鈣對鄉(xiāng)土樹種白槍桿光合特性和熒光參數(shù)的影響*

段華超，李燕燕，葉 瀾，井卉竹，李世民，董 瓊

（西南林業(yè)大學(xué)，西南山地森林資源保育與利用教育部重點實驗室，云南 昆明 650224）

光合作用是植物維持正常生命活動的最基本要求，也是植物對非生物脅迫最敏感的生理過程之一[1]。鈣在植物的生長及生理過程中起著重要的作用[2]。鈣作為“第二信使”，具備直接或間接參與物質(zhì)傳輸、調(diào)控氣孔保衛(wèi)細(xì)胞的滲透勢、調(diào)節(jié)氣孔對環(huán)境中CO2的吸收、減少水分散失和提高水分利用效率的作用，進而增強光合作用[3-4]。葉綠素作為光合作用的主要色素，在植物光反應(yīng)過程中起著十分重要的作用，其含量對光合效率有著決定性的作用。適量的鈣可有效促進鐵和鎂元素的吸收，從而促進葉綠素合成；但鈣過量會降低植物對鐵和鎂的吸收，抑制葉綠素合成，最終降低植物的光合效率[5-7]。葉綠素?zé)晒鈪?shù)能反映逆境脅迫下植物的光合生理特性，其信號因具有反應(yīng)靈敏且迅速的特性而被廣泛用作光合作用的光系統(tǒng)探針[8]。一定濃度的鈣能有效保護PSⅡ活性，促進光合電子的傳遞速率，維持較高的凈光合速率和胞間CO2濃度，對植物的生長產(chǎn)生積極作用[9-10]。目前，鈣對植物光合特性的影響研究主要集中在逆境脅迫下鈣的緩解調(diào)控作用[2,9-13]，但以鈣為首要影響因子的植物光合特性研究較少。

白槍桿（Fraxinus malacophylla）屬木犀科（Oleaceae）梣屬（Fraxinus）雙子葉植物，落葉小喬木，耐旱，耐瘠薄，抗逆性和發(fā)芽力強[14-16]；主要分布于滇東南山原峽谷常綠闊葉林中，多為闊葉伴生樹種，也是該地區(qū)生態(tài)恢復(fù)常用樹種之一，具有很高的藥用和生態(tài)價值[17-18]。近年來，隨著國家生態(tài)文明建設(shè)發(fā)展戰(zhàn)略的提出，西南巖溶石漠化地區(qū)生態(tài)恢復(fù)取得了顯著成果，白槍桿作為主要鄉(xiāng)土樹種之一，也被廣泛用于石漠化生態(tài)恢復(fù)。但在生態(tài)恢復(fù)過程中，白槍桿面臨著干旱和富鈣等生境問題[19-20]，而有關(guān)其對土壤中鈣元素的響應(yīng)和調(diào)控機制尚未見文獻報道。因此，本研究以白槍桿幼苗為對象，針對西南巖溶石漠化地區(qū)土壤鈣含量富積的環(huán)境條件，探究鈣對白槍桿生長及光合作用的調(diào)節(jié)機制，明確適宜白槍桿生長的鈣濃度，為白槍桿的推廣利用提供技術(shù)支撐，也為巖溶石漠化地區(qū)植被恢復(fù)及生態(tài)文明建設(shè)可持續(xù)發(fā)展提供更多理論參考，并進一步豐富鈣對植物光合特性影響的理論研究。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗地位于西南林業(yè)大學(xué)格林溫室（云南省昆明市，N25°03′，E102°45′），地處亞熱帶高原季風(fēng)氣候區(qū)，海拔1 904 m；霜期短，氣候溫和，年平均溫度16.5 ℃，最低月平均氣溫12.9 ℃（12 月），最高月平均氣溫28.4 ℃（6 月），年平均降水量1 035 mm，主要集中在6—10 月，年平均相對濕度67%（數(shù)據(jù)來源于國家氣象科學(xué)數(shù)據(jù)中心）。

1.2 試驗材料與試驗設(shè)計

供試材料為一年生白槍桿實生袋苗，2020 年1 月播種于云南建水。2020 年6 月由云南建水運往西南林業(yè)大學(xué)格林溫室，并植入營養(yǎng)缽中。營養(yǎng)缽上口徑160 mm，下口徑110 mm，高120 mm，底部墊托盤；盆栽土壤理化性質(zhì)為：pH 5.45，總氮含量0.71 g/kg，總磷含量0.57 g/kg，總鉀含量2.06 g/kg，總鈣含量0.48 g/kg，鎂含量0.12 g/kg，鐵含量60.99 g/kg，容重1.14 g/cm3；基質(zhì)配比為m紅壤∶m河沙∶m珍珠巖=5∶3∶2，每盆種植1 株幼苗，于溫室內(nèi)進行常規(guī)管理。適應(yīng)生長15 d 后，于7 月5 日選取長勢均勻一致的苗木，用于CaCl2澆灌處理。

試驗采用單因素完全隨機試驗設(shè)計，根據(jù)前期預(yù)試驗，設(shè)置0（CK）、25（低鈣）、50（中鈣）和75 mmol/L（高鈣）4 個鈣濃度梯度，分別記為CK、T1、T2和T3，每隔15 d 分別用不同濃度CaCl2溶液對白槍桿幼苗進行定量（每株50 mL）澆灌，CK 以等量的去離子水灌溉。每個處理18 株，4 次重復(fù)，共288 株。澆灌過程中將滲入托盤的溶液倒回營養(yǎng)缽中，防止鈣流失。每隔15 d 測定1 次生長指標(biāo)；鈣處理90 d 后，測定光合指標(biāo)和葉綠素?zé)晒鈪?shù)，并從每株相同位置采2～3 片葉保存于液氮，在實驗室測定葉綠素含量。

1.3 測定指標(biāo)與方法

1.3.1 生長指標(biāo)測定

測定的生長指標(biāo)包括幼苗的株高、地徑和株幅。鈣處理試驗開始時，于生長期內(nèi)每隔15 d 利用鋼尺（精確度0.01 cm）和游標(biāo)卡尺（精確度0.02 mm）準(zhǔn)確測量幼苗株高、地徑（東西、南北方向的平均值）和株幅（長、短株幅的平均值）。幼苗株高、地徑和株幅的生長量分別為試驗結(jié)束和試驗開始時的數(shù)值之差。

1.3.2 光合指標(biāo)測定

于2020 年10 月上旬選擇晴朗無云的連續(xù)3 d，采用Li-6400XT 便攜式光合測定儀（LI-COR公司，美國）從8：0 0—18：0 0 測定從頂芽往下數(shù)第4～6 片完整功能葉的光合日變化，間隔2 h測定1 次。每個處理選取4 株長勢基本一致的幼苗，每株測定2 片葉，每片葉重復(fù)測定3 次（每次讀取10 個數(shù)值），結(jié)果取平均值。同時期于晴天上午9：3 0—11：3 0 測定其光合特性，測定指標(biāo)包括白槍桿幼苗功能葉的凈光合速率（photosynthetic rate，Pn）、氣孔導(dǎo)度（stomatal conductance，Gs）、胞間CO2濃度（intercellular CO2concentration，Ci）和蒸騰速率（transpiration rate，Tr）。測定時采用自然光源，標(biāo)準(zhǔn)葉室（2 cm×3 cm），空氣流速為500 s/m3，并計算水分利用率（water use efficiency，WUE）：WUE=Pn/Tr。

1.3.3 葉綠素?zé)晒鈪?shù)測定

葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測定與光合參數(shù)測定同步進行，每個處理挑選4 株長勢一致的幼苗，每株選取第4～6 片中無病蟲害、長勢良好、功能完整的2 片葉進行標(biāo)記。采用PEA-Plus 高速連續(xù)激發(fā)式熒光儀（Hansatech 公司，英國）測定葉綠素?zé)晒鈪?shù)，測定前充分光適應(yīng)，再進行暗處理30 min，測定初始熒光產(chǎn)量（initial fluorescence yield，F(xiàn)o）、最大熒光產(chǎn)量（maximal fluorescence yield，F(xiàn)m）、PSⅡ最大量子產(chǎn)率（Fv/Fm）和PSⅡ潛在活性（Fv/Fo），每片葉測定3 次，連續(xù)測定3 d，取平均值。

1.3.4 葉綠素含量測定

采用分光光度法測定葉綠素含量。將采集的新鮮葉片去除葉脈剪碎混勻，準(zhǔn)確稱取0.2 g（精確度0.001 g），放入干燥研缽中，加入液氮快速研磨至粉末狀。先后加入95% 乙醇3 和5 mL，繼續(xù)研磨成勻漿狀后靜置3～5 min，將勻漿全部移入25 mL 棕色容量瓶中，并用95% 乙醇定容，搖勻后靜置12 h[21]。以95%乙醇為空白對照，利用紫外分光光度計于波長665、649 和470 nm下測定葉綠素a（Chla）、葉綠素b（Chlb）和類胡蘿卜素（Car）的吸光度（OD 值），按照公式[22]計算每克葉片的葉綠素a、葉綠素b 和類胡蘿卜素含量。每個樣品重復(fù)3 次，取平均值。

式中：Ca、Cb和Cc分別為葉綠素a、葉綠素b 和類胡蘿卜素的質(zhì)量濃度（mg/L），OD665、OD649和OD470分別為波長665、649 和470 nm 下的吸光度。

再根據(jù)以下公式計算植物組織中葉綠素含量：

式中：C為色素質(zhì)量濃度（mg/L），V為提取液體積（mL），N為稀釋倍數(shù)，m為樣品質(zhì)量（g），1 000表示1 000 mL。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2016 處理和統(tǒng)計數(shù)據(jù)；使用SPSS 25.0 進行單因素方差分析，各處理平均值采用LSD 法進行多重比較和差異顯著性檢驗；使用Origin 2018 制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度鈣對白槍桿幼苗形態(tài)指標(biāo)的影響

由表1 可知：在不同濃度鈣處理下，白槍桿幼苗生長指標(biāo)前15 d 內(nèi)無顯著差異（P＞0.05）；與CK 相比，鈣處理30 d 后株幅開始出現(xiàn)顯著差異（P＜0.05），處理45 d 后苗高開始出現(xiàn)顯著差異（P＜0.05）；試驗期間，不同濃度鈣處理的地徑均未出現(xiàn)差異（P＞0.05）。不同濃度鈣處理下，苗高和株幅生長量差異較大，其生長量大小順序均為T2＞T1＞T3＞CK，T2處理分別比CK 高15.07%和23.32%（P＜0.05）；地徑生長量大小順 序 為T2＞T1＞CK＞T3；但白槍桿幼苗各形態(tài)指標(biāo)生長量均隨鈣濃度的增加呈先增加后下降的趨勢。

表1 不同濃度鈣處理下白槍桿幼苗生長指標(biāo)測定結(jié)果Tab.1 Determination results of growth index of Fraxinus malacophylla seedlings under different calcium concentration treatments

2.2 不同濃度鈣對白槍桿幼苗光合特性的影響

2.2.1 不同濃度鈣對光合日變化的影響

由圖1 可知：不同鈣濃度處理下，白槍桿幼苗葉片在晴天凈光合速率（Pn）和氣孔導(dǎo)度（Gs）日變化趨勢大致相同，T2的變化幅度最大，T3的變化幅度最小，且均呈明顯的雙峰曲線：從8：00開始上升，10：00—12：00達到第1 個高峰，然后快速下降，12：00—14：00降至“光合午休”狀態(tài)；14：00—16：00開始緩慢上升并達到第2 個高峰，后緩慢下降，到16：00—18：00降到最低點。白槍桿幼苗葉片Pn日變化與Gs、蒸騰速率（Tr）呈正相關(guān)，與胞間CO2濃度（Ci）呈負(fù)相關(guān)。此外，不同濃度鈣處理的Tr均小于CK。

圖1 不同鈣濃度對白槍桿幼苗葉片光合特性日變化的影響Fig.1 Effects of different calcium concentrations on the diurnal changes of photosynthetic characteristics of Fraxinus malacophylla seedling

2.2.2 不同濃度鈣對光合參數(shù)的影響

由表2 可知：不同濃度鈣處理下白槍桿幼苗功能葉Pn和Gs大小順序均為T2＞T1＞CK＞T3，中濃度鈣（T2）處理的Pn比其他處理顯著提高10.68%～43.47%（P＜0.05），低濃度鈣（T1）和中濃度鈣（T2）處理的Gs顯著高于對照和高濃度鈣處理（P＜0.05）。由表2 還可知：T2處理的Ci值顯著低于其他處理（P＜0.05）；不同濃度鈣處理均可顯著降低白槍桿幼苗的Tr（P＜0.05），降幅分別為 27.63%、25.57%和34.43%；不同濃度鈣處理下，水分利用率（WUE）隨著鈣濃度的增加呈先升高后下降的趨勢，T2處理的WUE 顯著高于其他處理（P＜0.05）。

表2 不同濃度鈣對白槍桿幼苗光合參數(shù)的影響Tab.2 Effects of different calcium concentrations on the photosynthetic parameters of F.malacophylla seedling

2.3 不同濃度鈣對白槍桿幼苗葉片熒光參數(shù)的影響

由圖2 可知：不同濃度鈣處理后，白槍桿幼苗葉片初始熒光產(chǎn)量（Fo）呈先升高后降低的趨勢；對照處理的Fo值最小，為410.33±20.26，中濃度鈣處理（T2）的Fo最大，達467.67±13.79，比對照高13.97%（P＜0.05），表明中鈣處理光合系統(tǒng)開放程度顯著高于對照。隨著鈣濃度升高，最大熒光產(chǎn)量（Fm）呈先升后降的趨勢；鈣濃度達到50 mmol/L 時，F(xiàn)m最大，顯著高于對照，有效提高了PSⅡ電子傳遞速率；鈣濃度達到75 mmol/L時，F(xiàn)m顯著小于對照，說明PSⅡ電子傳遞開始受阻，產(chǎn)生脅迫作用。由圖2 還可知：PSⅡ最大量子產(chǎn)率（Fv/Fm）和潛在活性（Fv/Fo）隨鈣濃度的增加均呈先增加后降低的變化趨勢，均在T2處理下達到最大值，分別為0.83±0.01 和4.95±0.03，顯著高于對照（P＜0.05）；Fv/Fm和Fv/Fo在高濃度鈣（T3）處理下均顯著低于對照（P＜0.05），表明PSⅡ反應(yīng)中心在高鈣濃度下活性受抑制。

圖2 不同濃度鈣對白槍桿幼苗葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響Fig.2 Effects of different calcium concentrations on the chlorophyll fluorescence parameters of F.malacophylla seedling

2.4 不同濃度鈣對白槍桿幼苗葉綠素含量的影響

由表3 可知：不同濃度鈣對白槍桿幼苗葉片葉綠素含量有顯著影響，表現(xiàn)為隨鈣濃度的增加，白槍桿幼苗葉片葉綠素a（Chla）、葉綠素b（Chlb）、葉綠素總量[Chl（a+b）]和類胡蘿卜素（Car）含量均呈先增加后減少的趨勢。中濃度鈣（T2）處理下，白槍桿幼苗葉片Chla、Chlb、Chl（a+b）和Car 含量均顯著高于對照（P＜0.05），但Chla/Chlb與對照差異不顯著（P＞0.05）；低濃度鈣（T1）處理下，葉綠素各指標(biāo)含量與對照均無顯著差異（P＞0.05）；高濃度鈣（T3）處理下，Chla/Chlb 與對照差異顯著（P＜0.05），其余指標(biāo)差異性均不顯著（P＞0.05）。

表3 不同鈣濃度對白槍桿幼苗葉綠素含量的影響Tab.3 Effects of different calcium concentrations on the chlorophyll content of F.malacophylla seedling

3 討論

3.1 鈣對葉綠素和光合特性的影響

鈣與植物葉片的葉綠素含量密切相關(guān)。鈣離子濃度變化可以影響植物對鎂的吸收及分配，從而影響葉綠素合成[23-24]。有研究表明：適量外源鈣添加可以促進植株生長發(fā)育和葉綠素合成，提高植株光合效率[25]；鈣濃度過高會抑制植物對其他元素的吸收和利用，也抑制植物光合系統(tǒng)生理活性，從而使植株受到鈣脅迫導(dǎo)致其生長發(fā)育緩慢[26]。葉綠素a/葉綠素b 主要反映PSⅡ聚光復(fù)合體在所有含葉綠素的結(jié)構(gòu)中所占的比重，該值上升則PSⅡ聚光復(fù)合體含量減少，光合速率下降[27]。本研究中，低、中濃度鈣處理下，白槍桿幼苗的生長量和葉綠素含量均呈上升趨勢；而高濃度鈣處理下，其生長量和葉綠素含量下降，葉綠素a/葉綠素b 上升，與孫悅[10]的研究結(jié)果相似。這說明適宜的鈣濃度有利于白槍桿幼苗生長及葉綠素合成；鈣濃度過高會產(chǎn)生脅迫作用，抑制其生長，降低葉片葉綠素含量和PSⅡ聚光復(fù)合體含量，從而降低光合效率。

鈣元素對植物的光合作用具有重要作用，添加適量的外源鈣可以提高植物的凈光合速率（Pn），促進氣孔打開，提高蒸騰速率（Tr）和水分利用率（WUE），進而促進植物幼苗光合作用[28-30]。本研究表明：低、中濃度鈣（25 和50 mmol/L）處理下，白槍桿幼苗的Pn、氣孔導(dǎo)度（Gs）和WUE均顯著提高，胞間CO2濃度（Ci）降低，與任城帥等[13]的研究結(jié)果一致；但Tr比CK 顯著下降，與蘇志孟[31]的研究不一致，其原因可能是低、中濃度鈣處理下WUE 顯著提高，葉片中自由水含量降低，參與蒸騰的水分較少，從而導(dǎo)致其Tr小于對照。孫悅[10]和韓飛燕[30]分別以油松（Pinus tabuliformis）和麻櫟（Quercus acutissima）為研究對象，發(fā)現(xiàn)鈣濃度過高時，2 種植物的光合效率降低，植物生長受限；本研究中，高濃度鈣（75 mmol/L）處理下白槍桿幼苗Pn、Gs和Tr均顯著低于低、中濃度鈣處理，各器官生長量降低，說明添加過量的外源鈣會降低白槍桿幼苗的光合作用，抑制其生長。

3.2 鈣對葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

葉綠素?zé)晒鈪?shù)能有效表征植物的生長狀態(tài)，是研究植物光合原初反應(yīng)的無損探針，可監(jiān)測光合作用的多個進程，并能體現(xiàn)植物的生理狀況，是生境中物理及化學(xué)條件脅迫對植物生長影響的重要指標(biāo)[32-33]。熒光參數(shù)中，初始熒光產(chǎn)量（Fo）反映的是光系統(tǒng)（PSⅡ）處于完全開放時的熒光產(chǎn)量，最大熒光產(chǎn)量（Fm）反映的是PSⅡ完全封閉時的熒光產(chǎn)量，F(xiàn)v/Fm和Fv/Fo分別表示PSⅡ的最大量子產(chǎn)率和潛在活性，可以有效反映植物的光合發(fā)生情況[34-35]。王輝等[36]通過對玉簪（Hosta plantaginea）添加不同濃度外源鈣溶液發(fā)現(xiàn)：添加適宜濃度的外源鈣能有效提高玉簪熒光產(chǎn)量、最大光學(xué)效率和潛在活性；鈣濃度過高則會抑制熒光產(chǎn)量，降低光能利用率。本研究中，不同濃度外源鈣處理下白槍桿幼苗的Fo、Fm、Fv/Fm和Fv/Fo值均有較大變化。鈣濃度達到75 mmol/L 時，F(xiàn)v/Fm和Fv/Fo值均顯著下降，說明鈣濃度超過75 mmol/L 會產(chǎn)生脅迫作用，顯著降低白槍桿幼苗PSⅡ最大量子產(chǎn)率和PSⅡ潛在活性，且Fo在鈣脅迫作用發(fā)生后相比CK 增大，也充分反映了PSⅡ反應(yīng)中心受抑制，與王輝等[36]的研究結(jié)果相似；而Fm明顯降低，與謝詩[37]和王婧[38]的研究結(jié)果不一致，分析其原因可能是研究材料不同所致，白槍桿作為木本植物，對鈣濃度變化更敏感，鈣脅迫發(fā)生后，PSⅡ反應(yīng)中心電子傳遞速率下降，導(dǎo)致Fm明顯降低，但具體原因有待進一步研究。鈣濃度為50 mmol/L 時，白槍桿幼苗的Fo、Fm、Fv/Fm和Fv/Fo值均顯著高于對照，說明添加50 mmol/L 的外源鈣能有效提高白槍桿PSⅡ反應(yīng)中心熒光產(chǎn)量、最大光學(xué)效率和潛在活性，增強植株的光合作用。此外，中濃度鈣處理的葉綠素含量最高，F(xiàn)o值也最大，F(xiàn)o隨著葉綠素含量增加而增大的關(guān)系也說明添加中濃度外源鈣能顯著提高白槍桿幼苗光合效率[39-40]。

4 結(jié)論

白槍桿幼苗生長的較適外源鈣濃度為50 mmol/L。添加適宜的外源鈣能促進白槍桿幼苗葉片葉綠素合成，提高凈光合速率、氣孔導(dǎo)度和水分利用率，提高白槍桿幼苗的Fo、Fm、Fv/Fm和Fv/Fo等熒光參數(shù)，從而進一步促進植株光合作用和植物生長；鈣濃度過高則會抑制光合作用和生長。