益腎方對(duì)db/db糖尿病小鼠腎保護(hù)作用的療效觀察

鄧麗娥, 盧漢祺, 董晶晶, 李云逸, 姚淑煥, 洪嘉玲, 林捷, 范麗靜, 曹銳, 董向楠, 盧永平, 葉明君, Bernhard Kr?mer, Berthold Hocher, 尹良紅, 李強(qiáng)*

(1.東莞市中醫(yī)院 內(nèi)十科, 廣東 東莞 523000; 2.暨南大學(xué) 附屬第一醫(yī)院 腎內(nèi)科， 廣東 廣州 510630;3.德國(guó)海德堡大學(xué) 蔓海姆醫(yī)學(xué)院 腎臟病醫(yī)院, 德國(guó) 海德堡市 69117)

全球成人糖尿病(diabetes mellitus，DM)患病率已從1980年的4.7%上升至2014年的8.5%[1]，據(jù)預(yù)測(cè)2035年全球糖尿病患病人數(shù)可能會(huì)超過(guò)5.919億，成為一場(chǎng)嚴(yán)重的國(guó)際健康危機(jī)[2].糖尿病腎病(diabetic kidney disease, DKD)是常見(jiàn)的糖尿病微血管并發(fā)癥之一，嚴(yán)重地影響糖尿病患者的生活質(zhì)量及平均壽命.在中國(guó)，DKD是繼腎小球腎炎之后引發(fā)終末期腎臟病(end stage renal disease，ESRD)的第二大病因.該病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前認(rèn)為與長(zhǎng)期血糖控制欠佳致腎臟內(nèi)胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)異常、終末期糖基化產(chǎn)物大量堆積、腎臟血流動(dòng)力學(xué)改變、炎癥狀態(tài)、氧化應(yīng)激以及遺傳等因素密切相關(guān)[3].DKD早期表現(xiàn)并不顯著，臨床發(fā)現(xiàn)率較低；進(jìn)入DKD Ⅲ期后，患者會(huì)出現(xiàn)尿微量白蛋白排泄率持續(xù)增加、血壓升高、腎小球?yàn)V過(guò)率下降的癥狀，并逐漸加重，直至進(jìn)入終末期.在延緩DKD進(jìn)程中，西醫(yī)通過(guò)飲食調(diào)整、控制血糖血壓血脂、抗感染抗氧化、降低尿蛋白等措施進(jìn)行干預(yù)[4]，但每年依然有大量患者不可逆地進(jìn)入DKD終末期[5].中醫(yī)療法在DKD臨床治療上具有一定的優(yōu)勢(shì)[6-9]，益腎方具有“健脾益腎、通利活血”的功效，在保護(hù)糖尿病患者腎臟功能、緩解患者臨床癥狀、提高其生活質(zhì)量、甚至推遲進(jìn)入ESRD需腎臟替代治療的時(shí)間等方面有明確療效.本研究通過(guò)觀察益腎方對(duì)糖尿病腎病小鼠血糖、尿微量白蛋白和腎臟病理改變的影響，探討益腎方對(duì)DKD的防治作用，為其臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

60只6周齡無(wú)特定病原體(specific pathogen free, SPF)級(jí)雄性db/db糖尿病小鼠(Lepr)ko/ko和15只同背景雄性(Lepr)db/m小鼠購(gòu)自江蘇集萃藥康生物科技有限公司，生產(chǎn)許可證：SCXK(蘇)2015-0001，體質(zhì)量22～50 g.動(dòng)物飼養(yǎng)于暨南大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)動(dòng)物房.每天進(jìn)食量為4～6 g，自由飲水，12 h光暗循環(huán)，室內(nèi)保持恒溫(24±1)℃，恒濕(45±10)%.

1.2 藥物、主要材料和試劑

益腎方水煎液和洛汀新由東莞市中醫(yī)院提供，益腎方配方：黃芪30 g、山茱萸15 g、柴胡10 g、當(dāng)歸10 g、菟絲子20 g、僵蠶15 g，上述藥物加入5倍量蒸餾水煎煮30 min，煎煮2次，過(guò)濾，濾液(水煎液)濃縮到200 g于4 ℃冰箱存儲(chǔ)備用.洛汀新(10 mg·kg-1)混懸液配制：每500 mL生理鹽水中加入500 mg藥物混勻后常溫保存?zhèn)溆?血糖試紙和血糖儀購(gòu)于德國(guó)拜爾公司.用于檢測(cè)血清胱抑素C、尿微量白蛋白、尿肌酐的Elisa試劑盒均購(gòu)自廣州賽國(guó)生物科技有限公司.蘇木素-伊紅染色試劑盒和PAS染色試劑盒均購(gòu)自武漢塞維爾生物科技有限公司.

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

①正常對(duì)照組：15只同背景db/m小鼠，10 mL·kg-1·d-1生理鹽水灌胃12周；②模型組：15只db/db 小鼠，10 mL·kg-1·d-1生理鹽水灌胃12周；③益腎方低劑量組：15只db/db糖尿病小鼠，2.4 g·kg-1·d-1益腎方灌胃12周；④益腎方高劑量組：15只db/db糖尿病小鼠，5.0 g·kg-1·d-1益腎方灌胃12周；⑤洛汀新組：15只db/db糖尿病小鼠，10 mg·kg-1·d-1洛汀新灌胃治療12周.db/db糖尿病小鼠采用抽簽隨機(jī)分組法.小鼠進(jìn)入動(dòng)物房環(huán)境適應(yīng)1周后即小鼠第7周齡開(kāi)始灌胃，每日1次.其中，益腎方低劑量組及洛汀新組小鼠的灌胃量為根據(jù)人與動(dòng)物的體表面積計(jì)算得出，益腎方高劑量組的灌胃量約為益腎方低劑量組的2倍.

1.4 樣本采集與處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后使用代謝籠收集各組小鼠的24 h尿液并記錄，-80 ℃冰箱保存，用于后續(xù)檢測(cè).實(shí)驗(yàn)結(jié)束后使用10%水合氯醛腹腔注射麻醉各組小鼠，摘眼球采血，4 ℃靜置，3 000 r/min離心10 min，吸取上層血清，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?迅速打開(kāi)腹腔，取出腎臟組織，去除包膜，于4%多聚甲醛固定液保存用于腎臟病理學(xué)觀察.

1.5 指標(biāo)檢測(cè)

1.5.1 血糖儀檢測(cè)空腹血糖

應(yīng)用快速血糖儀檢測(cè)小鼠空腹8 h尾靜脈血糖濃度，每4周1次.

1.5.2 Elisa法檢測(cè)生化指標(biāo)

代謝籠收集尿液迅速將標(biāo)本放置-80 ℃冰箱存儲(chǔ).檢測(cè)前常溫下解凍，離心后取上清液按照Elisa試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定尿微量白蛋白、尿肌酐水平.小鼠眼眶采血，分離動(dòng)物血清，按照Elisa試劑盒的操作說(shuō)明檢測(cè)小鼠血清胱抑素C水平.

1.5.3 病理學(xué)觀察

去除包膜的腎臟組織切成薄片，4%多聚甲醛固定24 h，自來(lái)水洗凈殘留固體成分，修整使切面平整，再以75%(過(guò)夜)、85%(2 h)、90%(2 h)、95%(1 h)及100%乙醇(30 min×2)順序梯度脫水，二甲苯(3次，每次5～10 min)透明，石蠟包埋后進(jìn)行修整、切片(厚度約4 μm)，攤片后于60 ℃烘箱內(nèi)烘烤，室溫保存.進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色和PAS染色，光鏡觀察腎組織的病理學(xué)變化.組織病變程度采用五級(jí)分法，無(wú)病變或極少量病變計(jì)分為0；有輕度病變或少量病變計(jì)分為1；有中度病變或中等量病變計(jì)分為2；有重度病變或多量病變計(jì)分為3；有極重度病變或大量病變計(jì)分為4.

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 一般情況

正常對(duì)照組小鼠皮毛光滑，反應(yīng)靈活，神情自如，進(jìn)食、飲水、大小便正常；模型組小鼠皮毛干澀，活動(dòng)少，易怒，精神差，進(jìn)食量減少，小便量增多，體質(zhì)量減輕；益腎方低劑量組、益腎方高劑量組、洛汀新組藥物干預(yù)后小鼠精神稍好轉(zhuǎn)，反應(yīng)較模型組靈敏，恢復(fù)最明顯的為益腎方高劑量組.提示益腎方對(duì)db/db糖尿病小鼠臨床癥狀的改善作用.

2.2 各組小鼠生化指標(biāo)比較

與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠血糖、尿肌酐/尿微量白蛋白比值(ACR)、尿微量白蛋白、胱抑素C明顯升高(P<0.05)，提示腎功能出現(xiàn)損害.與正常對(duì)照組相比，模型組、益腎方低劑量組、益腎方高劑量組及洛汀新組的血糖均顯著增高(P<0.05)；與模型組相比，益腎方低劑量組、益腎方高劑量組及洛汀新組的血糖無(wú)顯著差異.與正常對(duì)照組相比，模型組、益腎方低劑量組、益腎方高劑量組及洛汀新組的尿微量白蛋白、ACR均顯著增高(P<0.05)；益腎方及洛汀新治療后ACR顯著下降(P<0.05)，且益腎方高劑量組的ACR較益腎方低劑量組及洛汀新組下降更為明顯(P<0.05).與正常對(duì)照組比較，模型組、益腎方低劑量組、益腎方高劑量組及洛汀新組的胱抑素C顯著增高(P<0.05)，益腎方低劑量組、益腎方高劑量組和洛汀新組的胱抑素C水平較模型組下降(P<0.05)，且益腎方高劑量組胱抑素C水平下降最為明顯(P<0.05，表1).上述結(jié)果提示益腎方對(duì)db/db糖尿病小鼠生化指標(biāo)的改善作用呈劑量依懶性，且可能獨(dú)立于血糖水平.

表1 組間生化指標(biāo)比較Table 1 Comparison of biochemical indicators between groups

2.3 各組大鼠腎臟病理形態(tài)學(xué)改變

HE染色結(jié)果顯示，正常對(duì)照組小鼠腎臟組織結(jié)構(gòu)較清晰，腎小球無(wú)壞死，腎小管無(wú)萎縮，間質(zhì)無(wú)明顯炎癥及滲出；模型組小鼠腎臟組織結(jié)構(gòu)主要病變?cè)谀I小球系膜區(qū)及腎小管，腎小球系膜區(qū)可見(jiàn)系膜細(xì)胞增生，并可見(jiàn)灶性球囊粘連、節(jié)段硬化等病變出現(xiàn)，可見(jiàn)多處灶性腎小管上皮刷狀緣脫落、上皮細(xì)胞極度扁平、管腔擴(kuò)張、腎小管基底膜增厚(其被定義為腎小管急性病變)；益腎方低劑量組、益腎方高劑量組及洛汀新組的上述病理變化明顯減輕.分別對(duì)各組腎小球系膜區(qū)增生、腎小管上皮細(xì)胞變性、腎小管擴(kuò)張、間質(zhì)炎癥等病理形態(tài)進(jìn)行評(píng)分，與正常對(duì)照組比較，模型組、益腎方低劑量組、益腎方高劑量組及洛汀新組中腎小球系膜基質(zhì)變化評(píng)分、腎小管急性病變程度評(píng)分、腎小球上皮空泡樣變性評(píng)分明顯增加(P<0.05)；而益腎方低劑量組、益腎方高劑量組及洛汀新組治療后上述病理評(píng)分明顯降低(P<0.05)，且益腎方高劑量組的上述病理評(píng)分降低最顯著(P<0.05，表2).

表2 腎臟病理組織評(píng)分比較Table 2 Comparison of kidney pathological tissue scores 分

A: HE染色結(jié)果；b:PAS染色結(jié)果. A：正常對(duì)照組；B：模型組；C：益腎方低劑量組；D：益腎方高劑量組；E：洛汀新組.

A：正常對(duì)照組；B：模型組；C：益腎方低劑量組；D：益腎方高劑量組；E：洛汀新組.A: Control group; B: Model group; C: Low-dose group of Yishen Recipe; D: High-dose group of Yishen Recipe; E: Lotensin group.

從圖1中可以觀察到腎小球的改變，模型組小鼠腎小球基底膜增厚，系膜區(qū)無(wú)細(xì)胞結(jié)構(gòu)樣增生明顯，球袢缺血皺縮并出現(xiàn)部分球囊粘連及節(jié)段硬化；洛丁新組基底膜厚度較模型組無(wú)明顯改變，但未出現(xiàn)節(jié)段硬化及球囊粘連現(xiàn)象，系膜區(qū)增寬現(xiàn)象減輕；益腎方低劑量組及高劑量組均未出現(xiàn)節(jié)段硬化及球囊粘連現(xiàn)象，基底膜厚度增生情況減輕，未出現(xiàn)球袢缺血皺縮現(xiàn)象，系膜區(qū)增生現(xiàn)象明顯減輕.從圖2中可以觀察到腎間質(zhì)及腎小管的改變，各組小鼠腎間質(zhì)均未出現(xiàn)纖維化，模型組小鼠腎間質(zhì)出現(xiàn)單個(gè)核細(xì)胞浸潤(rùn)，其余各組均未出現(xiàn)；腎小管方面改變，模型組、洛丁新組、益腎方低劑量組小鼠均出現(xiàn)部分腎小管刷狀緣脫落、上皮細(xì)胞極度扁平、再生上皮細(xì)胞排列紊亂現(xiàn)象，紊亂程度：模型組>洛丁新組>益腎方低劑量組，而益腎方高劑量組腎小管刷狀緣保存完好，并未出現(xiàn)腎小管上皮細(xì)胞損傷.提示益腎方對(duì)腎臟具有保護(hù)作用.

3 討論

DKD是糖尿病常見(jiàn)的微血管并發(fā)癥，也是導(dǎo)致終末期腎病的主要原因之一[10].據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)成年人糖尿病的患病率從2007年的9.7%上升到2017年的11.2%[11]，糖尿病患者并發(fā)腎臟并發(fā)癥的患病率高達(dá)41.4%[12].可見(jiàn)，DKD已經(jīng)成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題，尋找有效的干預(yù)措施具有重要意義.本研究首先在DKD小鼠模型上探討益腎方的療效，重點(diǎn)觀察其對(duì)db/db糖尿病小鼠腎臟病理變化的影響.db/db糖尿病小鼠是自發(fā)2型糖尿病小鼠，在其自然生長(zhǎng)過(guò)程中，約5～6周齡可出現(xiàn)血糖升高，8～10周齡出現(xiàn)腎功能損傷，已被廣泛應(yīng)用于DKD的研究工作中，可作為DKD的理想模型.從本研究中可以看出，模型組小鼠腎小球基底膜增厚，系膜區(qū)無(wú)細(xì)胞結(jié)構(gòu)樣增生明顯，球袢缺血皺縮并出現(xiàn)部分球囊粘連及節(jié)段硬化，雖未出現(xiàn)明確的腎纖維化，但可作為其前期病理改變.

中醫(yī)學(xué)將DKD歸于消渴范疇，認(rèn)為稟賦不足、飲食不節(jié)、勞欲太過(guò)、情志失調(diào)等，可導(dǎo)致腎臟虧虛，氣化失司，發(fā)為本病.基本病機(jī)為本虛標(biāo)實(shí)，虛實(shí)夾雜；虛為脾腎虛損，標(biāo)實(shí)為氣郁、瘀血、痰濕、濁毒.消渴病若失治誤治，病情逐漸發(fā)展可影響到腎臟，導(dǎo)致脾腎兩虛.脾虛攝納無(wú)力，腎虛封藏?zé)o權(quán)，人體精微流失加重，表現(xiàn)為蛋白尿持續(xù)增加.糖尿病的病情進(jìn)展至DKD階段，已是五臟窮極，必歸于腎，本虛是必然的.所以，DKD大都以脾傷及脾虛為起始，后期波及腎臟[13]，脾氣虛不攝精，腎氣虛不藏精，精微下泄，氣血不行，氣絡(luò)郁滯，導(dǎo)致津血運(yùn)行不暢，化為痰瘀，濕、瘀、痰、滯相互為患，膠結(jié)于腎之絡(luò)脈中，推進(jìn)了DKD的發(fā)展.治療當(dāng)以健脾補(bǔ)腎為主，祛邪以通利活血為重.

益腎方是東莞市中醫(yī)院何世東教授長(zhǎng)期治療DKD的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)，50余年的臨床實(shí)踐表明，益腎方治療DKD療效確切，在保護(hù)患者腎功能、推遲進(jìn)入腎臟替代的時(shí)間、緩解患者臨床癥狀、提高其生活質(zhì)量方面有顯著療效.益腎方全方由黃芪、山茱萸、菟絲子、當(dāng)歸、僵蠶組成.方中以黃芪為君藥，味甘，性微溫，補(bǔ)益肺、脾、腎之陽(yáng)氣，使脾腎之氣健旺，脾能攝、腎能固，則精微下泄能止；山茱萸、菟絲子益陰固精為臣，配合黃芪，一陰一陽(yáng)，陰陽(yáng)相合，相互促進(jìn)，相互轉(zhuǎn)化，共奏健脾腎、斂脾精、止漏濁之功；佐以當(dāng)歸，取“有形之血不能速生，無(wú)形之氣應(yīng)當(dāng)急固，補(bǔ)氣方能生血”之義，行益氣活血之效；僵蠶取其清揚(yáng)之性，透表利于外邪之疏散，疏泄利于濕毒之蠲除，與柴胡共為使藥，輕清升散，疏利三焦，使邪有出路，樞機(jī)運(yùn)轉(zhuǎn)，有利于脾腎同補(bǔ)，全方共奏益腎健脾、通利活血之功.研究顯示，黃芪的主要活性成分黃芪甲甙及黃芪多糖可通過(guò)延緩DKD小鼠的腎纖維化進(jìn)程，減少蛋白尿，保護(hù)腎臟功能[14]；當(dāng)歸的活性成分當(dāng)歸多糖可通過(guò)調(diào)節(jié)TLR4/NF-κB信號(hào)通路降低DKD大鼠腎臟的炎癥水平，延緩腎纖維化進(jìn)程[15]；山茱萸顆?？梢种芖nt/β-catenin信號(hào)通路從而抑制YKL-40表達(dá)，改善DKD大鼠的腎臟損傷[16];僵蠶可通過(guò)抑制腎臟組織中TLR4及TGF-β1的表達(dá)改善慢性腎炎大鼠腎臟的病理變化，降低血脂，減輕蛋白尿，延緩疾病進(jìn)程[17]；菟絲子中的有效活性成分異鼠李素可減輕糖尿病大鼠的足細(xì)胞損傷，改善腎臟病理變化，其作用機(jī)制可能與增加腎臟的自噬有關(guān)[18]；柴胡的主要成分柴胡皂苷可增強(qiáng)高糖狀態(tài)下腎小管上皮細(xì)胞的抗氧化能力、減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，有效改善糖尿病大鼠的腎臟結(jié)構(gòu)和功能損傷[19].上述研究提示，益腎方對(duì)DKD的潛在治療作用.

本研究通過(guò)db/db糖尿病小鼠成功構(gòu)建DKD模型，結(jié)果提示低劑量跟高劑量益腎方均具有腎臟保護(hù)作用，其作用可能是通過(guò)降低腎小球系膜外基質(zhì)，減輕腎小球基底膜增厚、腎小球管腔擴(kuò)張.DKD歸途是由腎臟纖維化進(jìn)展至腎功能衰竭，而腎臟纖維化的病變特征是大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、腎小管萎縮、間質(zhì)肌成纖維細(xì)胞激活及其導(dǎo)致的細(xì)胞外基質(zhì)成分過(guò)度堆積，最終取代正常的腎臟結(jié)構(gòu)、形成瘢痕，造成腎臟功能的喪失與衰竭[20].本研究顯示，益腎方低劑量組、益腎方高劑量組及洛汀新組均顯示出確切的療效，但是，益腎方高劑量組的療效要優(yōu)于益腎方低劑量組及洛汀新組，提示益腎方對(duì)db/db糖尿病小鼠的療效不亞于洛汀新治療.益腎方顯著降低糖尿病db/db糖尿病小鼠ACR水平，減少腎小球壞死、改善腎小管上皮細(xì)胞變性，發(fā)揮腎臟保護(hù)作用，且對(duì)保護(hù)性作用在高劑量組(5.0 g·kg-1·d-1)尤為明顯，并可使腎小管刷狀緣脫落、細(xì)胞扁平的比例減少，與之相對(duì)應(yīng)的生化影響為尿蛋白量下降，可能是因?yàn)槟I小管損傷緩解后，腎小球的灌注壓力亦有所減輕，故尿蛋白量下降，從而延緩腎臟失功的進(jìn)展，展示了中藥益腎方在防治DKD損傷方面的重要作用.

綜上所述，本研究表明，益腎方治療db/db糖尿病小鼠療效顯著，可顯著改善ACR、胱抑素C水平，減輕腎臟病理變化，并降低其腎臟病理學(xué)評(píng)分，保護(hù)腎臟，且其療效可能呈劑量依懶性，并獨(dú)立于血糖水平.

作者貢獻(xiàn)聲明

鄧麗娥：提出研究思路和框架，修改論文；盧漢祺：設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)，撰寫(xiě)論文；董晶晶：整理、統(tǒng)計(jì)、分析數(shù)據(jù);李云逸：整理、統(tǒng)計(jì)、分析數(shù)據(jù);姚淑煥:整理、統(tǒng)計(jì)、分析數(shù)據(jù);洪嘉玲:整理、統(tǒng)計(jì)、分析數(shù)據(jù);林捷:整理、統(tǒng)計(jì)、分析數(shù)據(jù);范麗靜:整理、統(tǒng)計(jì)、分析數(shù)據(jù);曹銳:設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)，撰寫(xiě)論文;董向楠:病理閱片、數(shù)據(jù)分析、撰寫(xiě)及修改論文;盧永平:整理、統(tǒng)計(jì)、分析數(shù)據(jù);葉明君:整理、統(tǒng)計(jì)、分析數(shù)據(jù);BernhardKr?mer:提出研究思路和框架;BertholdHocher:提出研究思路和框架;尹良紅:提出研究思路和框架，修改論文;李強(qiáng):提出研究思路和框架，修改論文

利益沖突聲明

本研究未受到企業(yè)、公司等第三方資助，不存在潛在利益沖突.