大鼠閉合性胸外傷所致肺挫傷模型構(gòu)建

汪雷 付靜怡 吳偉銘 郭翔 楊異

肺挫傷是胸部閉合性外傷后常見疾病，屬于肺損傷，部分較嚴(yán)重的肺挫傷易進(jìn)展為肺部感染、肺不張及急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)，可直接導(dǎo)致患者死亡或遺留永久性的肺功能殘障[1-2]，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量，增加社會負(fù)擔(dān)。隨著我國經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，交通日益發(fā)達(dá)、基礎(chǔ)建設(shè)日益增多，此類疾病發(fā)生率在相當(dāng)長時間將保持增長趨勢。目前，臨床上針對胸外傷所致肺挫傷的治療措施主要以對癥處理為主，對重癥患者的療效有限，究其原因，是對于此類疾病的發(fā)病及進(jìn)展機(jī)制尚不清楚。良好實用的動物模型可以較好地模擬類似傷情，為進(jìn)一步開展相關(guān)研究提供良好的平臺。截至目前，文獻(xiàn)報道的相關(guān)模型均存在不同程度的不足，如大動物犬、羊及豬動物模型花費高、穩(wěn)定性較差[3-5]，小動物造模器材較為復(fù)雜、難以復(fù)制等，限制了模型的應(yīng)用[6-7]。本研究旨在建立一種簡便實用、可推廣的大鼠閉合性胸外傷所致肺挫傷模型。

材料與方法

一、造模裝置的制作及原理

一根垂直中空PVC管道（管徑稍大于砝碼最大直徑，長度、管徑可按實驗要求選擇），由連接裝置固定于木質(zhì)小動物解剖臺（用于固定實驗動物），撞擊器材為不同質(zhì)量的制式砝碼（圖1）。工作原理是通過砝碼從一定高度自由落體，以一定能量撞擊實驗動物右胸，造成其肺挫傷?？諝饽Σ亮雎圆挥?，打擊能量的計算根據(jù)公式E=mgh（g=9.8 m/s2）。參照前期預(yù)實驗結(jié)果，選擇砝碼質(zhì)量為200 g，100 g，自由落體高度為60 cm和100 cm。

圖1 造模裝置（木質(zhì)小動物解剖臺通過連接裝置固定PVC管道）

二、動物分組及實驗方法

選取SD雄性大鼠40只，體重220～240 g，由上海市第六人民醫(yī)院動物實驗室提供。根據(jù)造模能量的不同，參考以往文獻(xiàn)，結(jié)合預(yù)實驗結(jié)果，按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為A組（對照組，撞擊能量0 J）、B組（100 g，60 cm，撞擊能量0.588 J）、C組（100 g，100 cm，撞擊能量0.98 J）、D組（200 g，60 cm，撞擊能量1.176 J）、E組（200 g，100 cm，撞擊能量1.96 J），每組8只。具體實驗過程：大鼠造模前12 h禁食禁水。戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉滿意后（3%戊巴比妥鈉，1:5稀釋，每100 g體重注射1 mL），大鼠仰臥位，右上肢外展，固定后，暴露右側(cè)胸壁，局部剃毛，將不同質(zhì)量制式砝碼從不同高度自PVC管道垂直自由落體（管道作用是保持砝碼垂直自由落體，管壁不與砝碼接觸），打擊點為SD大鼠右側(cè)第4肋間范圍。

三、肺挫傷程度的評估

1.影像學(xué)評估：通過CT計算肺挫傷比值。存活大鼠在造模24 h后送至小動物CT平臺（SkyScan 1176，Bruker MicroCT，Kontich，Belgium）行薄層CT掃描，層厚35 μm。掃描后利用體積計算程序，在橫斷面圖像上，定位挫傷區(qū)域后，從上至下逐個層面描記挫傷肺組織的輪廓，系統(tǒng)體積計算程序自動生成該側(cè)挫傷肺組織體積的絕對值。同樣方法逐個層面描記、生成該側(cè)總肺組織體積絕對值。計算得出肺挫傷比值=（肺挫傷體積之和/肺體積之和）×100%。

2.病理學(xué)評估：造模后24 h，完成CT檢查后處死動物，選取肺挫傷部位，予組織固定液固定（10%中性緩沖甲醛固定液），切片后HE染色，鏡下觀察肺挫傷程度。

四、統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)處理應(yīng)用SPSS20.0軟件。計量資料采用±s表示，多組間對比采用方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、各組實驗動物大體情況及病死率

A組、B組、C組、D組無死亡，E組死亡3只，均在造模后出現(xiàn)呼吸動作異常，30 min內(nèi)死亡，E組病死率37.5%，解剖發(fā)現(xiàn)均為右側(cè)多根多處肋骨骨折、胸廓軟化，胸腔可見大量血塊。

二、影像學(xué)檢查結(jié)果

胸部CT提示：A組、B組大鼠無明顯骨折，C組、D組各有單根和兩根骨折1例，A組、B組、C組及D組無明顯血氣胸。E組存活大鼠有3只發(fā)生2根肋骨骨折，1只發(fā)生3根肋骨骨折，另一只發(fā)生3根以上肋骨骨折（合并少量血胸）。各組肺挫傷比值見表1。統(tǒng)計學(xué)分析提示4組間肺挫傷體積占正常肺組織體積的百分比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。肺挫傷的不同CT表現(xiàn)見圖2，其中以局部云絮樣改變更為多見。

圖2 肺挫傷CT表現(xiàn)：局部可見云絮樣改變（A），局部肺實變（B）

表1 各組肺挫傷比值

三、病理檢查結(jié)果

HE染色提示肺挫傷組織發(fā)生不同病理改變，A組大鼠肺部無挫傷。大鼠肺部挫傷表現(xiàn)為肺泡內(nèi)淤血（圖3A），或肺泡內(nèi)淤血，局部炎性細(xì)胞浸潤（圖3B），也可表現(xiàn)為大量炎性細(xì)胞浸潤，肺泡間隙異常增大（圖3C），以前兩種表現(xiàn)為主。大鼠心臟切片HE染色提示，心肌組織無明顯損傷（圖4）。

圖3 肺挫傷鏡下病理表現(xiàn)（HE，×100）：少許肺泡內(nèi)淤血（A），或較多肺泡內(nèi)可見淤血，局部炎性細(xì)胞浸潤（B），也可表現(xiàn)為大量炎性細(xì)胞浸潤，肺泡間隙異常增大（C）

圖4 心肌細(xì)胞無明顯損傷（HE，×100）

討 論

肺挫傷是閉合性胸外傷較常見的并發(fā)癥，部分輕癥患者可自愈，部分較重患者如不及時處理，可進(jìn)展為肺部嚴(yán)重并發(fā)癥甚至ARDS。肺挫傷是胸外傷預(yù)后不佳的主要危險因素之一[8]，雖然本質(zhì)上也屬于急性肺損傷，但由外傷性肺挫傷、全身感染或其他原因所致的ARDS病死率并不相同[9]，提示不同致病因素肺挫傷發(fā)生進(jìn)展機(jī)制可能并不完全一致。截至目前，肺挫傷的具體發(fā)生機(jī)制的理論研究和有效治療方法的臨床實踐均無突破，因此構(gòu)建合適的動物模型尤為重要。

目前已有的肺挫傷模型中，大動物模型有犬、羊、豬，雖然這些模型部分模仿了人類受傷，但體型大，制作需要較高的人力及較多的經(jīng)費，且缺乏分子探針、其他細(xì)胞和介質(zhì)特異性試劑，限制了進(jìn)一步使用；有學(xué)者構(gòu)建了嚙齒類動物模型，但造模的器材較為復(fù)雜，大多需要專門的設(shè)備，如特制保護(hù)罩、專用撞擊裝置等[10-11]，重復(fù)此類實驗必須有相應(yīng)特制器材，這進(jìn)一步增大了建模難度，增加了成本。本研究的造模裝置用材常見，安裝簡單，利于推廣，尤其適合基層單位開展研究。既往研究均已建立雙側(cè)肺挫傷模型和單側(cè)肺挫傷模型，但本中心在臨床工作中發(fā)現(xiàn)，近年來，隨著致傷原因的改變，單側(cè)肺挫傷較雙側(cè)肺挫傷更多見，因此更貼近臨床。本研究構(gòu)建了單側(cè)損傷模型。此外，單側(cè)損傷模型避開撞擊左胸，更有利于避免心臟損傷，一定程度上減少了后續(xù)研究的干擾因素。

建模動物肺挫傷的程度是建模的關(guān)鍵指標(biāo)之一。如肺挫傷過于嚴(yán)重，模型動物可能近期死亡，或干預(yù)效果不能體現(xiàn)，肺挫傷程度較輕，動物?？焖僮孕行迯?fù)，目前動物模型的肺挫傷具體程度尚無統(tǒng)一意見，本研究認(rèn)為應(yīng)將肺挫傷程度控制適中。目前認(rèn)為CT是評估肺挫傷程度敏感度最高的檢查[12]。有研究證實，肺挫傷體積占總肺體積28%以上是繼發(fā)ARDS等嚴(yán)重肺部并發(fā)癥的臨界預(yù)測指標(biāo)[13]。結(jié)合預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)肺挫傷占比超過40%以上的大鼠較易發(fā)生死亡，肺挫傷占比20%以下的大鼠大多很快恢復(fù)，設(shè)定20%～40%作為建模的肺挫傷具體標(biāo)準(zhǔn)。本研究建立的1.176 J能量模型組，全組大鼠無死亡，造模后24 h胸部CT檢查提示肺挫傷體積（32.74±4.14）%，數(shù)據(jù)差異相對較小，可重復(fù)性強(qiáng)，達(dá)到了預(yù)期目標(biāo)。

本組實驗造模出現(xiàn)肋骨骨折相對較少，主要原因是制式砝碼底部較寬，打擊接觸面積相對較大，局部壓強(qiáng)不至于過分集中，一定程度上減少了肋骨骨折發(fā)生。此外，心肌病理檢查顯示心肌無明顯損傷。提示撞擊重物選擇和撞擊范圍較為滿意。本研究撞擊的能量小于其他實驗，主要原因有2點：本組實驗構(gòu)建的是單側(cè)肺挫傷模型，能量直接用于造模，有些研究撞擊的能量在特殊裝置中部分消耗；二是本組實驗動物由于小動物CT機(jī)掃描床規(guī)格所限，檢查動物體質(zhì)量原則上不能選擇超過250 g，相較其他研究中動物質(zhì)量較小。

本實驗緊貼臨床實際，裝置制作簡便，致傷原理單一，較好地模擬了閉合性胸外傷致傷環(huán)境，以打擊高度和撞擊物的質(zhì)量作為變量，可以根據(jù)實際情況調(diào)節(jié)，實驗結(jié)果可重復(fù)性較高，為閉合性胸外傷肺挫傷的機(jī)制及治療研究提供了較好的動物模型，尤其適合基層單位開展相關(guān)研究。