肺表面活性劑與吸入納米藥物的相互作用

黃鄭煒, 鐘子喬， 陳智偉， 謝雨珂， 王文浩

(1. 暨南大學 藥學院, 廣東 廣州 510632; 2. 中山大學 藥學院, 廣東 廣州 510006)

近十年來，納米藥物(nanomedicines，NMs)發(fā)展迅猛，醫(yī)藥界逐漸將NMs應用于不同的給藥途徑.在肺部給藥方面，吸入NMs具有應用于包括哮喘、肺部感染和肺癌等肺部疾病的臨床治療前景[1].相比于全身化學療法及應用傳統(tǒng)藥物的吸入療法而言，吸入NMs既可通過呼吸道將治療藥物局部地輸送到肺患病組織，避免首過消除，減少全身性不良反應(如肝毒性[2])，又可控制藥物的釋放速度，達到緩釋的治療效果，減少給藥的頻率[3]，還可通過修飾NMs的表面基團使NMs獲得主動靶向性，從而實現(xiàn)被靶細胞特異性攝取[4]，優(yōu)勢顯著.

報道常見的用于肺部治療的NMs有聚合物膠束、脂質體、金屬納米粒、高分子囊泡和樹枝狀大分子等，通過物理包埋或化學結合的方式遞送藥物.除此之外，還有聚合物-藥物綴合物，通過化學鍵共價結合作用來實現(xiàn)載體與藥物的偶聯(lián).其中，脂質體、納米膠束和高分子囊泡生物相容性較好[5]且載藥能力較強[6]，研究最為廣泛.

雖然NMs優(yōu)勢顯著，但是臨床應用中NMs很可能受到肺表面活性劑(pulmonary surfactant，PS)的影響.PS會吸附到NMs的表面(圖 1)，從而形成生物分子層，影響NMs的生物化學特性[7]，

圖1 NMs吸附PS中的脂類和蛋白質等

使NMs的藥動學和藥效學行為改變.本文就PS的組成和特性、PS與NMs的相互作用對PS和NMs的影響及它們相互作用的表征方法等進行綜述，為吸入NMs的臨床應用提供參考.

1 肺表面活性劑

PS是由10%蛋白類和90%脂類組成的一種復雜磷脂蛋白混合物，最初在肺泡腔內的液體層中發(fā)現(xiàn)，后來發(fā)現(xiàn)其系由Ⅱ型肺泡上皮細胞合成并分泌.PS的主要成分為表面活性物質結合蛋白(surfactant-associated protein，SP)、二棕櫚酰卵磷脂(dipalmitoyl phosphatidylcholine)和其他脂類.SP約占PS的10%，包括表面活性蛋白A(SP-A)、表面活性蛋白B(SP-B)、表面活性蛋C(SP-C)、表面活性蛋白D(SP-D)、表面活性蛋白G(SP-G)和表面活性蛋白H(SP-H).這6種SP在肺組織發(fā)揮生理功能中起著非常重要的作用[8].SP-A與SP-D為大分子親水性SP，主要發(fā)揮防御功能，參與呼吸道免疫調節(jié).SP-A及SP-D通過聚集、調理素和促凋亡作用，及調控炎癥反應與活化吞噬細胞等生理機制，識別和消滅病原體[9].SP-B與SP-C是小分子疏水性SP，主要發(fā)揮調節(jié)表面張力，防止呼氣末肺泡萎縮的作用[10].SP-G和SP-H是近幾年來發(fā)現(xiàn)的新的肺表面活性物質結合蛋白[11]，其兼有SP-A、SP-D和SP-B、SP-C的功能[12].二棕櫚酰卵磷脂約占PS的41%，是含量最多的組分[11].

2 肺表面活性劑與吸入納米藥物的相互作用

NMs被吸入進肺深部遇到的一個重要的生物屏障就是PS,PS的多種成分會被吸附到NMs表面.當NMs與PS接觸時，基于NMs的理化特性，將誘導不同的PS成分參與到相互作用中.這可能會干擾粒子的預期藥理作用，且會影響到PS的正常功能，從而改變NMs的生物相容性或毒性[13].

PS中的蛋白質和脂質等與NMs形成絡合物，遵循由Vroman效應定義的吸附和解吸附動力學.這一動力學是與時間相關的過程，其中，豐度高親和力低的分子首先被吸附，然后被豐度較低親和力較高的分子替代[14-15].除了上述過程之外，高離子強度和PS內的蛋白質(主要是SP)吸附都會破壞NMs表面的穩(wěn)定性，導致NMs聚集體的形成.這種現(xiàn)象是否發(fā)生，既取決于蛋白質的濃度，也取決于NMs的理化性質[16].Ruge等[17]利用動態(tài)光散射和透射電子顯微鏡(transmission electron microscope)來研究SP-A與甘露糖化NMs的相互作用.這項研究表明SP-A與甘露糖化NMs結合形成了較強的聚集態(tài)，且SP-A可增加巨噬細胞對NMs的攝取.NMs聚集體的形成直接影響細胞攝取率.與單個NMs相比，A549細胞對聚集的金納米粒子攝取減少了25%[18].

總而言之，NMs表面吸附有PS時，NMs的各種性質，包括其穩(wěn)定性、疏水性、表面電荷、細胞攝取率和穿透能力等，都會發(fā)生很大的改變；同時，PS與NMs接觸后，PS的活性和壓縮性等生理功能也會受到影響.因此，深入了解PS與NMs的相互作用，減少或利用PS對NMs諸如表面吸附、細胞攝取率、疏水性和表面電荷等方面的影響，減弱NMs對PS生理功能的干擾，對推動NMs的實際臨床應用是非常重要的.

2.1 NMs與PS相互作用的分類

NMs與PS的相互作用是多種因素共同參與的結果(圖2).根據(jù)其中起主導作用的因素進行分類，大致可分為疏水作用、靜電相互作用[19]、氫鍵和范德華力[20]等.

圖2 NMs與PS相互作用示意圖

2.2 相互作用對吸入納米藥物的影響

2.2.1 對NMs疏水性和表面電荷等的影響

與血漿等其他生物流體相比，PS的脂質含量占比大得多，這導致了NMs吸附的活性物質成分在肺部區(qū)域中與其他解剖環(huán)境中明顯不同[21].這種表面吸附物質的結構取決于NMs的關鍵理化性質，如NMs的組成成分、親疏水性和表面電荷[19].已有研究證明氧化硅或氧化鋯吸入納米藥物并不直接與不含蛋白質的純脂樣品相互作用，推測NMs-PS脂質相互作用可能是由蛋白質介導的[22].一些蛋白質被吸附到NMs表面，如SP-D或抗菌肽，會觸發(fā)脂質的吸附[21-23].蛋白質的吸附會隨著NMs的濃度和表面積的增加而增加[23].

NMs的疏水性和表面電荷等理化性質在調節(jié)粒子在PS層上的轉運中起著重要的作用.Hu等[19]首次通過實驗證明了不同疏水性的NMs對一種外源天然PS生物物理性質的影響，同時利用分子動力學模擬研究PS單分子膜與不同理化性質的NMs之間的相互作用機理.NMs的疏水性決定了它們在天然PS膜上的位移程度.親水性NMs快速穿透PS單層，而部分疏水性NMs被PS單層捕獲.而NMs的表面電荷在影響NMs跨PS單層的位移中只起次要作用.Hu等[19]還發(fā)現(xiàn)陰離子NMs選擇性地吸附SP-B，但不吸附SP-C.因此，陰離子親水性NMs可以誘導SP-B從PS單分子層中移出，但不能誘導SP-C移出.雖然陰離子疏水性NMs被PS膜捕獲，但它也選擇性將SP-B吸附到表面.這項研究的數(shù)據(jù)表明，靜電和疏水相互作用之間的平衡是NMs移位和與PS單分子層相互作用的原因.此外，DPPC等脂質在檸檬酸穩(wěn)定的銀NMs上的吸附已被證明可以降低這些NMs由于pH的影響而聚集的趨勢[24].

必須指出，在任何情況下，由于分子在其表面的吸附或在輸送過程中環(huán)境條件的改變而引起的NMs的電荷或聚集狀態(tài)的變化，都可能影響NMs的最終靶向部位[25].

2.2.2 對NMs細胞攝取率等的影響

進入肺深部是NMs被肺泡上皮細胞攝取的先決條件.而NMs表面吸附PS這一現(xiàn)象已經(jīng)被證明在調控NMs轉運過程里起著重要的作用：僅當吸附PS后，某些NMs才可被轉運至肺深部.例如，Tomoko等[26]向大鼠氣管內注射卵磷脂包覆和未包覆的聚苯乙烯微球，結果顯示這兩種微球都被肺泡巨噬細胞吸收，而只有卵磷脂包覆的微球可進入Ⅰ型和Ⅱ型肺泡上皮細胞(圖3).

PS除了具有運送NMs進入肺深部的獨特能力外，還具有促進肺泡細胞攝取NMs的能力.Yan等[27]使用一種具有代表性的霧化親水性藥物的模型納米液滴，利用分子動力學模擬研究NMs與PS層的相互作用.為了讓納米液滴的表面疏水性更強，他們還設計了一種脂質包被的納米液滴.此項研究結果表明，裸露的納米液滴迅速黏附在PS層上，釋放出擴散到PS層的藥物.裸露的納米液滴具有較高的表面張力，這一性質增強了其跨層擴散，但與此同時，納米液滴破壞了PS層的超微結構.通過在納米液滴上涂蓋脂質，減少了納米液滴對PS的擾動作用.而且脂質包裹的納米液滴可以很容易地被PS層包裹形成泡狀結構，這可能會促進與細胞膜的融合，從而促進藥物向次級器官的釋放.由此可知，PS吸附到NMs表面，或利用脂質修飾NMs，均可改變NMs的穿透能力和被細胞攝取的能力.

近年來，PS修飾的脂質體被提出以促進藥物的吸收[28].De Backer等[29-30]觀察到在體內和體外，包覆PS的比未包覆的葡聚糖納米凝膠更有效地將siRNA輸送到不同類型的細胞.PS組分以某種方式促進了NMs在細胞內移位到胞質中，在胞質里siRNA產(chǎn)生沉默.另外，提出SP-B蛋白可能是PS中影響siRNA傳遞效率的關鍵因素.近幾年來，Merckx等[31]確定SP-B是上述納米復合材料增強siRNA遞送效率的關鍵成分，且首次將天然SP-B與改善小RNA療法的細胞遞送聯(lián)系起來.利用小鼠脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導的急性肺損傷模型，在體內同樣證明了SP-B促進轉運的作用.

2.3 相互作用對肺表面活性劑的影響

NMs與PS的相互作用除對NMs產(chǎn)生顯著影響之外，也會導致PS生理功能的改變.吸入NMs與活性氧(reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生有關，而ROS的產(chǎn)生會直接導致Ⅰ型和Ⅱ型肺泡上皮細胞的損傷.肺泡上皮細胞的損傷和炎癥會進一步影響PS的合成、組成、結構、代謝和功能等[32].

PS由脂質和多種蛋白組成，它們的協(xié)同作用在PS行使正常生理功能中起關鍵作用.因此，如果某些組分被移除或破壞，PS的生理功能可能會受到嚴重損害.而由于NMs理化性質的特點，它會選擇性吸附PS的某些成分，導致PS成分的缺失[13].疏水性SP的缺失將導致PS表面活性的抑制.例如，當SP-B或SP-C被NMs吸附時，它們會從PS膜中除去，從而導致PS活性抑制.SP-B或SP-C含量降低到一定水平以下會導致PS在氣液界面的吸附減少，從而限制其降低表面張力的能力以及其壓縮性[31].親水性SP也可能吸附于NMs表面，導致PS生理功能受損.例如，單壁碳納米管在動物模型上可以吸附SP-A和SP-D[33].金屬氧化物納米顆粒傾向于吸附SP-A，金納米顆粒傾向于吸附SP-D[24].這兩種蛋白的完全或部分缺失也與肺先天免疫防御受損有關[34].

親疏水性不同的NMs也會對PS產(chǎn)生不盡相同的影響.在Langmuir-Blodgett槽中進行的研究表明，疏水NMs能夠與PS發(fā)生相互作用，聚集在脂質凝聚域周圍，使其變得更小，從而使界面膜流態(tài)化[23].而利用親水性聚合物NMs的研究證實，它們可以保留在PS單分子層中形成聚集體，干擾亞相物質的相變和再吸附，并增加膜的可壓縮性[19, 23].盡管它們增加了壓縮性，抑制了相變，增加了最小表面張力，但實際影響并不明顯.

此外，不同尺寸的NMs會對PS產(chǎn)生不同程度的影響.Dwivedi等[35]考察了不同粒徑的疏水NMs對PS薄膜的影響，觀察到12 nm和20 nm的NMs對PS薄膜的影響不大.然而，在原子力顯微鏡(atomic force microscopy)下觀察到，136 nm NMs增加了模型PS薄膜的壓縮性，這是由于形成了多層凸起結構，阻礙了最小表面張力的獲得，引發(fā)PS功能障礙.這項研究得出的結論是，136 nm NMs對PS產(chǎn)生的影響比12 nm NMs更為顯著(圖4).

圖4 不同尺寸的NMs對模型PS薄膜的影響

本文所涉及的NMs與PS相互作用的研究及其相應體系如表1所示.

表1 NMs與PS相互作用Table 1 Summary of the interaction between PS and NMs

3 肺表面活性劑與吸入納米藥物相互作用的表征方法

一方面，NMs在被吸入后，部分NMs與PS之間的相互作用將導致NMs的性質變化.另一方面，此相互作用可能會影響PS系統(tǒng)的正常功能.因此，有必要研究NMs與PS的相互作用，以確定NMs的生物相容性，并幫助追蹤這些NMs對肺部生理活動的影響.目前常用的NMs與PS相互作用的表征方法如圖5.

圖5 NMs與PS相互作用的表征方法

在對表面吸附有PS的NMs進行形態(tài)學研究時，一般會采用透射電子顯微鏡和原子力顯微鏡來進行表征.Hatami等[36]利用透射電子顯微鏡觀察單寧酸-肺液復合體形成的聚合物形態(tài)狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)單寧酸-肺液配合物可自組裝為球形顆粒，粒徑<30 nm.

為了分離鑒別NMs與PS之間的相互作用后NMs表面所吸附的蛋白，通常會采用聚丙烯酰胺凝膠電泳法(polyacrylamide gelelectrophoresis)、體積排阻色譜法(size exclusion chromatography)、流體動力相互作用色譜法(hydrodynamic interaction chromatography)和液相色譜-質譜聯(lián)用方法(liquid chromatograph-mass spectrometer)等[37-38].Tenzer等[39]用該方法鑒定出了硅納米給藥系統(tǒng)表面吸附了300余種不同的蛋白成分.

在檢測PS與NMs結合后所產(chǎn)生的構象變化時，通常使用的是圓二色光譜(circular dichroism)、傅立葉變換紅外吸收光譜儀(fourier transform infrared)和表面增強拉曼光譜(surface-enhanced raman spectroscopy)等譜學表征方法.此外，熒光相關光譜法(fluorescence correlation spectroscopy)適用于分析NMs和蛋白的結合力以及蛋白分子層的厚度.Hatami等[36]利用該法，通過熒光淬滅來描述單寧酸與肺液的絡合過程.

對NMs與PS的生物物理作用進行定性和定量分析時，可以采用基于耗散監(jiān)測石英晶體微平衡法(quartz crystal microbalance).Wan等[40]通過Langmuir吸附方程分析石英晶體微平衡法研究數(shù)據(jù)，確定了動力學和平衡參數(shù)，闡明了NMs和由脂質體組成的PS之間的相互作用的性質.

為了可視化NMs與PS之間的相互作用，可考慮粗?；姆肿觿恿W模擬方法.用這一方法進行表征的好處在于模型中保留了PS體系中必要的化學結構細節(jié)信息，定量地描述分子相互作用所造成的影響.焦鳳軒等[41]應用這一方法研究了NMs與肺泡表面磷脂膜相互作用的力學機理.

4 結論與展望

NMs具有諸多優(yōu)勢，其應用于肺部疾病治療的優(yōu)越性能也越發(fā)受到人們關注，然而目前鮮有上市產(chǎn)品.究其原因，主要是NMs進入肺深部后其與PS的相互作用機制尚不明了.為此，近年來很多研究對NMs與PS相互作用過程進行了深入探究，加深了NMs與PS的相互作用對NMs的體內命運及PS生理功能影響的認知，這為研究具有不同生物效應的NMs的設計制備和實際應用提供理論基礎.同時，許多表征NMs與PS相互作用的方法被提出，為從微觀水平上闡明NMs與PS的相互作用提供了更為豐富的條件.

盡管如此，掌握NMs表面吸附PS形成相互作用復合物的作用機制仍然是一項具有挑戰(zhàn)性的任務.探索NMs與PS的相互作用是NMs的生物化學、藥理學和毒理學研究的一個非常重要組成部分.闡明NMs與PS相互作用的機制及影響因素，構建NMs與PS相互作用的分子模型，進而主動對NMs表面進行修飾，使其主動吸附PS的某些組分而具有靶向特定細胞的能力，或者規(guī)避PS的吸附而提高NMs體內命運的可預測性，這是推動NMs臨床轉化的潛在研究方向，有待進一步探索.

作者貢獻聲明

黃鄭煒：提出研究方向，撰寫文章并對擬發(fā)表文章作最后審閱及定稿；鐘子喬：整理文獻資料，制作圖表及撰寫文章“相互作用對吸入納米藥物的影響”部分；陳智偉：撰寫文章“相互作用的表征方法”部分及修改論文；謝雨珂：撰寫文章“相互作用對肺表面活性劑的影響”部分及修改論文；王文浩：確定研究內容及修改文章.

利益沖突聲明

本研究未受到企業(yè)、公司等第三方資助且不存在潛在利益沖突.