蔓菁游離小孢子培養(yǎng)體系的優(yōu)化*

張 潔，柯筱純，劉園園，王春濤，楊永平

（1.中國科學(xué)院 昆明植物研究所，中國西南野生生物種質(zhì)資源庫，云南 昆明 650201；2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049）

蔓菁（Brassica rapavar.rapa）是十字 花科（Cruciferae）蕓苔屬（Brassica）二年生草本植物，是青藏高原及周邊高海拔地區(qū)傳統(tǒng)種植的農(nóng)作物，主要食用部位是膨大的肉質(zhì)根，具有食用和藥用價值[1-3]。目前，蔓菁栽培主要以農(nóng)家自留品種為主，品種較為混雜且性狀不穩(wěn)定，極大地限制了蔓菁產(chǎn)品的開發(fā)[4]。因此，獲得遺傳性狀穩(wěn)定的蔓菁純合品系是蔓菁新品種選育的必要條件。通過連續(xù)自花授粉獲得遺傳性狀穩(wěn)定的品種是傳統(tǒng)育種的重要方法，但蔓菁自交不親和的特性限制了自花授粉，因此其品種純化需要探索其他方法。

目前，小孢子培養(yǎng)已成為作物育種的重要手段之一。通過小孢子培養(yǎng)獲得純合的二倍體植株，一方面能縮短作物育種周期，另一方面還可以分離出植物自身的隱性性狀，進而豐富作物育種資源[5]。游離小孢子培養(yǎng)受許多因素的影響[6]，其中物種的基因型和小孢子的發(fā)育階段是培育小孢子胚狀體的決定性因素[7]。在白菜型油菜和甘藍的游離小孢子培養(yǎng)中，選擇單核靠邊期到雙核早期的小孢子更容易產(chǎn)生胚狀體[8-9]。由于小孢子胚狀體的誘導(dǎo)能力受基因調(diào)控，不同物種甚至同一物種的不同基因型出胚率也存在差異[10-12]。

在小孢子培養(yǎng)中，激素、活性炭和瓊脂糖的配比及濃度會影響小孢子的產(chǎn)胚率[13-16]。這些培養(yǎng)條件與植物種類密切相關(guān)，不同植物的小孢子培養(yǎng)需要經(jīng)過試驗探索才能得出最佳條件。目前，蔓菁游離小孢子培養(yǎng)多以新疆蔓菁為試材[17-18]，為全面了解不同品種蔓菁小孢子的培養(yǎng)體系差異，本研究以多個蔓菁地方品種為研究對象，優(yōu)化其游離小孢子的培養(yǎng)體系并比較不同地方品種出胚率的差異，為蔓菁的品種選育、創(chuàng)制和遺傳改良提供純合的二倍體株系。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料來自于實驗室收集的54 個蔓菁地方品種（表1）。傳統(tǒng)種植的蔓菁經(jīng)過持續(xù)種植和多次繁殖后，地方品種已經(jīng)對當?shù)丨h(huán)境形成獨特的適應(yīng)性，可以認為傳統(tǒng)種植的地方品種具有獨特的基因型。因此，在收集地方品種前，對蔓菁地方品種來源開展詳細咨詢，收集的品種僅包括傳統(tǒng)種植的地方品種種子，不包括商業(yè)化的種子。將54 個地方品種的種子在4 ℃環(huán)境中放置30 d 進行春化，然后將種子播種于裝有腐殖土的花盆中，植株進入盛花期后選取花蕾進行試驗。

1.2 游離小孢子的分離純化

蔓菁抽薹開花后，取下植株主枝和一級側(cè)枝的花序軸放在4 ℃冰箱中進行24 h 低溫預(yù)處理。通過鏡檢測定蔓菁小孢子處于單核靠邊期時的花蕾長度，然后選擇單核靠邊期的蔓菁花蕾，30 個為1 組放入50 mL 離心管中。在離心管中加入75% 乙醇溶液浸泡30 s，去掉乙醇后再加入2%次氯酸鈉溶液浸泡15 min，以對花蕾表面進行殺菌；去掉次氯酸鈉溶液后用無菌水洗滌3 次，每次5 min；加入少量B5培養(yǎng)液（13%蔗糖，pH 5.8）后用無菌玻璃棒碾碎花蕾。破碎的花蕾組織混合液用雙層300 目無菌尼龍網(wǎng)過濾后放于10 mL無菌離心管中，離心3 min（1 000 r/min）后去除上清液，得到純凈小孢子。

1.3 不同基因型蔓菁品種小孢子出胚培養(yǎng)

54 個蔓菁品種的小孢子出胚培養(yǎng)主要參照王春麗[19]的方法。用1/2 NLN-13 培養(yǎng)液將小孢子的密度調(diào)至約1×105個/mL，然后將3 mL 小孢子懸浮液分裝于直徑為60 mm 的培養(yǎng)皿中；用封口膜封口后放入33 ℃恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)24 h，統(tǒng)計各品種小孢子在高溫?zé)峒?4 h 后是否發(fā)生細胞膨脹；然后轉(zhuǎn)移到25 ℃的培養(yǎng)室中繼續(xù)暗培養(yǎng)，25 d 后統(tǒng)計小孢子出胚數(shù)。選擇1 個出胚率最高的蔓菁品種通過調(diào)整活性炭—瓊脂糖配比及植物激素配比優(yōu)化蔓菁小孢子培養(yǎng)條件。

1.4 不同質(zhì)量濃度配比的瓊脂糖與活性炭處理

將候選蔓菁品種的小孢子轉(zhuǎn)至含不同瓊脂糖（250 和500 mg/L）和活性炭（10、15 和25 mg/L）配比的1/2 NLN-13 培養(yǎng)基中進行試驗，以不添加瓊脂糖和活性炭的處理為對照，25 d 后統(tǒng)計小孢子出胚數(shù)。

1.5 不同質(zhì)量濃度植物生長激素處理

在1/2 NLN-13 培養(yǎng)基中加入不同質(zhì)量濃度的NAA（0.05、0.10 和0.20 mg/L）和6-BA（0.05、0.10 和0.20 mg/L）對候選蔓菁品種進行游離小孢子培養(yǎng)，以不添加NAA 和6-BA 的處理為對照，25 d 后統(tǒng)計小孢子出胚數(shù)。

1.6 小孢子再生培養(yǎng)

小孢子再生培養(yǎng)主要參考柯筱純[20]的方法。將小孢子胚狀體轉(zhuǎn)移到1/2 MS 固體培養(yǎng)基（MS+1%瓊脂+120 mg/L 活性炭+4%蔗糖）上誘導(dǎo)成苗；成苗后將其移到生根培養(yǎng)基（1/2 MS+0.8%瓊脂+1%蔗糖）上培養(yǎng)20～30 d；將生根后的小苗移到盛有腐殖土的花盆中繼續(xù)生長。

1.7 小孢子植株倍性及表型鑒定

采用流式細胞術(shù)進行蔓菁小孢子再生植株的倍性鑒定，確定二倍體植株的比例。取0.5 g 小孢子再生植株材料放置在培養(yǎng)皿中，用刀片快速切碎后加WPB 裂解液2 mL 裂解細胞，游離出細胞核，使用濾網(wǎng)過濾后獲取細胞核懸液作為待測樣品。利用同樣的方法提取基因組大小已經(jīng)明確的大豆（Glycine max，威廉姆斯品種）葉片細胞核懸浮液作為標準樣品。取適量待測樣品和標準樣品的細胞核懸液混勻作為1 組，在混合細胞核懸液中加入PI 染料150 μL，置于暗處染色30 min。使用流式細胞儀（CyFlow Space-3000）檢測樣品倍性，采用488 nm 的藍光激發(fā)，在計算機上用流式細胞儀自帶的軟件觀察熒光強度，每組樣品收集5 000～10 000 個顆粒，熒光信號的強度代表其核內(nèi)物質(zhì)濃度，試驗數(shù)據(jù)CV 值需小于5%。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因型對小孢子胚誘導(dǎo)的影響

對54 個蔓菁品種的花蕾進行小孢子培養(yǎng)，有41 個品種的小孢子在33 ℃熱激處理24 h 之后開始膨大，膨大比例為75.92 %。繼續(xù)誘導(dǎo)小孢子成胚發(fā)現(xiàn)：能發(fā)生小孢子膨大的11 個品種均能誘導(dǎo)出小孢子胚狀體，占總品種數(shù)的20.37%。KTRG-B-15 和KTRG-B-102 蔓菁品種的出胚率最高，均為25 胚/30 蕾（表1）。說明因品種不同引起的基因型差異是誘導(dǎo)蔓菁小孢子成胚的重要因素，選擇出胚率高的蔓菁品種進行試驗更易獲得小孢子胚狀體。由于實驗室收集的KTRG-B-102 蔓菁品種的種子較少，所以將KTRG-B-15 蔓菁品種作為后續(xù)分析的試驗材料。

表1 不同產(chǎn)地的蔓菁地方品種及其對小孢子胚誘導(dǎo)的影響Tab.1 Different origins of turnip varieties and their effect on the microspore embryo induction.

2.2 活性炭與瓊脂糖對小孢子胚誘導(dǎo)的影響

由表2 可知：培養(yǎng)基中添加活性炭與瓊脂糖質(zhì)量濃度分別為10 和250 mg/L 為最佳組合，誘導(dǎo)KTRG-B-15 蔓菁品種出胚數(shù)為38 胚/30 蕾；不添加瓊脂糖和活性炭的1/2 NLN-13 培養(yǎng)基誘導(dǎo)小孢子的出胚數(shù)為33 胚/30 蕾；而最高質(zhì)量濃度的瓊脂糖和活性炭處理后小孢子的出胚數(shù)明顯減少。

表2 不同質(zhì)量濃度活性炭和瓊脂糖組合下每30 蕾蔓菁小孢子的出胚數(shù)Tab.2 Embryos number of microspore embryogenesis per 30 buds of turnip under different mass concentration compositions of activated carbon and agarose

2.3 植物生長激素對小孢子胚誘導(dǎo)的影響

由表3 可知：不同激素配比會影響蔓菁小孢子出胚率。0.10 mg/L NAA 和0.20 mg/L 6-BA 組合下，KTRG-B-15 蔓菁小孢子出胚數(shù)量最多，為137 胚/30 蕾。

表3 不同質(zhì)量濃度NAA 和6-BA 組合下每30 蕾蔓菁小孢子的出胚數(shù)Tab.3 Embryos number of microspore embryogenesis per 30 buds of turnip under different mass concentration compositions of NAA and 6-BA

2.4 小孢子再生植株倍性鑒定及表型差異分析

將KTRG-B15 蔓菁小孢子胚狀體繼續(xù)培養(yǎng)，獲得44 株再生植株。其中4 株被鑒定為單倍體植株，占比為9.09%；38 株被鑒定為二倍體植株，占比為86.40%；2 株被鑒定為嵌合體植株，占比為4.54 %。表明小孢子胚在發(fā)育過程中存在自然加倍現(xiàn)象，且二倍體植株的比例較高。

3 討論

小孢子培養(yǎng)技術(shù)在育種上有著廣泛的運用。吳江生等[21]通過建立甘藍型油菜小孢子培養(yǎng)技術(shù)，配合染色體加倍、試管苗繼代越夏和田間移栽配套技術(shù)，成功培育出優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的品種華雙3 號，推廣種植面積超過133 萬hm2。北京市蔬菜研究中心利用小孢子培養(yǎng)技術(shù)進行親本選育，獲得抗除草劑和抗黑斑病植株[22]。蕓苔屬小孢子培養(yǎng)研究最早始于1982 年，LICHTER[23]利用游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)成功培育出第1 株甘藍型油菜小孢子植株；20 世紀末，國內(nèi)外學(xué)者在多個品種上嘗試建立小孢子培養(yǎng)體系，并著重研究影響小孢子成胚的因素。軒正英等[12]以8 個新疆蔓菁品種為材料進行小孢子培養(yǎng)研究，最終獲得73 胚/30蕾的成胚效率，為蔓菁品種選育提供重要基礎(chǔ)。

物種遺傳背景是小孢子胚胎發(fā)生的決定因素，同一物種不同品種間小孢子的成胚比例明顯不同。軒正英等[12]對新疆蔓菁品種的研究發(fā)現(xiàn)：8 個蔓菁品種只有4 個能誘導(dǎo)出胚；汪維紅等[24]用7 個品種的黃心烏白菜進行小孢子游離培養(yǎng)，但僅有3 個品種出胚；耿建峰等[25]用54 個白菜品種進行試驗，結(jié)果表明小孢子胚誘導(dǎo)數(shù)差別極大。本研究用54 個蔓菁地方品種（基因型）進行游離小孢子培養(yǎng)，有11 個品種能誘導(dǎo)出胚狀體，且出胚數(shù)量存在差異。國內(nèi)種植的蔓菁多以地方品種為主，這些地方品種在不同的自然和人工選擇壓力下可能已經(jīng)形成不同的遺傳特征，可能會進一步影響其小孢子出胚能力，其具體機制還需進一步研究。

添加活性炭和瓊脂糖對不同物種小孢子的成胚過程影響不同。有研究認為：活性炭能夠促進小孢子胚狀體誘導(dǎo)，在培養(yǎng)基中加入適宜的活性炭可以吸附有害物質(zhì)，從而促進小孢子胚的產(chǎn)生[26]。也有研究顯示：高含量的活性炭對植物小孢子胚誘導(dǎo)存在抑制作用。徐艷輝等[27]發(fā)現(xiàn)活性炭質(zhì)量濃度為0.02 mg/mL 時，3 個基因型大白菜產(chǎn)胚量最多；而當活性炭質(zhì)量濃度超過0.04 mg/mL，對小孢子產(chǎn)生起抑制作用。在蔓菁小孢子成胚過程中，添加活性炭和瓊脂糖對小孢子胚狀體誘導(dǎo)沒有明顯差異。這一現(xiàn)象與KELLER[28]的研究結(jié)果一致，加入活性炭和瓊脂糖并不能提高小孢子的出胚率，甚至高質(zhì)量濃度的活性炭或瓊脂糖會使小孢子胚狀體數(shù)量減少。

生長素和細胞分裂素能調(diào)節(jié)植物的生長和發(fā)育，在培養(yǎng)基中加入少量不同配比的生長素和細胞分裂素可顯著增加小孢子胚狀體數(shù)量[14,29]。楊易等[30]研究發(fā)現(xiàn)：添加0.1 mg/L 6-BA 和0.1 mg/L NAA 后，菜心小孢子的出胚率最高。不同品種的NAA 和6-BA 最適質(zhì)量濃度配比不同，這可能是受品種制約。因此，需根據(jù)不同品種的特性調(diào)整激素配比以促進誘導(dǎo)小孢子胚狀體。蔓菁KTRG-B15 品種受6-BA 和NAA 質(zhì)量濃度影響較大，適量添加6-BA 和NAA 可以提高該品種的成胚效率（137 胚/30 蕾），且高于新疆蔓菁品種誘導(dǎo)小孢子胚狀體數(shù)量[12]。

目前，可以通過DNA 流式細胞儀倍性鑒定和花粉母細胞染色體計數(shù)等方法鑒定小孢子再生植株的倍性[31-33]。本研究發(fā)現(xiàn)：單倍體、二倍體和嵌合體同時存在，證明游離小孢子培養(yǎng)過程中有染色體發(fā)生自然加倍。盛鵬[32]對6 個大白菜品種的小孢子自交后代抽薹性進行評價，結(jié)果表明有2 個群體為極晚抽薹。本研究從38 株二倍體植株中發(fā)現(xiàn)1 株早花的再生植株（約4 個月進入生殖生長，其余再生植株處于營養(yǎng)生長狀態(tài)），為后期蔓菁耐抽薹品系的研究提供了良好的遺傳材料。

4 結(jié)論

KTRG-B-15 蔓菁品種單核靠邊期的花蕾4 ℃預(yù)處理24 h，游離小孢子于添加0.10 mg/L NAA 和0.20 mg/L 6-BA 的1/2 NLN-13 液體培養(yǎng)基中33 ℃熱激處理24 h，25 ℃暗培養(yǎng)，其出胚率最優(yōu)（137 胚/30 蕾）。優(yōu)化后的出胚率是優(yōu)化前的5.48 倍。