基于分光光度法快速檢測果蔬中的擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留

◎ 何麗媛，倪樹標(biāo)，武悅俊，張紅剛

（廣東省科學(xué)院測試分析研究所（中國廣州分析測試中心），廣東省化學(xué)測量與應(yīng)急檢測技術(shù)重點實驗室，廣東省食品營養(yǎng)與安全快速檢測儀器工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510070）

我國是一個農(nóng)業(yè)生產(chǎn)大國，蔬菜水果產(chǎn)量大，但生產(chǎn)方式主要以農(nóng)戶分散種植為主，往往存在盲目使用、過量使用、不按安全間隔期使用農(nóng)藥等不規(guī)范情況，從而造成了蔬菜水果中的農(nóng)藥殘留問題[1]。調(diào)查表明，檢出率較高的農(nóng)藥主要為擬除蟲菊酯類、有機磷類和氨基甲酸酯類農(nóng)藥[2-4]。由于蔬菜水果的產(chǎn)量大、生產(chǎn)分散、銷售期短，且專業(yè)技術(shù)強、成本高、檢測時間長，實驗室檢測技術(shù)根本無法滿足蔬菜水果的全面監(jiān)測，因此農(nóng)藥殘留快速檢測技術(shù)是我國食品安全監(jiān)管的主要技術(shù)手段。而擬除蟲菊酯類農(nóng)藥已成為第二大類除蟲劑，其使用量約占所有農(nóng)藥使用量的1/4[5]，且其對哺乳動物具有神經(jīng)毒性，對生殖系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)也都有毒害作用[6-8]。因此研究擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留的快速檢測方法，對進一步實施食用農(nóng)產(chǎn)品的全面監(jiān)測具有重要意義。

酶抑制法是根據(jù)農(nóng)藥對酶的抑制作用來測定農(nóng)藥的殘留量，農(nóng)藥殘留量越大，產(chǎn)生的抑制作用越強，酶水解底物的能力越弱。李玉蘭[9]研究發(fā)現(xiàn)多種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥對特定羧酸酯酶均具有明顯抑制作用。羧酸酯酶（Carboxlesterase，CaEs，EC3.1.1.1）屬于α/β折疊水解酶家族，在水存在的條件下能夠水解代謝帶羧基的酯[10]。它在哺乳動物體內(nèi)分布廣泛，主要存在于肝臟和血清中。羧酸酯酶對α-乙酸萘酯具有較高的水解活性，其水解產(chǎn)物α-萘酚與顯色劑固藍(lán)B鹽偶氮化反應(yīng)生成紅色物質(zhì)，反應(yīng)式如圖1所示[11]。

圖1 羧酸酯酶對α-乙酸萘酯的水解及顯色反應(yīng)式圖

本文選用豬肝羧酸酯酶作為工作酶，α-乙酸萘酯為反應(yīng)底物，固藍(lán)B鹽為顯色劑，十二烷基硫酸鈉（SDS）為終止劑，加入擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留抑制豬肝羧酸酯酶，利用分光光度法測定酶的活性變化，利用擬除蟲菊酯類農(nóng)藥對豬肝羧酸酯酶的抑制效果，從而快速檢測果蔬中的擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

豬肝羧酸酯酶（3.5 KU），SIGMA-ALDRICH；α-乙酸萘酯（≥98%）、固藍(lán)B鹽、α-萘酚，北京伊諾凱科技有限公司；十二烷基硫酸鈉(SDS)，西亞試劑；聯(lián)苯菊酯標(biāo)準(zhǔn)品（≥99.3%），廣州佳途科技股份有限公司；甲氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)品（≥99%），中國計量科學(xué)研究院；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、濃鹽酸（12 mol·L-1）、無水乙醇，廣州化學(xué)試劑廠。

1.1.2 儀器與設(shè)備

紫外可見分光光度計（島津UV-2450），島津；多功能食品安全檢測儀（GC-600E），中國廣州分析測試中心；萬分位天平（BSM220.4），上海卓精電子科技有限公司；pH計（雷磁PHS-3G），上海儀電科學(xué)儀器；電熱恒溫水浴鍋，北京精科華瑞儀器有限公司；渦旋混勻器（XK80-A），江蘇新康醫(yī)療器械有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 溶液的配制

（1）PBS（pH=6.5）。分別稱取11.9 g無水磷酸氫二鈉和3.2 g磷酸二氫鈉，加入蒸餾水溶解定容至1 000 mL，使用pH計緩慢加入6 mol·L-1鹽酸調(diào)節(jié)pH=6.5。

（2）酶液。稱取10 mg豬肝羧酸酯酶，PBS溶解并定容至10 mL，配置成1 mg·mL-1酶儲存液，4 ℃冰箱保存，臨用前用PBS稀釋至所需濃度。

（3）底物。稱取0.285 0 g α-乙酸萘酯溶于無水乙醇，并定容至100 mL得到0.015 mol·L-1α-乙酸萘酯溶液；臨用前用無水乙醇稀釋至所需濃度；底物現(xiàn)配現(xiàn)用。

（4）顯色劑。稱取50 mg固藍(lán)B鹽溶于蒸餾水，并定容至10 mL，配制成0.5%固藍(lán)B鹽儲存溶液，避光并放置4 ℃冰箱保存；臨用前用蒸餾水稀釋至所需濃度。

（5）終止劑。稱取10 g SDS溶解于40 g蒸餾水中配制成20% SDS溶液，移取2.5 mL、5 mL、7.5 mL 20% SDS溶液稀釋定容至10 mL制備成5%、10%、15% SDS溶液。

（6）α-萘酚系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制。稱取0.144 g α-萘酚溶于丙酮，并定容至10 mL，得到0.1 mol·L-1α-萘酚溶液；移取 100 μL 0.1mol·L-1α-萘酚溶液使用丙酮稀釋定容至10 mL，得到1×10-3mol·L-1α-萘酚溶液；臨用前用丙酮稀釋至所需濃度。

（7）聯(lián)苯菊酯標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制。稱取10 mg聯(lián)苯菊酯溶于甲醇，并定容至10 mL，配制成1 mg·mL-1聯(lián)苯菊酯標(biāo)準(zhǔn)溶液；移取800 μL 1 mg·mL-1聯(lián)苯菊酯標(biāo)準(zhǔn)溶液，使用甲醇稀釋定容至100 mL，得到8 μg·mL-1聯(lián)苯菊酯儲備液；臨用前用甲醇稀釋至所需濃度。

（8）甲氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制。稱取10 mg甲氰菊酯溶于甲醇，并定容至10 mL，配制成1 mg·mL-1甲氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)溶液；移取800 μL1 mg·mL-1甲氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)溶液，使用甲醇稀釋定容至100 mL，得到8 μg·mL-1甲氰菊酯儲備液；臨用前用甲醇稀釋至所需濃度。

（9）6 mol·L-1鹽酸。濃鹽酸（12 mol·L-1）與蒸餾水1∶1混合。

1.2.2 產(chǎn)物最大吸收波長的確定

在紫外可見分光光度計400～700 nm掃描α-萘酚與顯色劑固藍(lán)B鹽偶氮化反應(yīng)生成紅色物質(zhì)的吸收光譜，確定水解產(chǎn)物α-萘酚用分光光度法的最佳測定波長。

1.2.3 終止劑SDS的確定

分 別 移 取 4.0 mL PBS、0.25 mL 4×10-4mol·L-1α-萘酚標(biāo)準(zhǔn)工作溶液加入離心管中混合均勻，然后加入0.25 mL不同濃度的終止劑（0%、5%、10%、15%和20%的SDS），0.25 mL顯色劑（固藍(lán)B鹽），渦旋混勻30 s，加入0.25 mL的6 mol·L-1鹽酸，搖勻后吸取3 mL待測液于比色皿中，放入多功能食品安全檢測儀中，在最佳檢測波長下測定吸光度值，確定終止劑的最佳濃度。

1.2.4 顯色劑固蘭B鹽的確定

分別移取4.0 mL PBS、0.25 mL α-萘酚標(biāo)準(zhǔn)工作溶液加入離心管中混合均勻，然后加入0.25 mL終止劑（SDS），0.25 mL不同濃度顯色劑（0.03%、0.04%、0.05%和0.06%固蘭B鹽），渦旋混勻30 s，加入0.25 mL的6 mol·L-1鹽酸，搖勻后吸取3 mL待測液于比色皿中，放入多功能食品安全檢測儀中，在最佳檢測波長下測定吸光度值，確定顯色劑的最佳濃度。

1.2.5 α-萘酚顯色反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別移取4.0 mL PBS、0.25 mL系列α-萘酚標(biāo)準(zhǔn)工作溶液加入離心管中混合均勻，然后加入0.25 mL終止劑（SDS），0.25 mL顯色劑（固藍(lán)B鹽），渦旋混勻30 s，加入0.25 mL的6 mol·L-1鹽酸，搖勻后吸取3 mL待測液于比色皿中，放入多功能食品安全檢測儀中，在最佳檢測波長下測定吸光度值，繪制α-萘酚顯色反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.6 底物最佳濃度的確定

分別移取 50 μL 4 μg·mL-1酶液、3.95 mL PBS、0.25 mL 不同濃度底物（0 mol·L-1、3×10-4mol·L-1、7.5×10-4mol·L-1及 15×10-4mol·L-1α-乙酸萘酯）加入離心管中混合均勻，在40 ℃水浴中加熱15 min，然后加入0.25 mL終止劑（SDS），0.25 mL顯色劑（固藍(lán)B鹽），渦旋混勻30 s，加入0.25 mL的6 mol·L-1鹽酸，搖勻后吸取3 mL待測液于比色皿中，放入多功能食品安全檢測儀中，在最佳檢測波長下測定吸光度值，確定最佳底物濃度。

1.2.7 酶液最佳濃度的確定

分別移取 50 μL 不同濃度酶液（0 μg·mL-1、1 μg·mL-1、3 μg·mL-1、5 μg·mL-1及 7 μg·mL-1豬 肝 羧 酸 酯）、3.95 mL PBS、0.25 mL底物（α-乙酸萘酯）加入離心管中混合均勻，在40 ℃水浴中加熱15 min，然后加入0.25 mL終止劑（SDS），0.25 mL顯色劑（固藍(lán)B鹽），渦旋混勻30 s，加入0.25 mL的6 mol·L-1鹽酸，搖勻后吸取3 mL待測液于比色皿中，放入多功能食品安全檢測儀中，在最佳檢測波長下測定吸光度值，確定最佳酶液濃度。

1.2.8 最佳反應(yīng)溫度的確定

分別移取50 μL酶液（豬肝羧酸酯）、3.95 mL PBS、0.25 mL底物（α-乙酸萘酯）加入離心管中混合均勻，在不同溫度下（30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃以及60 ℃）水浴加熱15 min，然后加入0.25 mL終止劑（SDS），0.25 mL顯色劑（固藍(lán)B鹽），渦旋混勻30 s，加入0.25 mL的6 mol·L-1鹽酸，搖勻后吸取3 mL待測液于比色皿中，放入多功能食品安全檢測儀中，在最佳檢測波長下測定吸光度值，確定最佳反應(yīng)溫度。

1.2.9 最佳顯色反應(yīng)時間的確定

分別移取50 μL酶液（豬肝羧酸酯）、3.95 mL PBS、0.25 mL底物（α-乙酸萘酯）加入離心管中混合均勻，在最佳反應(yīng)溫度下水浴加熱15 min，然后加入0.25 mL終止劑（SDS），0.25 mL顯色劑（固藍(lán)B鹽），渦旋混勻，顯色反應(yīng)不同的時間（15 s、30 s、60 s、90 s以及120 s），加入0.25 mL的6 mol·L-1鹽酸，搖勻后吸取3 mL待測液于比色皿中，放入多功能食品安全檢測儀中，在最佳檢測波長下測定吸光度值，確定最佳顯色反應(yīng)時間。

1.2.10 擬除蟲菊酯類農(nóng)藥對酶的抑制效果

分別移取50 μL酶液（豬肝羧酸酯）、3.7 mL PBS、0.25 mL不同濃度的擬除蟲菊酯類農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)工作液（聯(lián)苯菊酯或甲氰菊酯）加入離心管中，混合均勻，渦旋30 s，靜置10 min；加入0.25 mL底物（α-乙酸萘酯）混合均勻，在最佳反應(yīng)溫度下水浴加熱15 min，然后加入0.25 mL終止劑（SDS），0.25 mL顯色劑（固藍(lán)B鹽），渦旋混勻30 s，加入0.25 mL的6 mol·L-1鹽酸，搖勻后吸取3 mL待測液于比色皿中，放入多功能食品安全檢測儀中，在最佳檢測波長下測定吸光度值，測定聯(lián)苯菊酯對酶的抑制效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)物最大吸收波長的測定

按1.2.2方法進行測定，結(jié)果見圖2。

圖2 α-萘酚與固藍(lán)B鹽顯色反應(yīng)的吸收光譜圖

由圖2可知，羧酸酯酶水解底物（α-乙酸萘酯）生成的水解產(chǎn)物α-萘酚與顯色劑固藍(lán)B鹽偶氮化反應(yīng)生成紅色物質(zhì)在536.6 nm處有最大吸收峰，因此選擇536 nm為分光光度法檢測水解產(chǎn)物α-萘酚的最佳測定波長。

2.2 終止劑SDS的確定

按1.2.3方法進行測定，結(jié)果見圖3。

圖3 不同濃度SDS對顯色產(chǎn)物的影響圖

據(jù)文獻報道，終止劑SDS的作用是裂解肽鏈，從而使催化水解的豬肝羧酸酯酶失活，讓水解反應(yīng)終止，同時SDS的加入會影響顯色產(chǎn)物的穩(wěn)定性[11-12]。實驗顯示，SDS濃度為0時，α-萘酚與固藍(lán)B鹽的顯色產(chǎn)物開始為紅色，但很快顏色就退去，且溶液中析出灰黑色絮狀物，吸光度值偏低。而隨著SDS濃度的不斷增加，顯色產(chǎn)物的吸光度值逐漸升高，顯色情況也越來越穩(wěn)定，SDS濃度達到15%吸光度值趨于平緩。因受限于SDS溶解度，濃度為20%以上的SDS溶液放置一段時間后容易析出，因此選擇更穩(wěn)定的15%SDS溶液為最佳的終止劑。

2.3 顯色劑固蘭B鹽的確定

按1.2.4方法進行測定，結(jié)果見圖4。

圖4 不同濃度顯色劑對顯色產(chǎn)物的影響圖

顯色劑的用量也是影響顯色穩(wěn)定性的重要因素。顯色劑濃度越大時，顏色的蛻變越明顯，顯色劑濃度太小容易造成顯色不足。固藍(lán)B鹽與α-萘酚發(fā)生偶氮化反應(yīng)，擴大共軛體系，生成顯色產(chǎn)物。由圖4可知，0.05%以上的固蘭B鹽與水解產(chǎn)物α-萘酚的顯色反應(yīng)穩(wěn)定并有良好的線性關(guān)系。因此過量的固蘭B鹽有利于反應(yīng)的穩(wěn)定性，而固藍(lán)B鹽見光易分解，因此選擇0.06%的固藍(lán)B鹽為最佳濃度的顯色劑。

2.4 α-萘酚顯色反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線

將 不 同 濃 度 的 0 mol·L-1、0.5×10-4mol·L-1、1×10-4mol·L-1、2×10-4mol·L-1、4×10-4mol·L-1以 及6×10-4mol·L-1α-萘酚標(biāo)準(zhǔn)工作溶液按1.2.5的方法進行測定，結(jié)果見圖5和圖6。

圖5 不同濃度α-萘酚標(biāo)準(zhǔn)溶液與固藍(lán)B鹽的顯色反應(yīng)情況圖

圖6 α-萘酚顯色反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

由圖5和圖6可知，水解產(chǎn)物α-萘酚與顯色劑固藍(lán)B鹽顯色反應(yīng)生成的紅色物質(zhì)隨著α-萘酚濃度的增大而顏色加深，且在0～6×10-4mol·L-1α-萘酚標(biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度范圍內(nèi)，與吸光度值成線性相關(guān)，R2=0.999 6。

2.5 底物最佳濃度的確定

按1.2.6的方法進行測定，結(jié)果見圖7。

圖7 不同濃度α-乙酸萘酯的顯色反應(yīng)圖

由圖7可知，隨著底物α-乙酸奈酯濃度的不斷增加，顯色產(chǎn)物的吸光度值也隨之上升，當(dāng)α-乙酸奈酯濃度超過7.5×10-4mol·L-1時，吸光度值隨著底物濃度的增加變化不大，因此選擇α-乙酸萘酯的最佳反應(yīng)濃度為 7.5×10-4mol·L-1。

2.6 酶液最佳濃度的確定

按1.2.7方法進行測定，結(jié)果見圖8。

由圖8可知，隨著豬肝羧酸酯酶濃度的增加而顯色產(chǎn)物吸光度值也增大，且為線性相關(guān)，R2=0.995 8，選擇吸光度值為0.8以上即豬肝羧酸酯酶濃度為5 μg·mL-1為最佳酶液濃度。

圖8 不同濃度的豬肝羧酸酯酶的顯色反應(yīng)圖

2.7 最佳反應(yīng)溫度的確定

按1.2.8方法進行測定，結(jié)果見圖9。

圖9 不同水浴溫度的顯色反應(yīng)圖

溫度對酶的活力有較大影響，從圖9可知，溫度升高，豬肝羧酸酯酶的酶活力逐漸升高，在45 ℃時達到最高，水解底物后生成的顯色物質(zhì)吸光度值最大，而后隨著溫度繼續(xù)升高，酶活力反而有所下降，因此選擇45 ℃為最佳反應(yīng)溫度。

2.8 最佳顯色反應(yīng)時間的確定

按1.2.9方法進行測定，結(jié)果見圖10。

圖10 不同顯色反應(yīng)時間的顯色反應(yīng)圖

顯色反應(yīng)時間會影響水解產(chǎn)物α-萘酚和固藍(lán)B鹽的顯色反應(yīng)完全程度。由圖10可知，15 s顯色反應(yīng)時間過短，顯色反應(yīng)未能完全進行，超過30 s后，顯色反應(yīng)時間過長，顯色產(chǎn)物不穩(wěn)定導(dǎo)致吸光度值有所下降。據(jù)文獻報道，顯色產(chǎn)物穩(wěn)定存在于酸性環(huán)境中，故在顯色反應(yīng)完成后需在溶液中加入6 mol·L-1鹽酸將溶液pH調(diào)節(jié)到酸性，使顯色產(chǎn)物穩(wěn)定不變[11]。顯色反應(yīng)時間加長，將延長加入6 mol·L-1鹽酸調(diào)節(jié)pH的時間，導(dǎo)致顯色產(chǎn)物不穩(wěn)定發(fā)生褪色現(xiàn)象，因此選擇30 s為最佳顯色反應(yīng)時間。

2.9 擬除蟲菊酯類農(nóng)藥對酶的抑制效果

按1.2.10方法進行測定，加入0.25 mL聯(lián)苯菊酯或甲氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)工作液 1.6 μg·mL-1、3.2 μg·mL-1、4.8 μg·mL-1、6.4 μg·mL-1以及 8 μg·mL-1，使混合溶液中聯(lián)苯菊酯或甲氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為0.1 μg·mL-1、0.2 μg·mL-1、0.3 μg·mL-1、0.4 μg·mL-1以及 0.5 μg·mL-1，結(jié)果見圖11和圖12。

圖11 聯(lián)苯菊酯對酶的抑制效果圖

圖12 甲氰菊酯對酶的抑制效果圖

由圖11和圖12可知，當(dāng)聯(lián)苯菊酯和甲氰菊酯濃度達到0.1 μg·mL-1時即對豬肝羧酸酯酶產(chǎn)生了明顯的抑制效果，且隨著聯(lián)苯菊酯和甲氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的增加，抑制效果更顯著，顯色產(chǎn)物逐漸減少，吸光度值下降，當(dāng)聯(lián)苯菊酯濃度達到0.3 μg·mL-1、甲氰菊酯濃度達到0.4 μg·mL-1時，抑制程度達到最大。因此擬除蟲菊酯類農(nóng)藥對豬肝羧酸酯酶有明顯的抑制效果，能影響豬肝羧酸酯酶催化α-乙酸萘酯水解的能力，使水解產(chǎn)物減少并無法與固藍(lán)B鹽形成顯色產(chǎn)物。

3 結(jié)論

通過紫外可見分光光度計在400～700 nm光譜掃描發(fā)現(xiàn)，豬肝羧酸酯酶水解底物α-乙酸萘酯的水解產(chǎn)物α-萘酚與固藍(lán)B鹽顯色反應(yīng)的產(chǎn)物在536 nm處有最大吸收峰；通過優(yōu)化終止劑和顯色劑濃度，在終止劑為15% SDS和顯色劑為0.06%固藍(lán)B鹽條件下，水解產(chǎn)物α-萘酚能與固藍(lán)B鹽生產(chǎn)穩(wěn)定的紅色顯色產(chǎn)物，且在α-萘酚0～6×10-4mol·L-1范圍內(nèi)與顯色產(chǎn)物吸光度值成線性相關(guān)，R2=0.999 6。因此在536 nm最佳測定波長下，可以用分光光度法檢測豬肝羧酸酯酶水解底物α-乙酸萘酯后與固藍(lán)B鹽的顯色反應(yīng)。

通過優(yōu)化酶水解顯色反應(yīng)的關(guān)鍵因素包括底物、酶液、反應(yīng)溫度和顯色反應(yīng)時間等，建立基于分光光度法的擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留快速檢測方法，以酶液為 5 μg·mL-1豬肝羧酸酯酶、底物為 7.5×10-4mol·L-1、終止劑為15%SDS、顯色劑為0.06%固藍(lán)B鹽、pH調(diào)節(jié)劑為6 mol·L-1鹽酸，在536 nm波長下檢測顯色產(chǎn)物的吸光度值，當(dāng)聯(lián)苯菊酯和甲氰菊酯濃度達到0.1 μg·mL-1時即對豬肝羧酸酯酶產(chǎn)生了明顯的抑制效果，擬除蟲菊酯類農(nóng)藥使豬肝羧酸酯酶降低了催化α-乙酸萘酯水解的能力，導(dǎo)致水解產(chǎn)物減少并無法與固藍(lán)B鹽形成顯色產(chǎn)物，吸光度值降低。該方法操作簡單，適宜基層人員現(xiàn)場操作，滿足快速檢測的需求。