聽覺剝奪對成年雄性斑胸草雀鳴唱行為和LMAN核團的影響

劉鐘澤，孫穎郁，張信文，楊思遠

（1.熱帶島嶼生態(tài)學(xué)教育部重點實驗室，海南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，海南 海口 571158；2.海南科技職業(yè)大學(xué)，海南 ?？?571126；3.北京師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，北京 100875）

自然界中許多動物可以通過聲音進行交流，例如鯨，蝙蝠等[1]，但這些發(fā)聲行為并不是通過學(xué)習(xí)產(chǎn)生的。鳴禽是除了人類以外極少具有發(fā)聲學(xué)習(xí)能力的動物，鳥類具有鳴叫（call）和鳴唱（sing）兩種發(fā)聲行為，其叫聲中包含有豐富的生物學(xué)信息，被用來進行個體及種群之間的識別、求偶、覓食、報警、筑巢等活動，被稱為鳥類的語言[2]。與人類的語言相似，鳴禽的鳴唱是一種依賴于聽覺反饋的后天習(xí)得發(fā)聲行為。幼鳥如果錯過了學(xué)習(xí)鳴唱的特定時期，成年之后可能出現(xiàn)鳴唱障礙，成年雄鳥仍需聽覺反饋維持其結(jié)晶化鳴唱。所以，鳴禽作為研究感覺與運動信息整合的模型，其鳴唱行為的學(xué)習(xí)過程和神經(jīng)控制機制與人類具有相似性[3]，研究鳴禽發(fā)聲控制中樞可塑性對于揭示人類語言學(xué)習(xí)的神經(jīng)機制具有重要意義。

斑胸草雀（Taeniopygia guttata）作為模式動物，被廣泛用于習(xí)得發(fā)聲行為的研究，其鳴唱系統(tǒng)是由腦中一系列不同水平、界限清楚且離散分布的特定核團構(gòu)成的神經(jīng)通路[4]。發(fā)聲運動通路（Vocal Motor Pathway，VMP）由端腦的高級發(fā)聲中樞（High Vocal Control Center，HVC）投射神經(jīng)纖維下行經(jīng)過古紋狀體櫟核（Robustus Archistriatalis，RA）最后投射到延髓，通過低位運動中樞舌下神經(jīng)核鳴管支nXIIts核團支配鳴肌從而控制發(fā)聲。發(fā)聲學(xué)習(xí)通路（Anterior Forebrain Pathway，AFP）是從HVC投射神經(jīng)纖維經(jīng)過前腦X區(qū)（Area X）、丘腦背外側(cè)核內(nèi)側(cè)部DLM（Medial portion of the dorsolateral nucleus of the anterior thalamus）、新紋狀體前部巨細胞核外側(cè)部（Lateral portion of the Magnocellular nucleus of the Anterior NeostriatumLMAN），最后至RA 形成的環(huán)路，主要參與鳴唱可塑性[5-9]。

LMAN核團是AFP通路的最后一個輸出核團，很可能與鳴唱的學(xué)習(xí)和鳴曲可塑性有關(guān)[10]。幼年時期損毀LMAN核團會使鳴唱提前穩(wěn)定（Crystallization），從而阻斷鳴唱學(xué)習(xí)[11]。成年時期損毀LMAN核團短期內(nèi)幾乎不影響其鳴曲結(jié)構(gòu)，但在致聾前損毀LMAN核團，可以有效阻止鳴唱的退化[12]。然而在成年致聾斑胸草雀的鳴唱退化過程中，致聾對LMAN的影響和LMAN核團的工作機制仍不完全清楚。因此，本實驗旨在通過對成年雄性斑胸草雀進行聽覺剝奪，檢測鳴禽鳴唱行為以及腦內(nèi)LMAN核團的變化，探究LMAN核團在鳴禽發(fā)聲系統(tǒng)中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

選擇8只鳴唱較好的成年雄性斑胸草雀（＞90 PHD）為實驗動物，4只為對照組，4只為致聾組。實驗動物的使用符合國家和學(xué)校動物倫理委員會規(guī)定并遵守國際慣例。整個實驗過程中，所有的實驗動物養(yǎng)育在同一環(huán)境，并保持致聾組手術(shù)后14 d內(nèi)連續(xù)錄音。

0.96%戊巴比妥鈉，20%氨基甲酸乙酯，4%多聚甲醛（PFA），NaCl，0.2 mol/L 磷酸緩沖液（PB，pH 7.4），無水乙醇，二甲苯，0.1%焦油紫染液，Enpon812中性樹膠等均購自北京化學(xué)試劑公司。

1.1.3 儀器

電子天平，Sartorius AL104；低溫恒冷切片機，Leica CM1850；體視鏡及冷光源，北京市科儀電光儀器廠XTT-AB；錄音聲卡，F(xiàn)ocusrite Scarlett 2i4；恒流泵，保定蘭格恒流原有限公司，BT50-1J；光學(xué)顯微鏡及攝像系統(tǒng)，Olympus CX31；倒置熒光顯微鏡，Zeiss ObserverZ1。

1.2 方法

1.2.1 聽覺剝奪手術(shù)

實驗動物斷水?dāng)嗍? h后，胸大肌注射戊巴比妥鈉（0.5 g/kg）進行麻醉，剝離雙側(cè)耳蝸致聾，在顯微鏡下觀察剝離的雙側(cè)耳蝸是否完整。對照組進行假手術(shù)，采用與致聾組相同的麻醉過程，也將表面皮膚剪開，但不將鼓膜捅破，也不將耳蝸拔除，進行假手術(shù)的目的是為了避免手術(shù)本身對實驗結(jié)果的影響。術(shù)后確保手術(shù)鳥處在清潔和溫暖的環(huán)境中，供給足夠的食物和清水，對照組與致聾組手術(shù)后在同一環(huán)境連續(xù)養(yǎng)育14 d。

1.2.2 灌流與切片

致聾組與對照組手術(shù)后在同一環(huán)境連續(xù)養(yǎng)育14 d后，胸大肌注射氨基甲酸乙酯（2.5 g/kg）進行麻醉，使用恒流泵以22 rpm流速向左心室中泵入4%多聚甲醛溶液固定5 min，隨后剪下頭部，剝離全腦并將其置于4%多聚甲醛溶液中固定6 h，再轉(zhuǎn)移到30%蔗糖溶液中4 ℃過夜至腦沉底。利用低溫恒冷切片機冠狀切片，片厚為10 μm，平行取6套（平行切取6片后舍棄6片，再平行切取6片），-20 ℃保存。

1.2.3 焦油紫染色

設(shè)計意圖：通過討論與交流，學(xué)生逐漸形成基于事實證據(jù)，分析生物規(guī)律，理解生命本質(zhì)的科學(xué)思維。教師充分利用實驗資料，在學(xué)生原有認知上挖掘深層知識，初步滲透科學(xué)探究的方法教育。

上述切片在0.1%焦油紫染液中孵育7 min后，在70%乙醇中浸泡3 min。接著用95%乙醇浸泡兩次，每次1 min。然后用100%乙醇浸泡三次，每次1 min。最后用二甲苯處理兩次，每次5 min，中性樹膠封片。

1.2.4 NeuN免疫組織化學(xué)標記

將1.2.2節(jié)得到的切片在0.01 mol/L PBS漂洗3次，每次5 min。然后在3%正常羊血清（0.5%TritonX-100/PBS 稀釋，ZLI-9021，Jackson）室溫封閉30 min；最后用一抗小鼠抗NeuN 抗體（1∶400，MAB377，Millipore），4 ℃孵育過夜。次日將切片在室溫中再孵育2 h；用0.01 mol/L PBS 漂洗3 次，每次5 min；然后用二抗Alexa fluor 488標記的山羊抗小鼠IgG抗體（1∶200，A11005，Invitrogen）在室溫孵育2 h；最后用0.01 mol/L PBS漂洗5次，每次5 min；用抗熒光淬滅封片劑封片。

1.2.5 聲譜分析

雄性斑胸草雀的鳴曲由重復(fù)出現(xiàn)的短語組成，每個短語包含多個按照一定順序排列的音節(jié)。使用Sound Analysis Pro（SAP 2011）軟件錄制和分析斑胸草雀的鳴曲。手術(shù)前后，選取鳴曲中同一個短語作為檢測對象，每只動物統(tǒng)計處死當(dāng)天和手術(shù)前兩天的鳴曲，每天統(tǒng)計30 個該重復(fù)短語，分析每個音節(jié)平均熵值（Mean Entropy）和熵值變異數(shù)（Entopy Variance）等參數(shù)。

1.2.6 核團面積和體積分析

采用Olympus顯微鏡觀察經(jīng)焦油紫染色的雄性斑胸草雀腦切片并采集LMAN核團圖像。LMAN核團的邊界在4倍物鏡下清晰可見，用ImageJ 12.0軟件統(tǒng)計核團面積。LMAN 核團體積用切片上LMAN 核團的平均面積與切片數(shù)的乘積表示[13]，即V = S·N·h，其中，V為LMAN核團的體積（mm3）；S為切片上LMAN核團的平均面積（mm2）；h為一套切片上相鄰腦片間的距離（120 μm）；N為一套切片上含有LMAN核團的腦片總數(shù)。

1.2.7 核團神經(jīng)元面密度分析

采用Zeiss 倒置熒光顯微鏡對經(jīng)NeuN 免疫組織化學(xué)標記的雄性斑胸草雀腦切片進行拼圖拍照，采集LMAN核團圖像。LMAN核團內(nèi)神經(jīng)元在20倍物鏡下清晰可見，用Adobe Photoshop軟件對核團內(nèi)神經(jīng)元進行3個100 μm×100 μm視野的取樣統(tǒng)計，獲得NeuN免疫組織化學(xué)標記下LMAN核團神經(jīng)元面密度的數(shù)據(jù)。

1.2.8 統(tǒng)計分析

應(yīng)用SPSS 12.0（SPSS，Chicago，IL）和Graphpad prism 5.0（Graphpad Software，San Diego，CA）軟件進行數(shù)據(jù)分析。用獨立樣本t檢驗分析致聾前后鳴唱音節(jié)參數(shù)、LMAN核團平均面積和體積以及神經(jīng)元面密度的差異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 聽覺剝奪引起成年雄性斑胸草雀鳴唱行為的退化

聲譜分析結(jié)果（見圖1）顯示，對照組動物手術(shù)前后音節(jié)結(jié)構(gòu)保持不變（左列），而致聾組動物手術(shù)前后短語和音節(jié)結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化（右列），鳴曲聲譜結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著畸變和短語丟失。

2.2 聽覺剝奪前后成年雄性斑胸草雀音節(jié)參數(shù)的變化

為了檢測致聾對鳴唱行為的影響，本研究分析了致聾前后音節(jié)平均熵值和熵值變異數(shù)的變化，結(jié)果見圖2。與對照組相比，致聾組手術(shù)后14 d 音節(jié)平均熵值與基線的百分比顯著減小（P ＜0.05）（對照組為104.39±1.91%，致聾組為94.49±3.14%），熵值變異數(shù)與基線的百分比顯著減小（P ＜0.05）（對照組為88.63±3.94%，致聾組為75.03±2.98%）。

2.3 聽覺剝奪誘導(dǎo)成年雄性斑胸草雀LMAN核團平均面積和體積的變化

圖1 對照組和致聾組實驗鳥手術(shù)前后鳴曲聲譜結(jié)構(gòu)的變化Figure 1 Changes of the sonographic structure of song in control group and deafening group before and after surgery

圖2 致聾前后熵值和熵值變異數(shù)的定量分析Figure 2 Quantitative analysis of entropy and entropy variance before and after deafness

焦油紫染色結(jié)果顯示，LMAN核團染色較深，邊界清晰，胞體清晰可見，多為梭形、多角形或橢圓形，如圖3 所示。圖4（A）可以看出，對照組LMAN 核團的平均面積為（0.0681±0.0012）mm2，致聾組LMAN 核團的平均面積為（0.0621±0.0011）mm2，顯示致聾組切片上LMAN核團的平均面積有明顯減小的趨勢（與對照組相比），數(shù)據(jù)統(tǒng)計有顯著性差異（P ＜0.05）。LMAN核團體積在致聾前后的變化如圖4（B）所示，對照組LMAN核團體積為（0.0629±0.0011）mm3，致聾組LMAN核團體積為（0.0549±0.0014）mm3，表明致聾組LMAN核團的體積與對照組相比也存在明顯減小的趨勢，數(shù)據(jù)統(tǒng)計有顯著性差異（P ＜0.05）。

圖3 聽覺剝奪對LMAN核團橫截面積的影響Figure 3 Effects of auditory deprivation on the cross-sectional area of the LMAN nucleus

2.4 聽覺剝奪誘導(dǎo)成年雄性斑胸草雀LMAN核團神經(jīng)元面密度的變化

圖4 致聾前后LMAN核團平均面積和體積的比較Figure 4 Comparison of the mean area and volume of LMAN nuclei before and after deafness

NeuN免疫組織化學(xué)標記結(jié)果顯示，LMAN核團染色特異性較低，邊界不清晰，因此使用Adobe Photoshop軟件對LMAN 核團內(nèi)細胞進行100 μm × 100 μm 3 個視野的取樣統(tǒng)計，獲得NeuN 免疫組織化學(xué)標記下LMAN核團內(nèi)細胞面密度的數(shù)據(jù)，可以看到在100 μm×100 μm的取樣統(tǒng)計視野中，LMAN核團內(nèi)細胞的胞體清晰可見，便于統(tǒng)計，如圖5所示。應(yīng)用SPSS 12.0（SPSS，Chicago，IL）和Graphpad prism5.0（Graphpad Software，San Diego，CA）軟件對LMAN 核團內(nèi)細胞面密度進行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果（見圖6）顯示，對照組LMAN 核團內(nèi)的細胞面密度為（16.24±0.18）個/0.01 mm2，致聾組LMAN 核團內(nèi)的細胞面密度為（12.18±0.16）個/0.01 mm2，致聾前后LMAN核團內(nèi)的細胞面密度存在差異。與對照組相比，致聾組LMAN核團內(nèi)的細胞面密度明顯較小，數(shù)據(jù)統(tǒng)計具有顯著性差異（P ＜0.05）。

圖5 聽覺剝奪對LMAN核團內(nèi)細胞面密度的影響Figure 5 Effects of auditory deprivation on the cellular surface density in LMAN nuclei

圖6 致聾組與對照組LMAN核團內(nèi)細胞面密度的比較Figure 6 Comparison of cellular surface density before and after deafness in LMAN nuclei

3 討論

已有學(xué)者研究表明，幼年斑胸草雀在受到噪音等異常的聽覺干擾時，鳴曲結(jié)構(gòu)（syllable structure）或序列（syllable sequence）會發(fā)生明顯的變化，但這些變化是可逆的，去除異常噪音反饋后鳴曲的音節(jié)結(jié)構(gòu)或音節(jié)序列可恢復(fù)到正常水平[14]，聽覺反饋在鳴曲產(chǎn)生和學(xué)習(xí)過程發(fā)揮主要作用。本實驗中，成年雄性斑胸草雀在聽覺剝奪手術(shù)后14 d，鳴唱行為發(fā)生了顯著的變化，音節(jié)參數(shù)方面主要表現(xiàn)為熵值和熵值變異數(shù)與基線的百分比明顯減小。熵是熱力學(xué)中表征物質(zhì)狀態(tài)的參量之一，因此熵值是衡量鳴曲結(jié)構(gòu)混亂程度的重要音節(jié)參數(shù)。致聾14 d后熵值顯著增大[8]，說明聽覺剝奪能夠誘導(dǎo)成年雄性斑胸草雀的鳴曲趨向于更加混亂和不穩(wěn)定，造成已結(jié)晶化的鳴曲結(jié)構(gòu)出現(xiàn)一定程度的退化，表明即使是臨界型鳴禽，成年后穩(wěn)定的鳴曲也仍需要聽覺反饋來維持，一旦失去聽覺反饋，鳴禽就無法修正和匹配自身鳴曲，進而造成鳴唱行為的退化，導(dǎo)致致聾鳥變成為聾啞鳥，提示聽覺反饋在維持鳴曲的復(fù)雜性中發(fā)揮重要的功能。

鳴禽鳴唱學(xué)習(xí)的神經(jīng)基礎(chǔ)是腦內(nèi)的鳴唱控制系統(tǒng)，前人研究認為VMP通路在鳴禽學(xué)習(xí)過程中對鳴曲的穩(wěn)定性具有重要作用[6，9]。本實驗初步統(tǒng)計與分析致聾14 d后LMAN核團的平均面積和體積有明顯減小的趨勢，LMAN核團內(nèi)的細胞面密度下降，說明了致聾導(dǎo)致的成年雄性斑胸草雀鳴唱行為的畸變，可能與致聾所導(dǎo)致其腦內(nèi)發(fā)聲學(xué)習(xí)通路中的輸出核團LAMN核團的退化有一定的的關(guān)系，這些結(jié)果為了解致聾后聾啞變化可能的機理提供一定的基礎(chǔ)資料，但其具體機制仍有待進一步研究和探討。本實驗樣本量較小，后續(xù)實驗需要增加動物樣本量并進一步測定LMAN核團的超微結(jié)構(gòu)變化以獲得LMAN核團形態(tài)大小的確切變化。