吲哚乙酸和谷氨酸N,N-二乙酸對Cd-Pb 復合污染土壤上龍葵生長及重金屬吸收的影響*

羅 洋，王正霞，向仰州,3，任 軍，羅光杰,3，劉 方

（1.貴州師范學院 地理與資源學院，貴州 貴陽 550018；2.貴州大學 資源與環(huán)境工程學院，貴州 貴陽 550025；3.貴州師范學院，貴州省流域地理國情監(jiān)測重點實驗室，貴州 貴陽 550018）

土壤重金屬污染可影響食品安全、耕地資源、生態(tài)環(huán)境和經(jīng)濟發(fā)展等多個方面，是當前社會關(guān)注的熱點問題[1]。鎘和鉛等重金屬在環(huán)境中可長期蓄積難以清除，污染形勢日漸嚴峻，污染范圍逐漸擴大。當重金屬積累到一定程度后，不僅會影響農(nóng)產(chǎn)品的產(chǎn)量和品質(zhì)，還會對人類賴以生存的生態(tài)環(huán)境構(gòu)成巨大威脅。對土壤而言，重金屬污染具有停滯性、積蓄性、隱蔽性和不可逆性，且能夠通過食物鏈富集，嚴重危及人體健康[2]。因此，開展土壤重金屬污染修復技術(shù)的研究對社會發(fā)展和人類健康具有重要意義。

植物修復技術(shù)是利用植物自身的特性，通過對重金屬的吸收、揮發(fā)和固定等過程，促進污染物的去除或毒性降低[3]。目前，在土壤重金屬污染植物修復技術(shù)中，應用最為廣泛的是利用超積累植物從土壤中提取重金屬元素，再通過壓縮填埋、焚燒、熱解和氣化等對植物殘體進行統(tǒng)一處理[4-5]。其整個修復過程在原位進行，節(jié)約成本，具有良好的社會與環(huán)境效益。然而，在實際應用中，限制植物對重金屬提取效率的主要因素是植物的生物量和土壤重金屬的有效性。吲哚乙酸（indole-3-acetic acid，IAA）是第1 個被發(fā)現(xiàn)的植物生長激素，能調(diào)控植物生長發(fā)育、促進細胞分裂和伸長，具有提高植物生物量和緩解重金屬毒害的作用[6-7]。然而，也有研究證明：超積累植物生物量提高的過程中往往伴隨著重金屬含量降低，產(chǎn)生“稀釋效應”[8]。螯合劑可以促進重金屬無效態(tài)向有效態(tài)轉(zhuǎn)化，增加重金屬可溶性，進而提高植物對重金屬的富集和提取效率，常被用于強化土壤重金屬污染的植物修復研究。當前，谷氨 酸N,N-二 乙 酸（L-glutamic acid N,N-diacetic acid，GLDA）以其綠色環(huán)保性和生物可降解性等優(yōu)點被廣泛應用于眾多領(lǐng)域[9-10]。有研究表明：GLDA 對土壤重金屬的螯合作用和乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）基本一致，但GLDA 的生物可降解性更好，在應用螯合劑活化土壤重金屬方面具有很大的發(fā)展?jié)摿11]。但也有研究顯示：施用GLDA 有可能會對植物的韌皮部和凱氏帶產(chǎn)生毒害作用[12]，限制其生長，進而影響修復效果。鑒于IAA 和GLDA 在誘導植物修復中各有優(yōu)勢和劣勢，有學者嘗試將兩者聯(lián)合施用探討其對植物修復的強化效果[13]。

龍葵（Solanum nigrumL.）是茄科一年生草本植物，其重金屬耐受力和重金屬富集效果突出，且繁殖能力強、生長迅速，被廣泛應用于植物修復土壤重金屬污染領(lǐng)域[14]。目前用于誘導龍葵修復重金屬污染的螯合劑以EDTA 和乙二胺二琥珀酸（ethylenediamine disuccinate，EDDS）居多，選用GLDA 的較少，且缺乏與植物激素聯(lián)合施用效應的探討。因此，本研究采用盆栽試驗，通過對龍葵生物量、葉片生理指標、地上部Cd 和Pb 含量以及土壤有效態(tài)Cd 和Pb 含量的測定，探討IAA 和GLDA 單獨及聯(lián)合施用對土壤中Cd 和Pb 的影響，以期為重金屬污染土壤的修復提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試土壤：取自貴州省貴陽市烏當區(qū)高雁垃圾填埋場周圍，土壤類型為石灰土。自然風干挑出雜物后過2 mm 篩備用。土壤樣品基本理化性質(zhì)為：pH 7.84，有機質(zhì)含量12.86 g/kg，堿解氮含量84.00 mg/kg，有效磷含量57.38 mg/kg，速效鉀含量229.23 mg/kg，有效態(tài)Cd 含量3.2 mg/kg，有效態(tài)Pb 含量531.85 mg/kg。

供試植物：龍葵種子，購于壽光市沃田農(nóng)業(yè)科技有限公司。

供試生長素IAA 購于河南神雨生物有限公司；供試螯合劑GLDA 購于浙江三度化學有限公司。

1.2 試驗設(shè)計

試驗于2020 年5—9 月在貴州師范學院溫室大棚進行。共4 個處理，分別為：（1）IAA，施用3 mmol/kg IAA；（2）GLDA，施用10 μmol/kg GLDA；（3）IAA+GLDA，施用3 mmol/kg IAA 和10 μmol/kg GLDA；（4）CK（對照），施用等量蒸餾水。各個處理分別設(shè)置4 個重復，每盆裝土3 kg。龍葵種子經(jīng)75% 酒精浸泡30 s 殺菌處理后，用蒸餾水清洗干凈，選取顆粒飽滿的龍葵種子播種于育苗缽中，置于室溫培養(yǎng)，待長出4 片真葉后移栽2 株長勢一致的幼苗于花盆中培養(yǎng)。龍葵生長期間均澆灌去離子水，根據(jù)天氣情況把握澆水頻率，保持土壤持水量約為最大含水量的60%，移栽3 個月后收獲。IAA 溶液以葉面噴施形式每盆添加10 mL（移栽后第21、28、35 和42 天噴施）；GLDA 溶液在收獲前10 d 以滴灌形式滴入龍葵根部，用量為100 mL。收獲時龍葵分為地上部和地下部，先用自來水和去離子水清洗干凈，晾干后稱鮮質(zhì)量；在105 ℃烘箱中殺青30 min，然后再調(diào)整烘箱溫度為70 ℃，待其烘干至恒質(zhì)量后取出用研缽磨碎裝袋備用。

1.3 測定項目與方法

龍葵株高用卷尺測量，鮮質(zhì)量用萬分之一天平稱量。龍葵葉片葉綠素采用95%乙醇提取，分別于470（類胡蘿卜素）、649（葉綠素b）和665 nm（葉綠素a）處測定吸光度并計算其含量；丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸顯色法測定[15]；超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）活性分別采用氮藍四唑比色法、愈創(chuàng)木酚和雙氧水法測定[16-17]。

龍葵地上部Cd 和Pb 含量的測定：首先，采用HNO3—H2O2消解體系（體積比為5∶2）按120 ℃加熱20 min、160 ℃加熱20 min 和190 ℃加熱40 min 的程序消解，直到液體透明澄清；其次，將消解管置于趕酸儀中，在140 ℃條件下趕酸2.5 h，用1% HNO3將消解液轉(zhuǎn)移至25 mL 容量瓶中并定容；最后用火焰原子吸收光譜儀測定并計算龍葵地上部Cd 和Pb 提取量。龍葵地上部Cd（或Pb）提取量=龍葵地上部干質(zhì)量×龍葵地上部Cd（或Pb）含量。

土壤有效態(tài)Cd 和Pb 含量采用0.1 mol/L HCl浸提，火焰原子吸收光譜儀測定，測定過程通過添加標準物質(zhì)（GSV 系列）、設(shè)置空白和重復樣等方式進行質(zhì)量控制，所用試劑均為優(yōu)級純。

1.4 數(shù)據(jù)處理及分析

采用Microsoft Excel 2019 對試驗數(shù)據(jù)進行整理，用“平均值±標準差”表示；再用IBM SPSS Statistics 26.0 軟件進行相關(guān)分析和單因素方差分析，并采用LSD 法進行多重比較，差異顯著水平為5%。

2 結(jié)果與分析

2.1 IAA 和GLDA 對龍葵生長的影響

種植3 個月后，龍葵植株外形如圖1 所示，結(jié)合表1 可知：IAA 處理組龍葵的長勢最好，莖稈粗壯，葉片數(shù)量較其他處理多，且排列緊密，株高達60.33 cm；而GLDA 處理組的龍葵莖稈瘦小，葉片稀疏，株高僅為50.50 cm；IAA 與GLDA聯(lián)用后，龍葵植株較為勻稱，整體長勢在單施IAA 和單施GLDA 之間，株高為59.75 cm。方差分析結(jié)果顯示：IAA 處理組以及IAA+GLDA 處理組龍葵的株高相近，且與對照相比未達顯著水平（P＞0.05），但均顯著高于GLDA 處理組（P＜0.05）；與對照相比，IAA 處理組龍葵的地上部鮮質(zhì)量顯著增加12.87%（P＜0.05），GLDA 處理組則顯著降低16.15%（P＜0.05），兩者之間的差異也達顯著水平（P＜0.05），而IAA+GLDA 處理組的龍葵地上部鮮質(zhì)量與對照和IAA 處理組無顯著差異（P＞0.05），但顯著高于GLDA處理組（P＜0.05）。

表1 不同處理條件下龍葵的株高和地上部鮮質(zhì)量Tab.1 Plant height and shoot fresh weight of Solanum nigrum under different treatments

圖1 不同處理條件下的龍葵生長狀況Fig.1 Growth status of Solanum nigrum under different treatments

2.2 IAA 和GLDA 對龍葵生理指標的影響

由表2 可知：龍葵葉片的葉綠素a 含量為1.65～1.76 mg/g，葉綠素b 含量為0.65～0.77 mg/g，總?cè)~綠素含量為2.33～2.48 mg/g，且三者在各處理間差異均不顯著（P＞0.05）。與對照相比，單施IAA 和IAA+GLDA 聯(lián)用并未使龍葵葉片丙二醛含量發(fā)生明顯變化，而GLDA 處理組龍葵葉片丙二醛含量則顯著增加20.05%（P＜0.05），也顯著高于IAA 處理組和IAA+GLDA 處理組（P＜0.05）。此外，單施GLDA 還使龍葵葉片的SOD、POD 和CAT 活性較對照分別顯著降低11.15%、18.52%和14.22%（P＜0.05）；單施IAA 處理組的抗氧化酶與對照相比無顯著差異（P＞0.05）；兩者聯(lián)用后，龍葵葉片的SOD 和POD 活性與單施GLDA處理組差異不顯著（P＞0.05），但CAT 活性顯著增加13.14%（P＜0.05）。

表2 不同處理條件下龍葵葉片的生理指標Tab.2 Physiological indexes of S.nigrum leaves under different treatments

2.3 IAA 和GLDA 對龍葵地上部Cd 和Pb 吸收的影響

由表3 可知：IAA 處理組龍葵地上部Cd 含量與對照相比無顯著差異（P＞0.05），而GLDA 處理組和IAA+GLDA 處理組龍葵地上部Cd 含量均顯著增加，增幅分別為36.09% 和31.36%（P＜0.05）；龍葵地上部Pb 含量為30.47～38.68 mg/kg，且各處理間差異不顯著（P＞0.05）。各處理龍葵地上部Cd 提取量大小順序IAA+GLDA＞IAA＞GLDA＞CK（圖2），其中IAA、GLDA 以及IAA+GLDA 處理組分別較對照顯著提高15.05%、14.33%和36.98%（P＜0.05），單 施IAA 和 單施GLDA 龍葵地上部對Cd 的提取量相近，且均顯著低于兩者聯(lián)合施用處理組（P＜0.05）；龍葵地上部對Pb 的提取量為296.87～384.09 μg，但各處理間差異不顯著（P＞0.05）。

圖2 不同處理條件下龍葵地上部 Cd 和Pb 提取量Fig.2 Extraction amount of S.nigrum shoot under different treatments

表3 不同處理條件下龍葵地上部Cd 和Pb 含量Tab.3 Cd and Pb contents in shoot of S.nigrum under different treatments mg/kg

2.4 IAA 和GLDA對土壤有效Cd和Pb含量的影響

由表4 可知：與對照相比，GLDA 處理組和IAA+GLDA 處理組土壤有效態(tài)Cd 含量均顯著提高，增幅分別為18.97% 和10.34%（P＜0.05），其中GLDA 處理組土壤有效態(tài)Cd 含量還顯著高于IAA+GLDA 處理組（P＜0.05）；IAA 處理組土壤有效態(tài)Cd 含量與對照相比無顯著差異（P＞0.05），但顯著低于GLDA 處理組和IAA+GLDA 處理組（P＜0.05）。此外，土壤有效態(tài)Pb 含量為530.98～574.50 mg/kg，且各處理間差異不顯著（P＞0.05）。

表4 不同處理條件下土壤有效態(tài)Cd 和Pb 含量Tab.4 Soil available Cd and Pb content under different treatments mg/kg

2.5 土壤有效態(tài)Cd 含量與龍葵株高、地上部鮮質(zhì)量及Cd 含量之間的相關(guān)性

由表5 可知：龍葵地上部鮮質(zhì)量與地上部Cd 含量呈顯著負相關(guān)、與土壤有效態(tài)Cd 含量呈極顯著負相關(guān)，而龍葵地上部Cd 含量與土壤有效態(tài)Cd 含量呈極顯著正相關(guān)，說明隨著土壤有效態(tài)Cd 含量的增加或降低，龍葵地上部Cd 含量隨之增加或降低，從而導致對龍葵生長的抑制作用增大或減小。

表5 土壤有效態(tài)Cd 含量與龍葵株高、地上部鮮質(zhì)量及Cd 含量之間的相關(guān)性Tab.5 Correlation among soil available Cd,plant height,shoot fresh weight and Cd content of S.nigrum

3 討論

超積累植物生長速度慢、植株矮小、生物量低，是植物修復技術(shù)的制約因子[18]。近年來，IAA 由于對植物生長具有促進作用，在土壤重金屬污染的植物修復領(lǐng)域得到關(guān)注，并主要通過植株株高、鮮質(zhì)量和干質(zhì)量等指標直觀反映其施用效果。何冰等[19]研究發(fā)現(xiàn)：IAA 處理通過提高生物量和緩解Cd 對葉片的毒害，從而增加東南景天地上部對 Cd 的積累；RAN 等[20]的研究結(jié)果證實：施用20 mg/L IAA 能顯著促進龍葵生長，增加其地上部對Cd 的積累。本試驗中，IAA 單獨施用時龍葵株高和鮮質(zhì)量達到最大值，與前人研究一致，這是因為生長素IAA 的主要生理功能是調(diào)節(jié)細胞分裂[21-22]，改善龍葵的生長狀況。而螯合劑GLDA 單獨施用時龍葵株高和鮮質(zhì)量均低于其他處理，是由于施用GLDA 增加了龍葵葉片中的MDA 含量，降低SOD、POD 和CAT 活性，造成細胞膜系統(tǒng)的破壞。其機制可能包括兩方面：一是GLDA 增加了土壤中重金屬的溶解性，并通過蒸騰作用將其快速運輸?shù)烬埧厣喜?，不利于龍葵生長，這一點可以從添加GLDA 后土壤有效態(tài)Cd 含量顯著提高、而龍葵地上部鮮質(zhì)量與土壤有效態(tài)Cd 含量呈顯著負相關(guān)得以證實；另一方面，未與重金屬形成螯合物的游離態(tài)GLDA 可能具有一定的生物毒性[23-24]，對龍葵生長造成脅迫，其具體作用機制有待進一步研究。

在本研究中，GLDA 和IAA+GLDA 處理下龍葵地上部Cd 含量較對照呈顯著增加趨勢，可能是因為龍葵地上部Cd 含量與土壤有效態(tài)Cd 含量呈極顯著正相關(guān)，而GLDA 含有能夠提供空軌道的配體，如羥基或羧基等，可與Cd 形成穩(wěn)定的可溶螯合物，從而提高土壤Cd 的有效性[25]。同時，添加植物激素IAA 可以調(diào)節(jié)植物活性氧代謝和蛋白質(zhì)的表達，與其受體結(jié)合可以調(diào)節(jié)質(zhì)膜上的 H+-ATPase 活性，引起質(zhì)膜離子通道打開或激活細胞質(zhì)膜離子運動，從而在減輕重金屬對植物脅迫的同時又不會抑制GLDA 對土壤Cd 的溶解效應[26-27]，使聯(lián)合施用處理組龍葵對Cd 的吸收與對照相比仍然顯著提升。土壤有效態(tài)Cd 含量在GLDA 單施及IAA+GLDA 聯(lián)用時變化比較明顯，較對照分別增加10.34%和18.97%，可能是因為GLDA 與土壤中重金屬離子發(fā)生反應形成重金屬絡(luò)合物，使土壤液相中離子濃度低于平衡水平；而為維持重金屬離子在固—液相間的平衡，大量重金屬離子從土壤固相中解離，由無效態(tài)轉(zhuǎn)化為有效態(tài)，從而提高重金屬有效態(tài)的含量[28]。在龍葵地上部Cd 和Pb 含量中，Pb 含量較對照變化不大，各處理間差異不顯著，這與龍葵是Cd 的超富集植物、而對Pb 的吸收能力有限有關(guān)。

植物重金屬提取量是衡量植物修復重金屬污染土壤效果的關(guān)鍵指標，其值為生物量與植物體重金屬含量的乘積。在本研究中，單施IAA 或GLDA 均能顯著提高龍葵地上部Cd 提取量，表現(xiàn)出一定的應用價值。然而，從研究結(jié)果來看，IAA 處理組土壤有效態(tài)Cd 與對照相比并未有明顯變化，因此，在重金屬有效性本身較低的土壤上單施IAA 存在較大局限。GLDA 處理組土壤有效態(tài)Cd 含量雖然較對照顯著增加，但卻對龍葵的生長產(chǎn)生明顯的脅迫，影響總提取量。IAA+GLDA 處理組龍葵對Cd 和Pb 的提取量最大，分別達606.32 和384.09 μg，與對照相比分別提高36.98%和29.38%。其原因是IAA 與GLDA 聯(lián)用后，兩者的協(xié)同作用得到發(fā)揮，在提高龍葵地上部生物量的同時還促進對重金屬的吸收。本研究是在溫室盆栽條件下完成，初步發(fā)現(xiàn)IAA 與GLDA聯(lián)用對龍葵修復Cd-Pb 復合污染土壤具有一定的強化效果，其在大田試驗中表現(xiàn)如何、條件如何優(yōu)化、與之相對應的作用機理有哪些？值得下一步深入探討。

4 結(jié)論

在污染土壤中，單獨施用GLDA 雖然能提高土壤有效態(tài)Cd 含量，促進龍葵地上部對Cd 的吸收，但同時也可增加龍葵葉片丙二醛含量，降低抗氧化酶活性，顯著抑制龍葵生長。將IAA 與GLDA 聯(lián)用能減輕龍葵的毒害作用，并強化龍葵對污染土壤的修復，使其地上部Cd 提取量較對照提高36.98%。因此，IAA 與GLDA 聯(lián)用在提高超積累植物對重金屬的提取效率方面有一定的應用前景。