射干乙醇提取物的鎮(zhèn)痛抗炎活性及作用機(jī)制研究

楊 燕，李雪蓮，王超群，袁旭芳，何希瑞

(遵義醫(yī)科大學(xué)珠海校區(qū) 生物工程系，廣東 珠海 519041)

射干(Belamcandachinensis(L.)Redouté)，是一種多年生草本植物(鳶尾科)，高60-120 cm，原產(chǎn)于中國、日本、韓國、不丹、緬甸、尼泊爾、菲律賓、泰國和越南等多個(gè)國家[1]。在歐洲和北美的一些地區(qū)，射干也被作為一種觀賞性園林植物廣泛種植。在東亞，射干的干燥根莖長期被用于治療咽喉疾病、哮喘、肝脾腫大、箭中毒、淋病和瘧疾等疾病。此外，射干也是治療肺部疾病配方中的主要成分，具有減輕炎癥和抗病毒的作用[2-5]。在中國，射干的根莖始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》。從那時(shí)起，人們就對(duì)射干及其湯劑產(chǎn)生了較大的興趣。經(jīng)過幾千前的中醫(yī)臨床實(shí)踐，射干被認(rèn)為具有解毒、平喉、清熱、祛痰、消腫、止痛等功效[6]。在中醫(yī)臨床上射干(推薦劑量為6～10 g)經(jīng)常和其他中藥如桑白皮、細(xì)辛、半夏、黃芩、桔梗、麻黃等其他中藥配伍用于治療各種呼吸系統(tǒng)疾病。在泰國和越南，射干也常用于治療月經(jīng)不調(diào)、閉經(jīng)或痛經(jīng)[7]。在尼泊爾，射干被用于治療肝臟疾病，也被當(dāng)作祛痰藥使用[8]。

植物化學(xué)研究表明，射干根莖富含多種多酚類化合物，如異黃酮類、二苯乙烯類、氧雜蒽酮類和簡單酚類。其中，黃酮類和異黃酮類化合物是射干中主要的酚類化合物[9-10]。其中，射干苷被《中國藥典》(2020年版)記載為射干及其制劑質(zhì)量評(píng)價(jià)和控制的指標(biāo)成分，要求干燥品中含射干苷不得少于3.6 %。此外，《歐洲藥典》要求基于HPLC(C18硅膠柱)測得的射干干燥根莖中的次野鳶尾黃素含量應(yīng)為0.1 %。迄今為止，射干及其含有的主要酚性成分的部分生物活性已通過體內(nèi)和體外研究證實(shí)，如抗氧化、抗突變、抗炎、抗菌、抗病毒、殺蟲和抗血管生成等[11-15]?？上驳氖牵鲜龅囊恍┧幚砘钚暂^好的印證了射干在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中的一些應(yīng)用。但問題是針對(duì)射干的大多數(shù)現(xiàn)代藥效研究主要集中在含量較大的單體化合物上，如研究表明射干中含有的異黃酮類化合物次野鳶尾黃素在體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭酗@示出較好的抗炎活性[16]。然而，迄今為止，較為深入且系統(tǒng)的關(guān)于射干提取物鎮(zhèn)痛抗炎主題的文獻(xiàn)資料仍然不足?？紤]到射干在治療腰痛、肌肉痛、咽喉痛、扁桃體炎、閉經(jīng)等方面的傳統(tǒng)用途，有必要深入探究射干鎮(zhèn)痛抗炎作用及作用機(jī)理。因此，本研究以小鼠和Raw264.7細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，系統(tǒng)評(píng)價(jià)射干提取物在不同疼痛刺激模型和化學(xué)性炎癥模型上的鎮(zhèn)痛抗炎活性，并從炎癥因子的角度初步評(píng)價(jià)其可能的作用機(jī)理，以期為臨床上射干治療疼痛和炎癥疾病提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料

1.1 儀器 粉碎機(jī)(深圳市方達(dá)研磨技術(shù)有限公司)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(森科科技有限公司)，電子數(shù)顯卡尺(樂清市禾有限公司)。

1.2 藥品與試劑 中藥射干購自北京同仁堂西安大藥房有限公司；乙醇(99.5 %)上海凱茵化工有限公司；醋酸(99.5 %)中國泰山新寧制藥公司；二甲苯(98.0 %)中國天津富宇化學(xué)試劑公司；吲哚美辛(中國臨汾麒麟制藥公司)；嗎啡(中國東北制藥集團(tuán)沈陽第一制藥公司)；角叉菜膠(日本和田純化工有限公司)；福爾馬林(天津天力化學(xué)試劑公司，中國)；吐溫(廣東華納化工有限公司)。一氧化氮(NO)檢測試劑盒和一氧化氮合酶(iNOS)檢測等試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明種(KM)雄性和雌性小鼠(22～28 g)。飼養(yǎng)在12 h 的光/暗循環(huán)下，將它們保持在(22±2)℃的受控室溫下，自由獲取食物和水。

2 方法

2.1 鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)

2.1.1 醋酸扭體實(shí)驗(yàn) 40只KM小鼠隨機(jī)分為5組，分別為模型組、陽性對(duì)照組、EEBC低、中、高劑量組。EEBC低、中、高劑量組小鼠分別腹腔注射50、100和200 mg/kg EEBC，模型組給予生理鹽水(10 mL/kg，i.p.)，陽性對(duì)照組給予吲哚美辛(100 mg/kg，i.p.)。給藥30 min后，每只小鼠腹腔注射0.7 %醋酸(0.1 mL/10 g)。記錄每只小鼠在0～30 min內(nèi)小鼠的扭體總次數(shù)。

2.1.2 福爾馬林實(shí)驗(yàn) 48只小鼠隨機(jī)分為6組，分別為模型組、陽性對(duì)照組、EEBC低、中、高劑量組。EEBC低、中、高劑量組小鼠腹腔注射50、100和200 mg/kg 射干乙醇提取液，模型對(duì)照組給予生理鹽水(10 mL/kg，i.p.)，陽性對(duì)照組分別給予嗎啡(5 mg/kg)和吲哚美辛(50 mg/kg)。30 min后，將2.5 %福爾馬林溶液(25 μL)注入小鼠右側(cè)足底下。福爾馬林注射后，立即將小鼠放入直徑為20 cm的玻璃圓柱體中，用計(jì)時(shí)儀記錄第1階段(0～5 min)和第2階段(15～30 min)小鼠舔足時(shí)間，作為傷害反應(yīng)強(qiáng)弱的指標(biāo)。

2.1.3 熱板實(shí)驗(yàn) 在開始本實(shí)驗(yàn)之前，將雌性小鼠依次放在(50±0.5)℃的熱板上進(jìn)行篩選，并棄去那些在5 s即產(chǎn)生傷害性反應(yīng)(舔其后爪或跳躍)或30 s以上仍未產(chǎn)生傷害性反應(yīng)的小鼠。然后，將小鼠隨機(jī)分為5組，每組8只，實(shí)驗(yàn)組分別通過腹腔注射給予50、100和200 mg/kg的EEBC，模型對(duì)照組給予生理鹽水10 mL/kg，對(duì)照組給予嗎啡5 mg/kg。給藥后30、60、90和120 min，分別將小鼠置于50±0.5 ℃的加熱板上，最長時(shí)間為40 s，以舔前爪或抬腳的時(shí)間為潛伏期，計(jì)算抑制率。

2.2 抗炎實(shí)驗(yàn)

2.2.1 角叉菜膠致小鼠足腫脹實(shí)驗(yàn) 本研究中EEBC的抗炎作用首先采用角叉菜膠誘導(dǎo)的小鼠后足水腫模型評(píng)價(jià)。給藥前，用電子數(shù)顯卡尺測定小鼠后足初始厚度。然后，將小鼠隨機(jī)分組，每組分別給予EEBC(50、100和200 mg/kg，i.p.)、吲哚美辛(50 mg/kg，i.p.)或生理鹽水(10 ml/kg，i.p.)。給藥30 min后，將25 μL 2 %的角叉菜膠溶液皮下注射到小鼠右后爪。分別于注射后1 h、3 h、5 h用電子數(shù)顯卡尺測量小鼠右足趾厚度，計(jì)算抑制率。

2.2.2 二甲苯致小鼠耳腫脹實(shí)驗(yàn) 小鼠隨機(jī)分組并分別給予藥物30 min后，每只小鼠在右耳垂的前后表面各注射15 μL二甲苯溶液。其中，小鼠左耳作為對(duì)照。60 min后，處死小鼠，用直徑為8 mm打孔器獲取小鼠左右耳圓形切片，稱重。水腫程度用左耳和右耳重量(mg)的差值表示，計(jì)算耳腫脹程度。

2.2.3 EEBC對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞炎癥因子水平，NO 的含量及 iNOS 活力的影響 將對(duì)數(shù)生長期的小鼠巨噬細(xì)胞 Raw264.7細(xì)胞接種于96孔板，分組并加入相應(yīng)的藥物干預(yù)。細(xì)胞分為正常對(duì)照組、LPS組(1 μg/mL)、LPS(1 μg/mL)+EEBC(0.05 mg/mL)、LPS(1 μg/mL)+EEBC(0.10 mg/mL)、LPS(1 μg/mL)+EEBC(0.20 mg/mL)和LPS(1 μg/mL)+EEBC(0.40 mg/mL)組。培養(yǎng) 12 h 后，收集各孔細(xì)胞上清液。按照ELISA法測定細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6 含量。嚴(yán)格依照NO和iNOS試劑盒說明書進(jìn)行樣品處理和操作，然后用酶標(biāo)儀分別測定各孔在550 nm 和 530 nm 波長下的吸光度值。計(jì)算各組NO 含量和 iNOS 活力。

3 結(jié)果

3.1 鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1.1 EEBC對(duì)醋酸致小鼠扭體的影響 由圖1所示，與模型對(duì)照組相比，EEBC(50、100和200 mg/kg)劑量依賴性地減少0.7 %醋酸引起的小鼠扭體次數(shù)，抑制率分別為26.25 %、54.37 %和82.50 %。陽性藥物吲哚美辛在100 mg/kg時(shí)也能顯著減少醋酸引起的扭體次數(shù)，抑制率高達(dá)96.16 %，但實(shí)驗(yàn)后24 h內(nèi)該組80 %的小鼠死亡(見圖1)。

*、**、*** ：分別與模型對(duì)照組相比，P<0.05，P<0.01，P<0.001(n=8)。

3.1.2 EEBC對(duì)福爾馬林致小鼠疼痛的影響 在福爾馬林實(shí)驗(yàn)中，腹腔注射EEBC可減少福爾馬林誘導(dǎo)的小鼠第1階段(神經(jīng)源性)和第2階段(炎癥)的傷害性反應(yīng)(見圖2)。由圖2可見，在疼痛的第一階段，EEBC僅在200 mg/kg的劑量下顯著降低福爾馬林誘導(dǎo)的傷害性反應(yīng)，抑制率為25.69 %。然而，50、100和200 mg/kg的EEBC對(duì)福爾馬林誘導(dǎo)的第二階段炎癥有抑制作用，抑制率分別為23.41 %、35.72 %和41.34 %。嗎啡(5 mg/kg)在第一和第二階段均能顯著縮短痛覺活動(dòng)的持續(xù)時(shí)間，抑制率分別為76.80 %和83.22 %。結(jié)果顯示，EEBC在第二階段(炎癥階段)的效果更為顯著，表明其顯著減輕炎性疼痛，提示其鎮(zhèn)痛作用機(jī)制可能主要是通過外周性機(jī)制。

3.1.3 EEBC對(duì)熱刺激致小鼠傷害反應(yīng)的影響 如圖3所示，EEBC(50、100和200 mg/kg)腹腔注射給藥后可劑量依賴性地延長熱傷害性實(shí)驗(yàn)小鼠的反應(yīng)潛伏期。特別是EEBC在100和200 mg/kg劑量時(shí)顯著延長小鼠熱刺激反應(yīng)潛伏期，分別由模型對(duì)照組的15.18 s增加到25.80 s和30.38 s。此外，在給藥60、90和120 min后，EEBC在100和200 mg/kg劑量下仍能顯著增加熱誘導(dǎo)小鼠傷害性反應(yīng)的潛伏期。然而，低劑量的EEBC(50 mg/kg)并未產(chǎn)生抗傷害作用(P>0.05)。

3.2 抗炎實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.2.1 EEBC對(duì)角叉菜膠所致小鼠足腫脹的影響 如圖4所示，在1、3和5 h給予不同劑量的EEBC(50、100和200 mg/kg)可顯著降低角叉菜膠(1 %，25 μL)誘導(dǎo)的足腫脹程度。角叉菜膠皮下注射0.5 h后引起小鼠后足腫脹，然后這種炎癥反應(yīng)在大約2.5～3 h達(dá)到最大值，之后開始下降。結(jié)果表明，EEBC在1、3和5 h能顯著降低角叉菜膠引起的足腫脹率。特別是EEBC在200 mg/kg劑量時(shí)能顯著降低小鼠足腫脹，抑制率分別為25.40 %、23.9 %和20.77 %。

*、**：分別與模型對(duì)照組相比，P<0.05，P<0.01(n=8)。

3.2.2 EEBC對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹的影響 如圖5所示，與模型對(duì)照相相比，EEBC在50、100和200 mg/kg劑量下可劑量依賴性抑制二甲苯引起的小鼠耳腫脹程度，抑制率分別為14.35 %、28.96 %和37.54 %。而陽性對(duì)照藥物吲哚美辛(50 mg/kg，i.p.)的抑制耳腫脹的作用更顯著，抑制率為70.41 %。

*、**、*** ：分別與模型對(duì)照組相比，P<0.05，P<0.01，P<0.001(n=8)。

3.2.3 EEBC對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞NO 的含量及 iNOS 活力的影響 如表1所示，與正常對(duì)照組相比，模型組Raw264.7細(xì)胞上清液中的NO 含量及 iNOS 活力顯著升高(P<0.01)。與模型組比較，EEBC各劑量組可劑量依賴性地降低Raw264.7細(xì)胞上清液中NO 含量及 iNOS 活力，特別是在0.2 mg/mL和0.4 mg/mL劑量下，差異具有極顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。結(jié)果表明，EEBC對(duì) LPS誘導(dǎo)的小鼠Raw264.7細(xì)胞NO的產(chǎn)生和iNOS的活力 均有明顯抑制作用。

表1 EEBC對(duì)Raw264.7 細(xì)胞分泌NO 的含量及 iNOS 活力的影響

3.2.4 EEBC對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞炎癥因子分泌的影響 如表2所示，與正常對(duì)照組相比，模型組Raw264.7細(xì)胞上清液中的炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平顯著提高。與模型組相比，EEBC各劑量組可劑量依賴性地降低TNF-α、IL-1β和IL-6水平，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果表明，EEBC的抗炎作用與抑制炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生密切相關(guān)。

表2 EEBC對(duì)Raw264.7 細(xì)胞炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平的影響

4 討論

本研究采用熱刺激和化學(xué)物質(zhì)刺激實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ驮u(píng)價(jià)了射干乙醇提取物潛在的鎮(zhèn)痛和抗炎活性，并采用LPS誘導(dǎo)的Raw264.7巨噬細(xì)胞炎癥模型評(píng)價(jià)其體外對(duì)炎癥因子和炎癥介質(zhì)產(chǎn)生的影響。研究結(jié)果表明，射干不僅具有良好的鎮(zhèn)痛抗炎作用，而且其鎮(zhèn)痛作用可能主要通過外周機(jī)制發(fā)揮作用。

在鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)中，本研究采用經(jīng)典的鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，包括醋酸扭體模型、熱板模型和福爾馬林模型評(píng)價(jià)EEBC的外周鎮(zhèn)痛效果。其中，醋酸誘導(dǎo)的扭體模型與腹腔液COX和PGE水平的增加有關(guān)，通常用于驗(yàn)證藥物的外周鎮(zhèn)痛作用[17-18]。福爾馬林試驗(yàn)是一種較為有效且可靠的痛覺模型，常用于各類鎮(zhèn)痛藥。這種痛覺模式包括兩個(gè)不同的階段：早期階段(神經(jīng)源性疼痛)和晚期階段(炎性疼痛)。熱板試驗(yàn)用于熱刺激引起的基礎(chǔ)性疼痛研究，通常用于篩選麻醉性鎮(zhèn)痛藥。本研究發(fā)現(xiàn)EEBC以劑量依賴的方式延長醋酸致小鼠的疼痛潛伏期，顯著減少扭體次數(shù)，表現(xiàn)出較好的鎮(zhèn)痛作用。特別是EEBC在200 mg/kg劑量下顯著延長了熱刺激引起的小鼠傷害性反應(yīng)的潛伏期。此外，考慮到工具藥的作用機(jī)制，本研究進(jìn)一步觀察了EEBC對(duì)福爾馬林所致小鼠傷害性反應(yīng)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在福爾馬林實(shí)驗(yàn)中，EEBC劑量分別為50、100和200 mg/kg時(shí)在神經(jīng)源性和炎性兩個(gè)階段均顯示出明顯的鎮(zhèn)痛作用。在神經(jīng)源期，抑制率分別為11.47 %、17.05 %和25.69 %；在炎癥期，抑制率分別為23.41 %、35.72 %和41.34 %。研究表明，福爾馬林實(shí)驗(yàn)第二階段的疼痛反應(yīng)與誘導(dǎo)型環(huán)氧合酶(COX)-2活性的升高、PGs的產(chǎn)生、氧自由基的產(chǎn)生以及局部中性粒細(xì)胞的浸潤和激活有關(guān)，從現(xiàn)有結(jié)果推測EEBC中可能存在環(huán)氧合酶的抑制性成分?？傊珽EBC在醋酸致小鼠扭體實(shí)驗(yàn)、熱刺激致小鼠疼痛實(shí)驗(yàn)和福爾馬林致小鼠扭體實(shí)驗(yàn)中均能抑制痛覺，但對(duì)炎癥性疼痛的抑制作用更為明顯。結(jié)合這三個(gè)鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)結(jié)果，不難發(fā)現(xiàn)EEBC的鎮(zhèn)痛作用可能主要通過外周機(jī)制介導(dǎo)，且其對(duì)炎癥鎮(zhèn)痛的作用效果更為顯著。因此，本研究進(jìn)一步構(gòu)建炎癥模型對(duì)EEBC的體內(nèi)外抗炎作用進(jìn)行了深入的研究。

研究表明，與傷害性疼痛反應(yīng)相關(guān)的炎癥介質(zhì)，如PGs、COX、腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素和P物質(zhì)等在炎性疼痛方面發(fā)揮重要的作用[4,19]。此外，iNOS 與炎癥關(guān)系密切，多種炎癥因子可誘導(dǎo)其表達(dá)，產(chǎn)生內(nèi)源性 NO，進(jìn)而增加機(jī)體炎癥反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致疼痛。因此，基于上述鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)結(jié)果及射干在炎癥疼痛上顯示出的良好效果，并結(jié)合炎性疼痛的作用機(jī)制，本研究進(jìn)一步研究了EEBC在化學(xué)性炎癥反應(yīng)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜕系淖饔?，包括角叉菜膠致足腫脹實(shí)驗(yàn)、二甲苯致耳腫脹模型及LPS致Raw264.7細(xì)胞炎癥模型。角叉菜膠引起的炎癥通常被稱為急性和高度重復(fù)性炎癥試驗(yàn)。而二甲苯引起的水腫可導(dǎo)致血管擴(kuò)張和水腫改變，又稱為急性神經(jīng)源性炎癥模型。LPS誘導(dǎo)Raw264.7炎癥模型是探究細(xì)胞與炎癥反應(yīng)之間的關(guān)系和篩選抗炎藥物常用的炎癥模型。首先，本研究采用角叉菜膠致足腫脹實(shí)驗(yàn)探究EEBC的在體抗炎作用。結(jié)果表明EEBC可減輕角叉菜膠誘導(dǎo)的小鼠足跖腫脹程度，并在3 h和5 h時(shí)顯著減少小鼠足跖厚度，表現(xiàn)出較好的抗炎活性。然后，應(yīng)用另一種重要且常見的二甲苯誘導(dǎo)的神經(jīng)源性炎癥模型評(píng)價(jià)其抗炎活性。結(jié)果表明，EEBC(50、100、200 mg/kg)可劑量依賴性抑制二甲苯所致小鼠耳廓腫脹，抑制率分別為14.35 %、28.96 %和37.54 %。體外研究發(fā)現(xiàn)，EEBC顯著抑制LPS致Raw264.7細(xì)胞分泌NO，同時(shí)降低 iNOS 的活力，降低炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌，表現(xiàn)出顯著的體外抗炎活性。因此，射干具有較好的抗炎作用，但其抗炎物質(zhì)基礎(chǔ)需要進(jìn)一步研究和探討。

綜上所述，本研究表明射干乙醇提取物具有顯著的鎮(zhèn)痛和抗炎活性，這一結(jié)果支持了射干的在我國民間的一些傳統(tǒng)用法，如清熱解毒、散結(jié)消炎、消腫止痛、止咳化痰等。然而，射干提取物抗炎鎮(zhèn)痛有效成分、活性成分的臨床前藥理毒理、生物利用度等體內(nèi)相關(guān)的作用機(jī)制還不清楚，尚待進(jìn)一步深入研究。