基于Nfr2/HO-1信號通路探討清肺止咳方對急性支氣管炎模型小鼠的影響

朱珊， 田新磊， 趙文錦

(1.河南中醫(yī)藥大學 第二臨床醫(yī)學院， 河南 鄭州 450000； 2.河南省中醫(yī)院 兒科， 河南 鄭州 450000)

急性支氣管炎是兒科常見的呼吸系統(tǒng)疾病之一，主要是由各種致病原所引起的氣管、支氣管黏膜感染，以咳嗽為主要臨床表現(xiàn)[1]，其基本病理機制為氣道的急性炎癥.現(xiàn)代研究認為炎癥與氧化應(yīng)激反應(yīng)二者是相互依存的[2]，在炎癥的發(fā)生和發(fā)展過程中，白介素-1β(interleukin-1，IL-1β)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)等促炎因子，可促使吞噬細胞、巨噬細胞等細胞活化產(chǎn)生大量的體內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)，可殺滅各種病原體以減輕機體的炎癥反應(yīng)，然而一旦ROS產(chǎn)生過多，又可引起局部氧化應(yīng)激反應(yīng)甚至組織損傷，進而激活各種與炎癥反應(yīng)有關(guān)的信號通路，誘導甚至促進炎癥的發(fā)生.細胞核抗氧化因子(nuclear factor erythroid2-related factor 2，Nrf2)/血紅素加氧酶(heme oxygenase-1，HO-1)通路是已被證實的與機體器官的抗氧化應(yīng)激損傷有關(guān)的主要通路之一[3]，其下游產(chǎn)物HO-1與氧化應(yīng)激反應(yīng)密切相關(guān)，可促進IL-10(interleukin-10，IL-10)等抗炎因子的釋放，同時抑制IL-6、IL-1β等促炎因子的釋放，具有調(diào)節(jié)炎癥相關(guān)細胞因子表達的作用，進而發(fā)揮抗感染、抗氧化作用，是一種經(jīng)典的抗氧化劑.Nrf2能促進HO-1的表達，降低細胞內(nèi)ROS水平，阻止與急、慢性炎癥性疾病相關(guān)的巨噬細胞過度活化[4].

急性支氣管炎的西醫(yī)學治療主要以對癥處理為主，但是本病臨床具有反復性，容易引起機體免疫功能的紊亂，影響兒童的健康，故西醫(yī)學治療優(yōu)勢不明顯.中醫(yī)治病以“整體觀念”為指導，標本兼治，不僅能緩解癥狀，而且能提高機體的免疫力，在治療本病時具有獨特的優(yōu)勢.我國著名兒科專家李晏齡教授根據(jù)小兒“陽常有余”的體質(zhì)特點和“風為百病之長”的致病特點，認為臨床上小兒咳嗽以風熱型最為多見，故而創(chuàng)立了由黃芩、連翹、桑白皮、葶藶子、炙紫菀、茯苓、丹參、五味子、甘草等組成的清肺止咳方，其臨床療效顯著.本課題通過測定急性支氣管炎模型小鼠肺組織中Nfr2、HO-1蛋白表達水平及IL-1β、IL-6積分光密度值，基于抗氧化應(yīng)激角度，探討Nfr2/HO-1信號通路在急性支氣管炎中的病理機制；通過分析不同藥物對模型小鼠肺組織Nfr2、HO-1、IL-1β、IL-6的影響，評價清肺止咳方的療效，為該方的臨床應(yīng)用提供實驗室依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 實驗動物

選用健康4周齡SPF級昆明種小鼠80只，雌雄各半，體質(zhì)量(20±2)g，購買于河南省實驗動物中心，合格證號：0008476，實驗經(jīng)河南省中醫(yī)院倫理委員會批準.

1.1.2 主要試劑與儀器

Nfr2試劑盒、HO-1試劑盒、IL-1β試劑盒、IL-6試劑盒均購置于美國Santa Cruz 公司；SP9001試劑盒、DAB顯色試劑盒、BCA蛋白質(zhì)量濃度測定試劑盒(增強型)、RIPA組織細胞快速裂解液均購置于北京索萊寶科技有限公司；β-actin (批號：CP10399) 購自美國Abnova公司；凝膠成像系統(tǒng)(CSL-MDOCUV 1D型，通用實驗科技有限公司)、顯微鏡(DM2500型，德國LEICA公司)、電泳儀(1658003型，美國Bio-Rad公司)、酶標儀(RT-2100C型，上海攸茜實業(yè)有限公司)、石蠟切片機、包埋機、組織脫水機等均由河南省中醫(yī)院中心實驗室提供.

1.1.3 實驗藥物

清肺止咳方主要成分：黃芩、連翹、桑白皮、葶藶子、炙紫菀、茯苓、丹參、五味子、甘草等，由河南省中醫(yī)院藥劑科制備成藥液，每毫升藥液約含2 g生藥.

小兒清熱止咳口服液主要成分：麻黃、炒苦杏仁、石膏、甘草、黃芩、板藍根、北豆根等，由榮昌制藥(淄博)有限公司生產(chǎn)，批準文號：國藥準字Z20143014.該藥處方收載于《中華人民共和國藥典》(2005版)，主要用于治療小兒外感、邪毒內(nèi)盛、發(fā)熱惡寒、咳嗽痰黃、氣促喘息、口干音啞、咽喉腫痛等，療效確切，應(yīng)用廣泛.

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組與造模

將購買的80只小鼠常規(guī)(室溫26 ℃,濕度55%)飼養(yǎng)3 d后，根據(jù)隨機數(shù)字表分為模型組64只和正常組16只(每組雌雄各半).根據(jù)《實用中醫(yī)證候動物模型學》等相關(guān)文獻介紹，自制煙熏箱采用改良煙熏法(煙葉、刨花)刺激模型組小鼠制備急性支氣管炎模型(每次30 min，每日2次，共1周)[5]，正常組小鼠常規(guī)飼養(yǎng).造模結(jié)束后，隨機從兩組中各選4只小鼠，取其肺組織，進行HE染色，檢測病理形態(tài)學表現(xiàn)，鑒定模型制備成功與否.

1.2.2 再次分組及干預方法

模型制備完成后，將正常組小鼠12只常規(guī)飼養(yǎng).模型組60只小鼠隨機分為5組，即空白模型組，小兒清熱止咳口服液組,清肺止咳方低、中、高劑量治療組，每組12只，雌雄各半；所有小鼠每日進行灌胃治療1次，共計1周.其中正常組、空白模型組小鼠給予生理鹽水灌胃(0.027 mL·g-1·d-1)；治療組予相應(yīng)藥物灌胃，清肺止咳方低、中、高劑量治療組予清肺止咳方灌胃(0.009 mL·g-1·d-1、0.018 mL·g-1·d-1、0.027 mL·g-1·d-1)，根據(jù)《中藥新藥研究指導原則》灌胃量分別為臨床用藥量的10、20、30倍；小兒清熱止咳口服液組灌胃量為0.009 mL·g-1·d-1.給藥期間由于灌胃不當，空白模型組、清肺止咳方高劑量組小鼠各死亡1只.

1.2.3 標本采集

灌胃治療1周后，將全部小鼠禁食12 h(自由飲水)，分別稱量體質(zhì)量后，頸椎脫臼處死小鼠.結(jié)扎小鼠主支氣管，分離取出雙側(cè)肺組織，將左側(cè)肺組織，置入4%多聚甲醛溶液中固定；另剪取右側(cè)肺組織，用無菌紗布包裹置于液氮中，轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱中保存.

1.2.4 免疫組化法檢測肺組織IL-1β、IL-6積分光密度

具體操作按照免疫組化試劑盒說明書進行.將4%甲醛固定的肺組織，常規(guī)脫水進行石蠟包埋，石蠟包埋后制備厚度4 μm切片，烤片，二甲苯脫蠟，梯度酒精脫二甲苯，蒸餾水沖洗，PBS緩沖液沖洗后在3% H2O2溶液中浸泡，蒸餾水沖洗后放置于枸櫞酸鹽緩沖液中加熱至沸騰后冷卻至室溫，進行抗原修復，冷卻沖洗后，加入封閉液，37 ℃反應(yīng)30 min，滴加相應(yīng)抗體(V抗體∶V抗體稀釋液=1∶100)，4 ℃過夜；再次沖洗后滴加生物素化山羊抗兔IgG，37 ℃反應(yīng)30 min，室溫下DAB顯色20 min后蒸餾水沖洗，復染，沖洗，脫水干燥，二甲苯透明，樹膠封片.在高倍視野下，細胞膜呈棕黃色著色為陽性細胞，用Image pro plus v6.0圖像分析系統(tǒng)測定陽性細胞積分光密度.

1.2.5 Western blot法檢測小鼠肺組織Nfr2、HO-1蛋白表達水平

剪取一小塊右側(cè)肺組織，置入RIPA裂解液中，充分混勻，超聲4次，每次10 s，然后放置冰上30 min，4 ℃、14 000 r/min離心15 min，然后收集上清液，提取總蛋白.根據(jù)BCA蛋白定量結(jié)果上樣，每泳道30 μg蛋白，進行SDS-PAGE凝膠電泳，至溴酚藍標記跑至膠底上方1 cm處；電泳后，30 V電壓過夜轉(zhuǎn)膜15 h，20%甲醇活化；PVDF膜置入0.05 g/mL脫脂奶粉溶液以最慢速度搖床封閉2 h，4 ℃過夜孵一抗(V一抗∶V一抗稀釋液=1∶2 000)；取出條帶，TBST洗6次，5 min/次，置入二抗+3%脫脂奶粉溶液，以最慢速度搖床，常溫2 h孵育二抗；曝光取出條帶，TBST洗6次,5 min/次，曝光顯影.采用BIO-RAD Image Lab軟件對蛋白表達進行分析，蛋白表達水平為目的條帶與β-actin內(nèi)參條帶吸光度值的比值.

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 模型制備結(jié)果及鑒定

模型制備完成后，正常組小鼠反應(yīng)活潑，體質(zhì)量增加，毛色亮澤；模型組小鼠出現(xiàn)打噴嚏、咳嗽癥狀，伴有精神萎靡、扎堆、瞇眼、撓鼻、毛色暗淡、體質(zhì)量增長緩慢或下降等.取各組小鼠肺組織制備病理切片，經(jīng)HE染色后于光鏡下進行鑒定：正常組小鼠肺組織內(nèi)氣管、肺泡、肺間質(zhì)結(jié)構(gòu)正常，上皮細胞正常；模型組小鼠氣管和支氣管黏膜明顯充血，間質(zhì)毛細血管擴張，肺泡及纖毛上皮細胞細胞損傷、脫落，黏液腺體增生，黏膜下層可見中性及淋巴細胞浸潤，符合支氣管炎病理表現(xiàn)(圖1).結(jié)合模型組小鼠的臨床表現(xiàn)可判定模型制備成功.

A：正常組；B：模型組.A:The normal group;B:The model group.

2.2 不同藥物及濃度對小鼠肺組織IL-1β、IL-6積分光密度的影響

各組小鼠肺組織IL-1β、IL-6免疫組化切片結(jié)果判讀：高倍鏡下，細胞膜呈棕黃色的為陽性細胞，陽性細胞越多，提示IL-1β、IL-6積分光密度越高.其中正常組與各治療組小鼠肺組織中的IL-1β、IL-6的積分光密度均低于模型組，具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；清肺止咳方低、中、高劑量組小鼠肺組織IL-1β、IL-6的積分光密度均低于小兒清熱止咳口服液組，且均具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；清肺止咳方低、中、高劑量組組間相比無統(tǒng)計學差異(P>0.05，圖2).

a：各組小鼠肺組織IL-1β免疫組化染色結(jié)果(×400)；b：各組小鼠肺組織IL-1β積分光密度；c：各組小鼠肺組織IL-6免疫組化染色結(jié)果(×400)；d：各組小鼠肺組織IL-6積分光密度. A：正常組；B：空白模型組；C：小兒清熱止咳口服液組；D：清肺止咳方低劑量組；E清肺止咳方中劑量組；F清肺止咳方高劑量組.1)與空白模型組比較，P<0.05；2)與正常組比較，P<0.05；3)與小兒清熱止咳口服液組比較，P<0.05.

2.3 不同藥物及濃度對小鼠肺組織Nfr2、HO-1蛋白表達的影響

與模型組相比，正常組與各治療組小鼠肺組織中的Nfr2、HO-1的蛋白表達水平均升高，且具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；清肺止咳方低、中、高劑量組小鼠肺組織Nfr2、HO-1的蛋白表達水平均高于小兒清熱止咳口服液組，且各組與小兒清熱止咳口服液組相比均具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；清肺止咳方低、中、高劑量組之間相比無統(tǒng)計學差異(P>0.05,圖3).

a：各組小鼠肺組織Nrf2、HO-1蛋白表達的Western blot結(jié)果；b：各組小鼠肺組織Nrf2蛋白相對表達水平；c：各組小鼠肺組織HO-1蛋白相對表達水平. A：正常組；B：空白模型組；C：小兒清熱止咳口服液組；D：清肺止咳方低劑量組；E清肺止咳方中劑量組；F清肺止咳方高劑量組.1)與空白模型組比較，P<0.05；2)與正常組比較，P<0.05；3)與小兒清熱止咳口服液組比較，P<0.05.

3 討論

急性支氣管炎的發(fā)病機制與氧化應(yīng)激反應(yīng)密切相關(guān)[6].當呼吸道黏膜受到炎癥刺激時，可產(chǎn)生大量的活性氧，過多的活性氧可破壞體內(nèi)的氧化還原平衡，誘發(fā)細胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)，引起黏膜細胞損傷甚至凋亡[7]，進而導致急性支氣管炎、肺炎等呼吸道相關(guān)疾病的發(fā)生.Nrf2/HO-1信號通路不僅具有抗感染、抗氧化作用，而且還能調(diào)控細胞的凋亡、自噬，對抗和修復氧化應(yīng)激反應(yīng)引起的局部損傷，進而防治呼吸系統(tǒng)相關(guān)疾病[8].其中Nrf2可以與氧化反應(yīng)元件蛋白結(jié)合，從而激活和上調(diào)抗氧化蛋白的表達，提高機體組織的抗氧化能力和氧自由基的清除能力，而且能下調(diào)機體組織對氧化應(yīng)激反應(yīng)的敏感性，進而維持機體組織的正常生理功能.另一方面，它同時可以抑制組織釋放IL-1β、IL-6、金屬蛋白酶等促炎物質(zhì)[9]，因此，Nrf2是氧化應(yīng)激反應(yīng)過程中的重要調(diào)控因子之一.HO-1是一種經(jīng)典的抗氧化劑，它能夠催化血紅素的降解，通過降解血紅素促進機體組織釋放IL-10等抗炎因子，不僅可以清除氧自由基，而且可上調(diào)、激活抗凋亡蛋白的表達，抑制氧化反應(yīng)，另一方面在降解過程中，能夠產(chǎn)生較多的CO，CO可以抑制IL-6、IL-1β等促炎因子的釋放[10]，進而減輕炎癥反應(yīng).因此HO-1能夠抑制氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)，同時參與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展，具有調(diào)節(jié)炎癥相關(guān)細胞因子表達的作用，與氧化應(yīng)激反應(yīng)密切相關(guān).IL-6是診斷肺部感染炎癥的重要實驗室指標之一，它可以激活炎癥反應(yīng)以及免疫反應(yīng)，參與宿主細胞的防御應(yīng)激反應(yīng)，加速疾病進展，并且能夠維持免疫反應(yīng)，其作為促使各種炎癥發(fā)生的關(guān)鍵細胞因子，得到了目前臨床上的公認[11].IL-6水平的下調(diào)，可以改善急性呼吸窘迫綜合征大鼠肺水腫及炎癥反應(yīng)[12].IL-1β屬于IL-1細胞因子家族，它可以通過誘導、參與表達ROS的中性粒細胞的活化，促使產(chǎn)生過量的ROS，從而損傷肺上皮細胞，加重炎癥反應(yīng)[13]，是炎癥反應(yīng)的一種重要介質(zhì).本研究的實驗結(jié)果顯示，正常組與各治療組小鼠肺組織中IL-1β、IL-6的積分光密度均低于模型組，其中以清肺止咳方治療組降低最為明顯；正常組與各治療組急性支氣管炎模型小鼠肺組織中Nfr2、HO-1的蛋白表達水平均高于模型組，以清肺止咳方治療組升高最為明顯，可以進一步說明在急性支氣管炎產(chǎn)生的病理環(huán)節(jié)中，IL-1β、IL-6具有明顯的促炎作用，而Nfr2、HO-1具有很好的抗炎作用.同時也表明清肺止咳方、小兒清熱止咳口服液均能有效治療急性支氣管炎模型小鼠，且清肺止咳方療效優(yōu)于小兒清熱止咳口服液.

急性支氣管炎可歸屬于中醫(yī)學“咳嗽”的范疇.《幼幼集成》曰：“……咳嗽屬脾肺者居多，以肺主氣，脾主痰故也.”指出咳嗽的主要病位在于肺、脾兩臟.《醫(yī)方集解·補養(yǎng)之劑第一》載“脾者，萬物之母也，肺者，氣之母也，脾胃一虛，肺氣先絕”，因此“肺脾相關(guān)”理論對肺系疾病的診斷及治療有重要的指導意義[14].

我國著名兒科專家李晏齡教授根據(jù)小兒臟腑相對嬌嫩，藩籬稀疏不固，容易被外邪所侵襲，加之其“陽常有余”的體質(zhì)特點，認為小兒感邪最易化熱，然“風為百病之長”，故指出臨床上以風熱型咳嗽最為多見.基于此，創(chuàng)立了清肺止咳方，該方是由黃芩、連翹、桑白皮、葶藶子、炙紫菀、茯苓、丹參、五味子、甘草等組成.方中黃芩擅長清泄肺火和上焦實熱，連翹既能疏散外感邪風，又可解毒清熱，二藥合用，表里雙清共為君藥；桑白皮、葶藶子相須為用，功專瀉肺平喘，炙紫菀化痰止咳，茯苓善健脾滲濕，四者合用止咳平喘，健脾化痰，瀉貯痰之器，絕生痰之源，共為臣藥；丹參活血祛瘀，使血行氣生，五味子益氣生津斂肺，二者共為佐藥；甘草，益氣補脾，調(diào)和諸藥，為使藥.小兒清肺止咳方前期進行的動物實驗研究結(jié)果表明其具有明顯的止咳、祛痰、抗感染的作用，可以調(diào)控Th1和Th2細胞亞群的平衡來抑制氣道炎癥，從而減少炎癥反應(yīng)的發(fā)生及致病因素對肺組織的損傷；前期臨床觀察表明，該方的臨床有效率為96.77%[15].

現(xiàn)代藥理學研究表明，黃芩的主要有效成分中的黃酮類化合物，具有抗感染、抗氧化、提升機體免疫力等作用[16]；連翹的水提物連翹酯能夠上調(diào)細胞因子Nrf2的特異性表達，促進其下游的抗氧化蛋白HO-1表達，進而降低細胞內(nèi)ROS水平[17]；桑白皮的提取物具有抗感染、抗病毒、抗氧化、抗過敏及免疫調(diào)節(jié)等藥理作用[18]；葶藶子中含有的槲皮素和β-谷甾醇等有效化合物可通過MAPK等靶標蛋白而有效抑制支氣管及肺組織炎癥的產(chǎn)生，激活機體的免疫應(yīng)答系統(tǒng)，減少促炎介質(zhì)的釋放及黏液的生成，緩解氣道的阻塞癥狀[19]；紫菀中所含有的紫菀酮、紫菀皂苷等均具有很好的祛痰作用[20]；茯苓中所含的茯苓多糖能夠提升機體的免疫水平，改善機體因免疫力低下產(chǎn)生的諸多問題[21]；丹參提取物中的丹參酮IIA可以上調(diào)HO-1的表達，減少機體產(chǎn)生ROS[22]；五味子中的五味子乙素能夠抑制炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生，同時能抑制NF-κB通路的激活[23]；甘草中的甘草多糖能降低腺病毒、柯薩奇病毒等呼吸道常見病毒的吸附力，并能夠減弱病毒進入細胞的能力，起到保護細胞的作用[24].

中藥具有減輕機體炎癥反應(yīng)以及抑制氧化應(yīng)激等作用，這在中醫(yī)臨床應(yīng)用和藥效機制等不同層面均有大量的研究文獻支持.其中，Nfr2/HO-1信號通路是急性支氣管炎治療的一個靶點.隨著現(xiàn)代社會經(jīng)濟的發(fā)展，人類的生活環(huán)境和生活習慣也發(fā)生了改變，兒科的疾病譜也隨之發(fā)生了改變，其中不典型病原體所引起的急性支氣管炎發(fā)病率也逐漸升高，西醫(yī)特異性藥物的研發(fā)需要較長周期，而中醫(yī)學臨證強調(diào)“辨證論治”，辨病與辨證相結(jié)合，三因制宜，加之中藥材來源充足，服用方便，應(yīng)用優(yōu)勢明顯.本實驗結(jié)果中，清肺止咳方低、中、高劑量3組小鼠的肺組織中IL-1β、IL-6積分光密度及Nfr2、HO-1的蛋白表達水平之間比較無統(tǒng)計學差異，表明清肺止咳方在治療急性支氣管炎模型小鼠時不存在劑量依賴性.因此運用中醫(yī)藥防治小兒咳嗽(急性支氣管炎)具有較大的優(yōu)勢和發(fā)展前景，同時運用現(xiàn)代分子醫(yī)學理論及現(xiàn)代藥理學研究理論可闡明中醫(yī)藥的作用機制，這為其臨床應(yīng)用提供了可靠的實驗室依據(jù).本研究是以臨床療效為基礎(chǔ)進行的實驗研究，結(jié)果表明該方治療急性支氣管炎的機制可能與通過Nfr2/HO-1信號通路調(diào)節(jié)炎癥因子水平有關(guān)，其更深入的作用機制有待進一步探索.

作者貢獻聲明

朱珊：提出研究思路和框架，修改論文；田新磊：設(shè)計實驗、統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)，撰寫論文；趙文錦：實驗操作，統(tǒng)計分析數(shù)據(jù).

利益沖突聲明

本研究未受到企業(yè)、公司等第三方資助，不存在潛在利益沖突.