈉溶液濃度為1%，提取時間為4 h，進(jìn)一步優(yōu)化電熱套溫度、超聲時間和液料比的工藝參數(shù)。

圖2 各影響因素的Pareto 圖（Alpha = 0.1）Fig. 2 Pareto diagram of each factor（Alpha = 0.1）

2.4 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面分析法優(yōu)化香薷揮發(fā)油提取工藝參數(shù)

2.4.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果 依據(jù)Plackett-Burman 試驗(yàn)結(jié)果，選取電熱套溫度（A）、超聲時間（B）、液料比（C）為考察因素，每個因素取三個水平（-1，0，1），以香薷揮發(fā)油提取率（Y）為考察指標(biāo)，采用Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)隨機(jī)生成15 個試驗(yàn)組合，根據(jù)試驗(yàn)組合按照“2.1”方法提取香薷揮發(fā)油，計(jì)算香薷揮發(fā)油提取率，每個試驗(yàn)組合重復(fù)三次，取平均值，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表2 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab. 2 Scheme and results of Box-Behnken design

2.4.2 模型擬合與方差分析 利用Minitab 軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元線性回歸和二項(xiàng)式方程擬合，得香薷揮發(fā)油提取率與電熱套溫度、超聲時間、液料比三個因素的擬合方程，Y=-14.03 +0.108A+0.057B+0.15C- 2.22 ×10-4A2- 2.95 ×10-4B2- 6.5 ×10-3C2-8.05 ×10-5AB- 0.2 ×10-4AC- 1.5 ×10-3BC， 標(biāo)準(zhǔn)差為0.015，決定系數(shù)R2= 97.98%，調(diào)整決定系數(shù)R2= 94.36%，說明該模型能解釋絕大部分變異。由圖3 殘差診斷圖可知，殘差診斷圖正常，說明該模型與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合較好。表3 回歸方程的顯著性檢驗(yàn)結(jié)果提示，A、B、C、A2、B2、C2、BC的P＜0.05，說明電熱套溫度、超聲時間、液料比與香薷揮發(fā)油提取率不是簡單的線性關(guān)系，存在二次項(xiàng)效應(yīng)和交互效應(yīng)。由表4 回歸方程的方差分析結(jié)果可看出，回歸項(xiàng)P= 0.001 ＜0.05，該回歸方程模型顯著。失擬項(xiàng)P= 0.163 ＞0.05，說明該方程與實(shí)際試驗(yàn)具有較好的擬合性，可用來優(yōu)化香薷揮發(fā)油的提取工藝。

圖3 殘差診斷圖Fig. 3 Residual diagnosis diagram

表3 回歸方程的顯著性檢驗(yàn)Tab. 3 Significant test of regression model

表4 回歸方程的方差分析Tab. 4 Variance analysis of regression model

2.4.3 響應(yīng)面分析法優(yōu)化提取工藝參數(shù) 利用Minitab 軟件繪制三維曲面圖和等高線圖，對任意兩因素對香薷揮發(fā)油提取率影響的交互作用進(jìn)行分析，結(jié)果見圖4。

圖4 各因素交互作用對香薷揮發(fā)油提取率的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig. 4 Response surface and contour map of the effects of various factors interaction on the extraction yield of Moslae Herba volatile oil

由圖4 可看出，超聲時間和液料比的三維曲面圖陡峭程度最大，等值線圖呈明顯的橢圓形，具有顯著的交互作用。通過響應(yīng)優(yōu)化器得出提取工藝參數(shù)的最優(yōu)化值為電熱套溫度為245.1℃，超聲時間為29.70 min，液料比為12.87 g/mL，預(yù)測的香薷揮發(fā)油提取率為0.996%?？紤]到實(shí)際操作簡便性，將電熱套溫度調(diào)整為245℃，超聲時間調(diào)整為30 min，液料比調(diào)整為13 g/mL，按照所得到的最優(yōu)化條件進(jìn)行三次平行實(shí)驗(yàn)，得香薷揮發(fā)油提取率為0.989%、0.982%、0.992%，平均值為0.988%，RSD 為0.513%，實(shí)測值接近預(yù)測值，說明該提取工藝穩(wěn)定可行。

3 討論

中藥揮發(fā)油的提取過程受多種因素的影響，因素之間可能存在交叉作用，前人的研究經(jīng)驗(yàn)表明，液料比、浸泡時間和提取時間是影響香薷揮發(fā)油提取率的重要因素。有文獻(xiàn)研究表明，在提取時加入氯化鈉，氯化鈉的鹽析作用可降低揮發(fā)油在水中的溶解度，提高揮發(fā)油的提取率[12]。將藥材在提取前先用超聲波預(yù)處理，利用超聲波的機(jī)械效應(yīng)、空化效應(yīng)及熱效應(yīng)破碎植物細(xì)胞壁，可擴(kuò)大溶劑與藥材的接觸面積，提高揮發(fā)油的提取率[13]。鄭偉然等[14-15]研究發(fā)現(xiàn)，不同提取溫度影響藥液的沸騰情況，繼而影響揮發(fā)油的出油率。項(xiàng)目預(yù)實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)同一臺電熱套在不同的設(shè)定溫度下沸騰情況不同，所得到的香薷揮發(fā)油提取率存在差異，推測電熱套溫度可能通過影響蒸餾速度影響揮發(fā)油的提取率。基于此，本實(shí)驗(yàn)考察了可能影響揮發(fā)油提取過程的六個因素。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，超聲波輔助對于香薷揮發(fā)油的提取具有明顯的促進(jìn)作用，而氯化鈉的加入對于香薷揮發(fā)油的提取有一定的促進(jìn)作用，但與電熱套溫度、超聲時間和液料比相比，影響較小。

2020 年版 《中國藥典》 （四部）（2204）“揮發(fā)油測定方法”[11]通過讀取揮發(fā)油的體積來測定揮發(fā)油的含量，但揮發(fā)油提取器的精確度為0.1 mL，揮發(fā)油提取工藝參數(shù)的不同造成的揮發(fā)油體積的細(xì)微差異難以讀取。因此，本實(shí)驗(yàn)采用有機(jī)試劑萃取揮發(fā)油，再減壓蒸餾除去有機(jī)試劑，通過稱定揮發(fā)油質(zhì)量的方法來計(jì)算揮發(fā)油提取率。乙醚具有沸點(diǎn)低，極易揮發(fā)的優(yōu)點(diǎn)，可作為萃取溶劑，但因其易制毒和麻醉的特點(diǎn)，購買和使用受到限制，故本實(shí)驗(yàn)未采用乙醚作為萃取溶劑，而選擇沸點(diǎn)適中的正己烷作為萃取溶劑。

4 結(jié)論

本研究采用Plackett-Burman 設(shè)計(jì)篩選出香薷揮發(fā)油提取率的重要因素為電熱套溫度、超聲時間和液料比；采用Box-Behnken 設(shè)計(jì)聯(lián)合響應(yīng)面分析法優(yōu)化了提取工藝參數(shù)、并驗(yàn)證了提取工藝的可行性。然而該工藝是實(shí)驗(yàn)室優(yōu)化的結(jié)果，對于香薷揮發(fā)油工業(yè)大生產(chǎn)時如何進(jìn)行超聲輔助提取，如何通過設(shè)定溫度來控制藥液沸騰狀態(tài)還需結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際借助試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法進(jìn)一步探索。