Pristane誘導(dǎo)小鼠彌漫性肺泡出血模型的建立及評估*

孫宏梅，農(nóng)光民，陳 峋

（廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科，南寧 530021）

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythemato-sus，SLE）是一種涉及多器官系統(tǒng)和組織的多因素、異質(zhì)性自身免疫性疾病。彌漫性肺泡出血（diffuse alveolar hemorrhage，DAH）是SLE 的肺部嚴(yán)重并發(fā)癥[1]，常導(dǎo)致急性呼吸衰竭，以咯血、呼吸困難及快速進(jìn)展的貧血為臨床特點(diǎn)，胸部X 線或高分辨CT常提示雙側(cè)彌漫性肺泡浸潤[2]。在SLE 的病人中，DAH 發(fā)病率僅為0.6%～5.4%[3]，但死亡率可高達(dá)29.2%～61.9%[4]。DAH的診斷依賴于臨床表現(xiàn)結(jié)合實(shí)驗(yàn)室、放射學(xué)以及必要時的肺部病理檢查。支氣管鏡下肺泡灌洗時，同一病變部位連續(xù)3 次出現(xiàn)血性且逐漸加深的灌洗液支持DAH診斷。此外，在支氣管肺泡灌洗液中，含鐵血黃素細(xì)胞≥20%也可診斷DAH，并且含鐵血黃素細(xì)胞的多少與病情嚴(yán)重程度密切相關(guān)[5]。目前臨床上，DAH 的治療以糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑為主[6]，也有用利妥昔單抗[7]、血漿置換[8]、丙種球蛋白[9]、間充質(zhì)干細(xì)胞移植[10]、活化因子VII[11]、ECMO[12]治療的個案報(bào)道。然而，有文獻(xiàn)指出，現(xiàn)有的治療方式雖能緩解DAH 臨床癥狀，但副作用明顯且易復(fù)發(fā)[13-14]。此外，目前臨床上仍缺少關(guān)于DAH治療的隨機(jī)對照試驗(yàn)，且尚無統(tǒng)一治療方案。因此，DAH小鼠模型的建立及評估有利于通過動物實(shí)驗(yàn)為DAH 的治療打下理論基礎(chǔ)。目前小鼠DAH的診斷主要是以肺部病理檢查為主，這一定程度上限制了動態(tài)觀察小鼠肺出血的嚴(yán)重程度，同時也阻礙了動態(tài)評估藥物干預(yù)DAH 小鼠的療效。有研究表明，DAH 患者在急性期時肺部CT 多呈磨玻璃影改變，可根據(jù)磨玻璃影的密度來判斷肺出血的嚴(yán)重程度[15]；此外，在慢性發(fā)作期或復(fù)發(fā)期DAH患者的肺CT 多呈現(xiàn)支氣管或細(xì)支氣管擴(kuò)張、網(wǎng)狀或蜂窩狀改變[16]，因此高分辨CT在DAH的診斷、病程及肺出血程度的判斷中起重要作用[17]?；谝陨希P者希望通過Pristane 誘導(dǎo)建立小鼠DAH 模型并從臨床、影像以及病理學(xué)三方面對其肺出血的嚴(yán)重程度進(jìn)行綜合評估，為后續(xù)探討DAH的療效提供評價(jià)指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 由長沙天勤實(shí)驗(yàn)動物公司提供SPF 級雌性，8～10 周齡、體重（20±2）g 的C57BL/6J小鼠，動物實(shí)驗(yàn)許可證為SCXK（湘）2019-0014。飼養(yǎng)環(huán)境為溫度22～26 ℃，相對濕度40%～70%，SPF級動物實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行試驗(yàn)。小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和正常對照組，每組9 只。本研究經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)通過[倫理編號：2020（KY-E-048）]。

1.2 主要試劑及儀器 Pristane（大連美侖生物技術(shù)有限公司），PBS、普魯士藍(lán)染色試劑盒、蘇木精－伊紅（HE）染液（武漢谷歌生物科技有限公司），切片機(jī)（德國徠卡公司），光學(xué)顯微鏡（日本Olympus 公司），CoulterLH750 型自動血液學(xué)分析儀（美國貝克曼公司），小動物多排Mirco-CT 成像系統(tǒng)（Latheta LCT-200，日本Hitachi Aloka醫(yī)療公司）。

1.3 造模與分組 采用電腦隨機(jī)分配代碼的方法將小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和正常對照組，并分別予一次性腹腔注射0.5 mL 的Pristane[18]或等量PBS。每日監(jiān)測小鼠體重。

1.4 小鼠一般情況觀察 每日測量小鼠體質(zhì)量并記錄，同時觀察小鼠活動度、毛色、皮膚、呼吸等一般情況[19]。

1.5 血常規(guī)檢查 干預(yù)后第14 天通過小鼠眼球采血，血液與乙二胺四乙酸二鉀（EDTAK2）混合抗凝，用自動血液學(xué)分析儀檢測紅細(xì)胞（RBC）計(jì)數(shù)、血紅蛋白（Hb）濃度。

1.6 Micro-CT 檢查 分別于第0、第7、第14、第21天對小鼠進(jìn)行Micro-CT檢查，動態(tài)觀察小鼠肺部影像學(xué)情況。

1.7 肺組織病理學(xué)觀察 藥物干預(yù)后第14 天處死小鼠。打開胸腔，分離出兩肺，對比兩組小鼠肺組織大體病理改變。隨后將小鼠肺組織經(jīng)4%多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋，脫蠟水洗后分別進(jìn)行蘇木精—伊紅（HE）染色及普魯士藍(lán)染色，鏡下對比觀察其病理學(xué)改變。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般情況比較 經(jīng)Pristane腹腔注射的小鼠逐漸出現(xiàn)毛色無光澤、消瘦、貧血（足底蒼白無血色）等征象（圖1），同時伴有呼吸急促、行動緩慢、弓背、顫抖等癥狀，而正常對照組小鼠無上述情況出現(xiàn)。

圖1 干預(yù)后正常對照組（A）和實(shí)驗(yàn)組（B）的一般情況比較

2.2 兩組體重變化比較 藥物干預(yù)前兩組小鼠體重比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），干預(yù)第7 天兩組小鼠體重比較，差異仍無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。但干預(yù)后第14 天正常對照組體重上升而實(shí)驗(yàn)組體重明顯下降（P＜0.05），見圖2。除此之外，實(shí)驗(yàn)組第14 天時體重較第7 天時下降（3.57±1.13）g，下降幅度約17.62%，而較干預(yù)前體重下降（2.74±1.57）g，下降幅度約14.10%。

圖2 干預(yù)后小鼠體重變化趨勢

2.3 兩組血常規(guī)比較 與正常對照組比較，實(shí)驗(yàn)組RBC 計(jì)數(shù)均值下降4.27×1012/L，Hb 濃度均值下降58.17 g/L，實(shí)驗(yàn)組Hb 濃度及RBC 計(jì)數(shù)明顯低于正常對照組（均P＜0.001），見圖3。

圖3 干預(yù)后小鼠的Hb（A）和RBC（B）水平比較

2.4 兩組影像學(xué)表現(xiàn)比較 與正常對照組比較，實(shí)驗(yàn)組小鼠肺部CT在第14 天、21 天可觀察到雙肺透光性降低，多個肺葉呈斑片狀密度增高影和毛玻璃樣陰影，邊界模糊，見圖4。

圖4 干預(yù)后不同時間段正常對照組和實(shí)驗(yàn)組小鼠的肺部CT影像學(xué)表現(xiàn)

2.5 兩組病理學(xué)表現(xiàn)比較 肺組織大體病理觀察：根據(jù)肺出血面積將肺大體病理分為無出血（0%）、部分出血（25%～75%）和完全出血（75%～100%）[13,20-21]。PBS 干預(yù)后的正常對照組，在各階段肺組織始終呈淡紅色，未見出血及組織腫脹（無出血）。而Pristane干預(yù)后的實(shí)驗(yàn)組，在第7天即可見肺組織顏色暗紅，部分肺葉散在分布的點(diǎn)狀出血灶（部分出血），肺組織腫脹不明顯。在第14 天則可見實(shí)驗(yàn)組肺組織顏色進(jìn)一步加深，各肺葉呈大片狀出血或彌漫性出血（完全出血），肺組織明顯腫脹，見圖5。

圖5 兩組小鼠肺組織病理學(xué)表現(xiàn)染色結(jié)果

HE染色下，PBS干預(yù)的正常對照組在各階段均可見肺組織結(jié)構(gòu)完好，肺泡腔內(nèi)無出血，肺泡壁無增厚。而Pristane 干預(yù)的實(shí)驗(yàn)組在第7 天即可見到肺組織部分結(jié)構(gòu)消失，肺泡壁可見巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤，肺泡腔內(nèi)少許紅細(xì)胞；在第14天實(shí)驗(yàn)組則可見肺組織結(jié)構(gòu)紊亂，炎癥細(xì)胞浸潤明顯，肺泡腔內(nèi)可見大量紅細(xì)胞，肺泡壁及毛細(xì)血管壁增厚，見圖6。

圖6 兩組小鼠肺組織HE染色結(jié)果（×400）

普魯士藍(lán)染色下，正常對照組小鼠肺組織在各階段始終呈陰性反應(yīng)。而實(shí)驗(yàn)組在第7天可見部分肺組織的肺泡腔及間隔內(nèi)少許呈陽性反應(yīng)的肺含鐵血黃素細(xì)胞，在第14天實(shí)驗(yàn)組則可見大量肺含鐵血黃素細(xì)胞分布于肺泡腔和間隔內(nèi)，見圖7。

圖7 兩組小鼠肺組織普魯士藍(lán)染色結(jié)果（×400）

3 討論

目前國內(nèi)外對于SLE-DAH 的臨床研究多限于個案報(bào)道和小樣本的隊(duì)列研究[22-24]，且尚無統(tǒng)一的治療方案[6]。臨床研究表明，DAH 作為SLE 致命性并發(fā)癥，多發(fā)生在SLE病程的早期，且可獨(dú)立導(dǎo)致SLE總體存活率的降低[24]。在本研究中發(fā)現(xiàn)Pristane 誘導(dǎo)小鼠第14 天時DAH 發(fā)病率約為51.06%，死亡率約為7.14%。因此，早期診斷DAH及急性期的有效治療對改善SLE 患者的預(yù)后及生存質(zhì)量至關(guān)重要[25]。

Pristane是一種飽和萜類烷烴，常用于誘發(fā)嚙齒動物關(guān)節(jié)炎[26]和狼瘡[27-28]，其經(jīng)腹腔注射后可誘導(dǎo)小鼠出現(xiàn)與人類SLE 相關(guān)性DAH 相似的免疫病理學(xué)特征[29-30]。值得注意的是小鼠通常在腹腔注射Pristane后4～6個月才出現(xiàn)與狼瘡性腎炎類似的腎臟病變，相關(guān)特異性自身抗體則在7 個月以后出現(xiàn)[31]。而DAH 通常出現(xiàn)在病程早期，Pristane 腹腔注射后14 d 內(nèi)即可觀察到嚴(yán)重的肺出血[32-33]。這與人類SLE-DAH 的起病先后順序一定程度上是相符的[24]。因此，將其作為研究人類SLE-DAH發(fā)病機(jī)制的動物模型是可行的。本研究用Pristane 干預(yù)小鼠后第14 天，實(shí)驗(yàn)組小鼠肺切片HE 染色鏡下可觀察到各肺葉彌漫性出血、肺組織結(jié)構(gòu)破壞及炎癥細(xì)胞浸潤等病理學(xué)表現(xiàn)。同時，實(shí)驗(yàn)組小鼠肺組織普魯士藍(lán)染色可觀察到大量巨噬細(xì)胞吞噬滲出紅細(xì)胞后形成的含鐵血黃素細(xì)胞。HE染色及普魯士藍(lán)染色的結(jié)果與人類DAH的病理特征是相似的[34]，這也提示了腹腔注射Pristane可成功誘導(dǎo)建立小鼠DAH模型并具有類似的DAH病理學(xué)改變。此外，通過對比第7 天時實(shí)驗(yàn)組的HE 染色與普魯士藍(lán)染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雖然常規(guī)HE 染色可用于大多數(shù)肺出血的診斷，但在早期肺泡出血不明顯時，普魯士藍(lán)染色或許能更加直觀地通過提示含鐵血黃素的存在來證實(shí)肺出血，并可評估其出血性質(zhì)[34]。

本研究觀察到實(shí)驗(yàn)組小鼠出現(xiàn)足底蒼白無血色、行動遲緩、呼吸急促、體重下降等行為學(xué)改變，這與Chowdhary等[35]的研究結(jié)果不一致。這可能與不同的觀察時間點(diǎn)有關(guān)。在本研究中，實(shí)驗(yàn)組小鼠行為學(xué)改變通常出現(xiàn)在Pristane腹腔注射第7天后，猜測可能與DAH 的嚴(yán)重程度有關(guān)。小鼠體重變化上，藥物干預(yù)第7 天時兩組體重并無明顯差別，第7 天以后正常對照組體重繼續(xù)上升，而實(shí)驗(yàn)組體重急劇下降（P＜0.05）。原因可能是因?yàn)镈AH 在第7天后迅速進(jìn)展并嚴(yán)重影響小鼠機(jī)體功能。小鼠體重監(jiān)測方便且靈敏，可綜合反映小鼠機(jī)體功能情況，有研究用最大體重下降的小鼠數(shù)量占比作為評估rh-DNase-1 治療小鼠DAH 療效的指標(biāo)[33]。本實(shí)驗(yàn)觀察到，實(shí)驗(yàn)組第14 天時體重較第7 天時下降（3.57±1.13）g，下降幅度約17.62%，較干預(yù)前體重下降（2.74±1.57）g，下降幅度約14.10%，這與小鼠肺部CT 及肺組織病理切片提示的肺出血進(jìn)展時間基本符合，表明通過對比造模及藥物干預(yù)前后小鼠體重變化的絕對值及百分比或許在一定程度上能間接地反應(yīng)藥物療效及出血程度。

在未完善支氣管鏡下肺泡灌洗及肺活檢的患者中，明確DAH的診斷十分困難，而CT作為非侵入性診斷的檢查方法，可結(jié)合貧血、咯血、呼吸困難等臨床特征早期診斷DAH[36]，并可根據(jù)CT 的不同影像學(xué)表現(xiàn)判斷患者處于DAH的急性期、慢性發(fā)作期還是緩解期[16]。然而，既往并無文獻(xiàn)資料報(bào)道關(guān)于DAH 小鼠血液學(xué)檢查和肺部影像學(xué)情況。本研究發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組小鼠RBC 計(jì)數(shù)均值下降4.27×1012/L，Hb濃度均值下降58.17 g/L，分析這是小鼠急性肺出血后所致失血性貧血，這與人類DAH急性期的貧血表現(xiàn)是一致的[6]。此外，實(shí)驗(yàn)組小鼠肺部CT 從第7天的輕度磨玻璃影逐漸加重，至第14～21天時呈雙肺彌漫性浸潤影，這也與人類DAH的影像學(xué)特征類似[6,14]。小動物多排Mirco-CT 檢查靈敏度高，可重復(fù)性強(qiáng)，且為無創(chuàng)，有助于連續(xù)評估小鼠DAH 的病情進(jìn)展及嚴(yán)重程度。這可為后續(xù)進(jìn)一步研究小鼠DAH的藥物治療效果評價(jià)奠定基礎(chǔ)。

目前已有研究通過對比各組小鼠DAH發(fā)病率、死亡率以及病理切片的出血面積[20,21,33]來進(jìn)行療效評估。但經(jīng)腹腔注射Pristane 可廣泛分布于小鼠體內(nèi)，其細(xì)胞毒性亦可直接導(dǎo)致小鼠的死亡，這使得我們無法判斷小鼠的死亡原因究竟是因?yàn)镈AH 還是Pristane 的毒性所導(dǎo)致[33]?；蛟S也可以通過動態(tài)監(jiān)測小鼠行為學(xué)改變及肺部CT 來序貫評估小鼠DAH的程度，從而避免直接肺活檢對實(shí)驗(yàn)動物的致死性。

綜上，本研究證實(shí)了Pristane 誘導(dǎo)小鼠DAH 模型無論從臨床癥狀、影像學(xué)、以及病理學(xué)方面均與人類DAH 具有相似性。綜合動態(tài)觀察小鼠行為學(xué)表現(xiàn)和肺部CT檢查可實(shí)現(xiàn)對小鼠DAH的輔助診斷以及嚴(yán)重程度判斷。