腳橋被蓋網(wǎng)狀核在全身麻醉覺醒調(diào)控中的作用機(jī)制研究

鄭 達(dá)，陳飄雨，趙 嬌，劉 俊，李瓊艷，袁 杰

(1.遵義醫(yī)科大學(xué) 貴州省麻醉與器官保護(hù)基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563099;2.貴州省普通高等學(xué)校腦科學(xué)特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563099;3.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 疼痛科，貴州 遵義 563099)

近年研究發(fā)現(xiàn)，全身麻醉藥導(dǎo)致的意識消失-恢復(fù)與自然睡眠-覺醒之間有相似之處。影像學(xué)研究顯示，非快動(dòng)眼睡眠(Non-rapid eye movement sleep,NREM sleep)較覺醒狀態(tài)(Waking state)時(shí)腦干區(qū)(腳橋被蓋網(wǎng)狀核所在腦區(qū))、基底前腦、丘腦、以及楔前葉和后扣帶回皮質(zhì)等腦區(qū)顯著失活(Deactivation)，這與在全身麻醉狀態(tài)下觀察到的大腦活動(dòng)情況相似[1-3]。腦電圖研究發(fā)現(xiàn)，丙泊酚麻醉下，下丘腦(結(jié)節(jié)乳頭體核所在腦區(qū))、前額葉皮質(zhì)、楔前葉及后扣帶回皮質(zhì)是清醒狀態(tài)時(shí)最為活躍的腦區(qū)[4]。此外，參與調(diào)控自然覺醒的功能核團(tuán)幾乎都參與了全身麻醉的意識恢復(fù)過程[5-8]。以上現(xiàn)象和研究結(jié)果提示全身麻醉藥可能通過作用于睡眠-覺醒通路發(fā)揮致意識消失作用。

腳橋被蓋網(wǎng)狀核(Pedunculopontine tegmental nucleus,PPTg)是維持中樞覺醒的關(guān)鍵核團(tuán)之一。位于腦干的PPTg是上行網(wǎng)狀激活系統(tǒng)(Ascending reticular activating system，ARAS)的重要組成部分。已有報(bào)道ARAS關(guān)鍵核團(tuán)藍(lán)斑核參與調(diào)節(jié)丙泊酚全麻后意識恢復(fù)過程[9]，而主要由膽堿能、谷氨酸能和GABA能神經(jīng)元組成的PPTg是否也參調(diào)控全麻后意識恢復(fù)，目前仍不清楚[10]。PPTg發(fā)出密集的膽堿能神經(jīng)纖維經(jīng)腹側(cè)通路投射至TMN、下丘腦外側(cè)區(qū)(Lateral hypothalamic)及基底前腦(Basal forebrain)[11]，通過激活這 3個(gè)核團(tuán)神經(jīng)元產(chǎn)生興奮皮層維持覺醒的作用。此外，PPTg還可通過背側(cè)通路直接作用于丘腦，亦可激活皮層并維持皮層興奮性[12]。Kroeger等[11]等利用化學(xué)遺傳學(xué)技術(shù)(Chemogenetic)發(fā)現(xiàn)，選擇性激活PPTg區(qū)谷氨酸能神經(jīng)元(vGluT2-Cre)可促進(jìn)皮層興奮和行為覺醒，激活膽堿能神經(jīng)元(ChAT-Cre)可抑制NREM睡眠期低頻腦電節(jié)律，而激活GABA能神經(jīng)元(vGAT-Cre)可縮短REM睡眠持續(xù)時(shí)間?？梢?，PPTg區(qū)的 3組異質(zhì)性神經(jīng)元在維持皮層興奮性和調(diào)控睡眠-覺醒狀態(tài)過程中扮演著不同的角色。

本項(xiàng)目假設(shè)PPTg覺醒參與調(diào)控全身麻醉后意識恢復(fù)過程，擬通過行為學(xué)及光纖鈣信號技術(shù)，探索吸入麻醉藥異氟烷對PPTg核團(tuán)電活動(dòng)的影響，從而明確該核團(tuán)影響全麻后意識恢復(fù)的神經(jīng)生理學(xué)機(jī)制以及膽堿能神經(jīng)元所發(fā)揮的作用。借助覺醒來研究全麻后意識恢復(fù)機(jī)制可能為解釋全麻藥物的作用機(jī)理提供新的線索。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級健康雄性C57小鼠購自長沙市天勤生物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號:SCXK(湘)2014-0011。飼養(yǎng)于麻醉實(shí)驗(yàn)室SPF級動(dòng)物房，飼養(yǎng)環(huán)境：不限制小鼠活動(dòng)、飲水、飲食，8～10周，小鼠體重在20～25 g。開燈時(shí)間/關(guān)燈時(shí)間為12 h/12 h，室溫23～26 ℃，相對濕度為60%左右。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 大鼠腦立體定位儀購自USA STOELTING公司；顱骨鉆(FOREDOM,51449)購自瑞沃德生命科技有限公司；手術(shù)操作顯微鏡(PSMB5)購自WPI公司；微量注射泵(WZS-50F6)購自密斯醫(yī)學(xué)儀器有限公司；小鼠麻醉誘導(dǎo)箱、異氟醚麻醉氣體揮發(fā)罐購自瑞沃德生命科技有限公司；CED1401電生理記錄儀、MODEL 3000信號放大器購自Spike 2公司；BX51W1-IR7熒光顯微鏡購自O(shè)lympus公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 利多卡因注射液購自西南藥業(yè)股份有限公司；水合氯醛購自成都市科龍化工試劑廠；AAV-hSyn-Gcamp6s-WPRE-pA Virus購自樞密科技；自凝型義齒基托樹脂購自上海二醫(yī)張江生物材料有限公司；異氟烷購自魯南貝特制藥有限公司；卡巴膽堿、美卡拉明、多聚甲醛購自Sigma公司；磷酸鹽緩沖溶液(PBS)購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 光纖鈣信號模型建立 選取SPF級成年雄性C57鼠16只，體重25～28 g，大鼠10%水合氯醛(0.4 mL/100 g)麻醉后固定于腦立體定位儀上，皮下注射利多卡因(2%)局麻后，手術(shù)暴露顱骨表面。確定Bregma(B)點(diǎn)和Lambda(λ)點(diǎn)位置后，進(jìn)行調(diào)平，高度相差在0.02 mm以內(nèi)。根據(jù)小鼠腦立體定位圖譜定位PPTg區(qū)域(坐標(biāo)：-4.48，±1.2，-4)并行顱骨鉆孔術(shù)，連接微量注射泵與微注射針以100 nL/min速度抽取病毒AAV-hSyn-Gcamp6s-WPRE-pA (300 nL)，再分別緩慢注入單側(cè)PPTg(60 nL/min)。注射針放置10 min后緩慢地撤出，之后插入并固定光纖陶瓷插芯。術(shù)后連續(xù)3 d肌肉注射青霉素鈉(8萬U)，待病毒轉(zhuǎn)染 21 d后進(jìn)行鈣信號光纖記錄。

1.2.2 光纖鈣信號記錄 該技術(shù)基于鈣離子濃度變化的熒光成像技術(shù)，被廣泛用來記錄神經(jīng)元活性，可以實(shí)時(shí)檢測細(xì)胞的活性變化。鈣離子濃度敏感蛋白GCaMPs通過熒光信號強(qiáng)度變化可以表征神經(jīng)元的活性。將GCaMPs表達(dá)到神經(jīng)元中，然后通過光纖激發(fā)GCaMPs的熒光并實(shí)時(shí)監(jiān)測記錄熒光信號強(qiáng)度的方法即光纖記錄。

在多通道光纖鈣信號記錄系統(tǒng)中，采用480 nm激發(fā)LED和分色鏡對GCaMPs的熒光信號進(jìn)行采集。光纖尖端的光功率設(shè)置為20～30 μW以最小化褪色作用。對GCaMPs的熒光信號進(jìn)行40 Hz濾波和500 Hz數(shù)字化處理，然后用軟件進(jìn)行記錄。

清醒狀態(tài)記錄300 s后，在1.4%的異氟烷ISO的誘導(dǎo)箱中觀察，記錄翻正反射(LORR)消失時(shí)間和翻正反射恢復(fù)時(shí)間(RORR)，并于RORR后300 s停止記錄(見圖1)。每組8只，且每組麻醉3次，間隔3 d休息時(shí)間。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死小鼠，冰凍切片腦組織進(jìn)行熒光檢測，以驗(yàn)證病毒的表達(dá)和光纖的植入。

圖1 光纖鈣信號記錄流程

1.2.3 光纖鈣信號分析 光纖測光數(shù)據(jù)被輸出到Matlab2016a進(jìn)行分析。用(F-F0)/ F0表示熒光(ΔF/F) 的變化，其中F是測試熒光信號，F(xiàn)0是基礎(chǔ)信號的均值和標(biāo)準(zhǔn)差。

1.2.4 微注射導(dǎo)管準(zhǔn)備 選取SPF級成年雄性c57鼠16只，體重25～28 g，大鼠10%水合氯醛(0.4 mL/100 g)麻醉后固定于腦立體定位儀上，皮下注射利多卡因(2%)局麻后，手術(shù)暴露顱骨表面。確定Bregma(B)點(diǎn)和Lambda(λ)點(diǎn)位置后，進(jìn)行調(diào)平，高度相差在0.02 mm以內(nèi)。根據(jù)小鼠腦立體定位圖譜定位PPTg區(qū)域(坐標(biāo)：-4.48，±1.2，-4)并行顱骨鉆孔術(shù)，植入微注射導(dǎo)管并固定。術(shù)后連續(xù)3 d肌肉注射青霉素鈉(8萬U)，待組織恢復(fù)14 d后，進(jìn)行微注射行為學(xué)觀察。

1.2.5 給藥后行為學(xué)觀察記錄 將微量注射泵與導(dǎo)管連接，按照分組分批次(1 批/ 3 d)注射生理鹽水、AChRs激動(dòng)劑卡巴膽堿(5 mMol/L)、N-AChR拮抗劑鹽酸美卡拉明(10 μg)，分別在濃度為在1.4%的異氟烷ISO的誘導(dǎo)箱中觀察，流程如圖2，記錄翻正反射(LORR)消失時(shí)間和翻正反射恢復(fù)時(shí)間(RORR)，間隔3 d休息時(shí)間。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死小鼠，冰凍切片腦組織進(jìn)行伊紅染色，以驗(yàn)證導(dǎo)管的植入和藥物的作用位置。

圖2 微注射行為學(xué)記錄流程

2 結(jié)果

2.1 光纖鈣信號實(shí)驗(yàn) 觀察在異氟烷麻醉誘導(dǎo)下調(diào)控PPTg神經(jīng)元活性對全麻后意識消失和恢復(fù)時(shí)間及皮層腦電信號的影響。

2.1.1 光纖鈣信號變化與翻正反射恢復(fù)及消失的記錄 將注入鈣信號病毒的小鼠分別逐個(gè)放入1.4%的ISO中觀察記錄其翻正反射消失時(shí)間(LORR)和翻正反射恢復(fù)時(shí)間(RORR)。光纖測光數(shù)據(jù)被輸出到Matlab2016a進(jìn)行分析。用(F-F0)/F0表示熒光(deltaF/F)的變化。結(jié)果見圖3A～D。鈣信號活性表達(dá)熱圖與LORR、RORR跟蹤啟動(dòng)對齊的信號。每行繪制一條線索，共演示了8個(gè)試驗(yàn)。右側(cè)的色度表示+F/F?！鱂/F表示在給予異氟烷之前，GCAMPs熒光與均值水平的變化反映核團(tuán)活性表達(dá)的變化。

A、B：異氟烷麻醉下，LORR光纖鈣信號活性表達(dá)熱圖及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；C、D： 異氟烷麻醉后恢復(fù)，RORR光纖鈣信號活性表達(dá)熱圖及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；#： 實(shí)驗(yàn)分組；*： P<0.05；**:P<0.01；***:P<0.001。

結(jié)果表明，與基線相比，在異氟烷麻醉誘導(dǎo)下，PPTg核團(tuán)活性由高到低，且時(shí)間越推移，變化越顯著(b.s.vs -50～0 s，P=0.028；b.s.vs 0～100 s，P=0.000 2；-50～0 s vs 0～100 s，P=0.000 4)；而異氟烷麻醉停止后，PPTg核團(tuán)活性由低到高，且隨時(shí)間推移，變化越顯著(b.s.vs -50～0 s，P=0.013 7；b.s.vs 0～100 s，P=0.000 2；-50～0 s vs 0～100 s，P=0.002 9)。這表明PPTg核團(tuán)確實(shí)參與了異氟烷麻醉誘導(dǎo)的全麻后意識消失與恢復(fù)，發(fā)揮一定的調(diào)控作用。

2.1.2 腦組織切片染色和驗(yàn)證 灌注固定取腦，光纖測定鈣信號活性實(shí)驗(yàn)的小鼠腦組織切片并熒光染色后在熒光顯微鏡下觀察，驗(yàn)證病毒的表達(dá)和光纖植入位置。圖4A顯示，PPTg核團(tuán)處顯示熒光，病毒已表達(dá)，光纖植入位置正確。微注射行為學(xué)觀察實(shí)驗(yàn)的小鼠腦組織切片并伊紅染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察，驗(yàn)證微注射位置。圖4B顯示，微注射痕跡位于PPTg核團(tuán)區(qū)域內(nèi)，微注射位置正確。

A：在小鼠PPTg處AAV-hSyn-GCaMPs病毒注射和光纖植入位置驗(yàn)證，放大倍數(shù)為10×4；B：小鼠PPTg處微注射位置驗(yàn)證，放大倍數(shù)為10×4。

2.2 行為學(xué)實(shí)驗(yàn) 觀察激動(dòng)和拮抗PPTg膽堿能神經(jīng)元對全麻后LORR和RORR的影響。在小鼠PPTg微注射生理鹽水、AChRs激動(dòng)劑卡巴膽堿(5 mMol/L)、N-AChR拮抗劑鹽酸美卡拉明(10 μg)，分別在濃度為1.4%的異氟烷吸入下全身麻醉，觀察并記錄LORR和RORR。

結(jié)果表明：組內(nèi)對照，空白組RORR時(shí)間(207.44±78.61)s和LORR時(shí)間(81.67±9.89)s，激動(dòng)組RORR時(shí)間(161.66±87.59)s較LORR時(shí)間(92.11±12.6)s長，而拮抗組RORR時(shí)間(100.89±44.13)s則與LORR時(shí)間(96.33±29.49)s相差不大。經(jīng)單因素方差分析，LORR時(shí)間 3組對照無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.27)，但RORR時(shí)間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.007)。分析可知，激動(dòng)膽堿能神經(jīng)可縮小C57小鼠麻醉與蘇醒時(shí)間的差距，拮抗膽堿能神經(jīng)則將這種差距縮小得更明顯。組間對照，激動(dòng)組和拮抗組較空白組都延長了一定的LORR時(shí)間，而RORR時(shí)間則縮短。

A： LORR時(shí)間，P>0.05；B： RORR時(shí)間；**： n.s vs antagonist P<0.05,n=8。

3 討論

光纖鈣信號記錄實(shí)驗(yàn)中，小鼠在ISO的麻醉誘導(dǎo)條件下，出現(xiàn)LORR和RORR的行為學(xué)表現(xiàn)，通過PPTg核團(tuán)位置的GCaMPs的熒光信號改變反映其神經(jīng)元活性表達(dá)情況。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果鈣信號活性表達(dá)熱圖的色條變化以及統(tǒng)計(jì)學(xué)差異性分析顯示，在全身麻醉過程中，小鼠出現(xiàn)LORR時(shí)，PPTg核團(tuán)的神經(jīng)元的活性下降，表明PPTg核團(tuán)的神經(jīng)元被抑制；當(dāng)小鼠出現(xiàn)RORR后PPTg核團(tuán)的神經(jīng)元的活性恢復(fù)，表明PPTg核團(tuán)的神經(jīng)元被激活，這提示PPTg核團(tuán)的神經(jīng)元可能參與了全身麻醉的調(diào)控。

微注射行為學(xué)實(shí)驗(yàn)中，通過微注射不同試劑對PPTg核團(tuán)的膽堿能神經(jīng)元功能起到促進(jìn)和抑制作用。小鼠在ISO的麻醉誘導(dǎo)條件下，通過記錄其行為學(xué)表現(xiàn)自身對照的時(shí)間變化，發(fā)現(xiàn)只有RORR過程中使用膽堿能抑制劑后與使用膽堿能激動(dòng)劑后之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.007)，這提示PPTg核團(tuán)的膽堿能神經(jīng)元可能主要在全麻后意識恢復(fù)期間發(fā)揮促進(jìn)意識恢復(fù)的作用，但RORR組中進(jìn)行處理的結(jié)果與空白對照沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，該結(jié)果可能由實(shí)驗(yàn)過程中存在的誤差以及可能存在不同蘇醒過程的神經(jīng)通路所導(dǎo)致，其中Kroeger等[11]激活PPTg核團(tuán)的膽堿能神經(jīng)元發(fā)現(xiàn)可通過抑制NREM睡眠期低頻腦電節(jié)律以促進(jìn)蘇醒。而在異氟烷麻醉誘導(dǎo)過程中，對小鼠LORR時(shí)間沒有影響的結(jié)果提示PPTg核團(tuán)的膽堿能神經(jīng)元可能主要參與了異氟烷麻醉的蘇醒過程，而非誘導(dǎo)過程，另外Zhou 等[13]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，毀損大鼠VTA內(nèi)的多巴胺能神經(jīng)元可顯著延長丙泊酚麻醉蘇醒時(shí)間，但對LORR也無明顯影響。本實(shí)驗(yàn)證明PPTg核團(tuán)中膽堿能神經(jīng)元參與調(diào)節(jié)了全麻后意識恢復(fù)過程的神經(jīng)通路。

全身麻醉藥異氟烷致意識消失期間，PPTg核團(tuán)神經(jīng)元活性下降，意識恢復(fù)期間活性上升。這提示了PPTg核團(tuán)神經(jīng)元參與全身麻醉藥致意識改變的恢復(fù)過程；其中膽堿能神經(jīng)元主要參與全麻蘇醒并發(fā)揮促覺醒作用。PPTg核團(tuán)中谷氨酸能與GABA能神經(jīng)元是否參與調(diào)控全麻意識消失與覺醒，仍有待進(jìn)一步研究。