基于β 2AR2/β arrestin2/NFκB通路的地佐辛對心肌缺血再灌注損傷大鼠的作用及機(jī)制*

閆照虹 喻倩 李娟 張芳芳 劉偉娜

(空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院麻醉科，陜西 西安 710038)

急性心肌梗死(Acute mycardia infarctin，AMI)是冠狀動脈閉塞使血流中斷，導(dǎo)致部分心肌嚴(yán)重缺血而發(fā)生局部壞死。再灌注療法是治療AMI最重要的方法，但研究已證明心肌組織缺血一定時(shí)間后重新恢復(fù)血流，會誘發(fā)心肌損傷，導(dǎo)致繼發(fā)性心臟損害甚至死亡，這一過程稱為心肌缺血再灌注損傷(Myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)[1-2]。盡管MIRI的確切原因尚不清楚，但研究認(rèn)為炎癥反應(yīng)是缺血后繼發(fā)再灌注心肌損傷的主要因素之一[3-4]。在血流恢復(fù)到梗塞區(qū)域后，大量炎癥細(xì)胞被募集到損傷部位進(jìn)行組織修復(fù)。但心臟炎癥反應(yīng)的持續(xù)發(fā)展會導(dǎo)致不良的心臟重塑，不可避免地導(dǎo)致心力衰竭[5]。目前臨床尚無有效的治療方案，由缺血再灌注引起的梗塞擴(kuò)大占梗塞總數(shù)的25%～50%，因此迫切需要加強(qiáng)對心臟的保護(hù)[6]。地佐辛是一種新型強(qiáng)效的阿片類鎮(zhèn)痛藥，具有起效快、鎮(zhèn)痛作用強(qiáng)、成癮性低、不良反應(yīng)少等優(yōu)點(diǎn)[7]，已經(jīng)在臨床上廣泛用于手術(shù)后、胃鏡檢查和致癌鎮(zhèn)痛[8-9]。地佐辛具有很好的抗炎鎮(zhèn)痛作用，對缺血再灌注損傷也有保護(hù)作用，可保護(hù)下肢缺血再灌注誘發(fā)的心肌損傷；此外許多研究證據(jù)表明，阿片類藥物具有抗心肌缺血/再灌注損傷的心臟保護(hù)作用[10-11]。以上研究提示，地佐辛可能對心肌缺血再灌注損傷也有保護(hù)作用，但相關(guān)報(bào)道鮮少。因此，本研究通過復(fù)制MIRI大鼠模型，旨在探討地佐辛對MIRI的影響及其潛在的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級健康SD雄性大鼠60只，體重(260～280)g，由北京維通利華動物中心提供，許可證號為SCXK(京)2016-0011，所有動物均嚴(yán)格按照動物飼養(yǎng)規(guī)則喂養(yǎng)，溫度為(24±2)℃，濕度為50%～60%，自由飲水和攝食。本研究遵循動物倫理要求，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核、批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑 地佐辛注射液(揚(yáng)子江藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字H20080329，生產(chǎn)批號：20130503，規(guī)格1 mL：5 mg)；原位缺口末端標(biāo)記法(TdT-mediatedd UTP nick end labeling，TUNEL)染色試劑盒購自武漢博士德生物公司；HE染色試劑、RIPA裂解液和BCA試劑盒(碧云天生物科技公司，批號分別為C0105、P0013B、P0012S)；肌酸激酶(Creatine kinase，CK)、肌酸激酶同工酶MB(Creatine kinase isoenzyme MB，CKMB)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號分別為A032-1、E006-11)；腫瘤壞死因子α(TNF-α)(RA20035)、白細(xì)胞介素6(IL-6)(RA20607)ELISA檢測試劑盒購自武漢貝茵萊生物科技有限公司；兔抗B細(xì)胞淋巴瘤-2(Bcl-2)(bs-0032R)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)(bs-0127M)、半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)(bs-0081R)、β2腎上腺素受體(β2AR)(bs-0947R)、β-抑制蛋白2(β-arrestin2)(bs-1332R)、核因子κB抑制蛋白α抗體(IκBα)(bs-1287R)、NF-κB p65(bs-23216R)、beta-Actin(bs-0061R)、山羊抗兔IgG(H+L)/HRP(bs-40295G-HRP)均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；BL-420F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)；多功能酶標(biāo)儀(iMark680，Bio-Rad公司)、熒光顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.3 方法

1.3.1 大鼠分組與MIRI模型的制備 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham組)，心肌缺血再灌注模型組(MIRI組)，地佐辛高、中、低劑量組(20、10、5 mg/kg)[11]，每組12只。地佐辛高、中、低劑量組大鼠在造模前30 min經(jīng)股靜脈注射地佐辛20、10、5 mg/kg，Sham組和MIRI組給予等量生理鹽水，預(yù)處理完成后，采用手術(shù)結(jié)扎大鼠冠狀動脈左前降支的方法復(fù)制大鼠MIRI模型[12]：各組大鼠于末次給藥后禁食不禁水12 h，腹腔注射40 mg/kg的戊巴比妥鈉麻醉，仰臥位固定，連接肢體心電圖電極和小動物呼吸機(jī)，心前區(qū)脫毛備皮，碘伏消毒，沿左側(cè)第3、4肋間切開皮膚，打開胸腔，剪開心包，暴露心臟，使用止血鉗將左心耳提起，以0號縫合線在左心耳下方2 mm(冠狀動脈左前降支)活結(jié)結(jié)扎，45 min后打開結(jié)扎線恢復(fù)血流行再灌注2 h。以缺血時(shí)心肌局部蒼白或發(fā)紺，心電圖ST段持續(xù)抬高，再灌注時(shí)心肌紅潤且ST段下降1/2為造模成功。Sham組不進(jìn)行結(jié)扎，其余操作同上；手術(shù)時(shí)模型組大鼠死亡1只，再灌注時(shí)模型組、地佐辛低、中劑量組各死亡1只(在造模過程中部分大鼠死亡，但每組樣本數(shù)量是足夠的，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上仍有統(tǒng)計(jì)意義，不影響研究結(jié)果)。

1.3.2 心功能檢測 再灌注2 h后，麻醉大鼠，檢測各組大鼠心率(Heart rate，HR)，并分離右側(cè)頸總動脈，將PE50聚乙烯動脈導(dǎo)管經(jīng)右頸總動脈插入至左心室，固定后用生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)檢測并記錄左心室收縮壓(Left ventricular systolic pressure，LVSP)、左心室舒張末(Left ventricular end-diastolic pressure LVEDP)，評價(jià)心臟功能。

1.3.3 心肌酶及炎性指標(biāo)檢測 心功能檢測完成后，腹主動脈取血，靜置后以3000 r/min離心15 min，分離血清，按照試劑盒說明書的操作檢測血清中CK、CK-MB、TNF-α、IL-6水平。

1.3.4 心肌組織病理學(xué)檢查 取血完成后快速摘取心臟，將大鼠左心室缺血區(qū)心肌組織分為兩部分，一部分液氮速凍后，-80 ℃冰箱保存待測；另一部分心肌組織，4%的多聚甲醛溶液固定，4 ℃過夜，梯度乙醇脫水、石蠟包埋、切片，蘇木精-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察左心室組織學(xué)變化。

1.3.5 心肌細(xì)胞凋亡檢測(TUNEL染色) 將1.3.4制備的心肌組織石蠟切塊，切4 μm切片。細(xì)胞凋亡檢測按TUNEL原位細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書操作，細(xì)胞核固縮、染色體凝集呈棕褐色者為凋亡細(xì)胞。在400倍光鏡下觀察心肌細(xì)胞凋亡情況，每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)視野拍照，Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件計(jì)算細(xì)胞總數(shù)和凋亡細(xì)胞，取平均值，計(jì)算細(xì)胞凋亡指數(shù)。細(xì)胞凋亡指數(shù)(%)=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%

1.3.6 心肌組織凋亡相關(guān)蛋白的檢測(免疫組織化學(xué)法) 將1.3.4制備的心肌組織石蠟切塊，切片。按照試劑盒說明書步驟操作，將切片放入煮沸的檸檬酸修復(fù)液做抗原修復(fù)，3% H2O2去離子水孵育10 min，滴加一抗Iba-1，4℃冰箱孵育過夜，二抗顯色，光學(xué)顯微鏡觀察心肌組織中Bcl-2、Bax、Caspase-3的蛋白表達(dá)。每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)視野拍照，Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件測定陽性表達(dá)的平均光密度值(mean IOD)。

1.3.7 Western blot檢測 心肌組織β2AR、β-arrestin2、IκBα、NF-κB p65蛋白表達(dá)取-80℃冰箱保存的心肌組織，加入RIPA裂解液研磨后，置于冰上，靜置后離心，提取上清液為總蛋白溶液。用BCA法測量蛋白濃度后取等量蛋白質(zhì)樣品(30 μg/孔)，SDS-PAGE凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉，加入相應(yīng)一抗(β2AR、β-arrestin1、IκBα、NF-κB p65 按照1∶1000比例進(jìn)行稀釋、β-actin 1∶5000按比例進(jìn)行稀釋)于4℃下孵育過夜，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗(1∶5000)室溫孵育1 h，ECL顯色，以β-actin為內(nèi)參，通過與內(nèi)參的灰度比，得出目的條帶的相對表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 地佐辛對MIRI大鼠心臟功能的影響 與Sham組相比，MIRI組大鼠HR、LVSP顯著降低、LVEDP顯著升高(P<0.05)；與MIRI組相比，地佐辛高、中、低劑量組大鼠HR、LVSP顯著升高、LVEDP顯著降低(P<0.05)，且地佐辛高劑量組效果優(yōu)于地佐辛中、低劑量組，呈一定的劑量依賴性。見表1。

表1 地佐辛對MIRI大鼠心臟功能的影響

2.2 地佐辛對MIRI大鼠血清中CK、CK-MB、TNF-α、IL-6水平影響 與Sham組相比，MIRI組大鼠CK、CK-MB、TNF-α、IL-6水平顯著升高(P<0.05)；與MIRI組相比，地佐辛高、中、低劑量組大鼠CK、CK-MB、TNF-α、IL-6水平顯著降低(P<0.05)，且呈一定的劑量依賴性。見表2。

表2 地佐辛對MIRI大鼠血清CK、CK-MB、TNF-α、IL-6水平影響

2.3 地佐辛對MIRI大鼠心肌組織病理學(xué)變化的影響 HE染色結(jié)果顯示，Sham組大鼠的心肌細(xì)胞形態(tài)規(guī)則、排列整齊、心肌纖維完整，未見心肌細(xì)胞水腫、壞死；與Sham組相比，MIRI組大鼠心肌嚴(yán)重受損，染色疏松，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則、排列紊亂、局部肌纖維橫紋消失，可見心肌細(xì)胞水腫變性，大量炎性細(xì)胞浸潤；與MIRI組相比，地佐辛高、中劑量組大鼠心肌細(xì)胞水腫減輕，心肌纖維排列較為整齊，纖維斷裂和炎性細(xì)胞浸潤減少，且地佐辛高劑量組效果優(yōu)于地佐辛中劑量組。見圖1。

圖1 大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)改變(HE染色，200×)

2.4 地佐辛對MIRI大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響 TUNEL染色結(jié)果顯示，Sham組凋亡細(xì)胞數(shù)量較少，與Sham組相比，MIRI組大鼠的心肌細(xì)胞核呈深褐色，凋亡數(shù)量顯著增加，心肌細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)；與MIRI組相比，地佐辛高、中、低劑量組大鼠凋亡細(xì)胞個(gè)數(shù)明顯減少，心肌細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.05)，呈一定的劑量依賴性。見表3、圖2。

表3 地佐辛對MIRI大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響

圖2 大鼠心肌細(xì)胞凋亡情況(TUNEL)

2.5 地佐辛對MIRI大鼠心肌組織凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 免疫組化結(jié)果顯示，與Sham組相比，MIRI組大鼠心肌組織Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)升高，Bcl-2/Bax比值顯著降低(P<0.05)；與MIRI組相比，地佐辛高、中劑量組大鼠Bcl-2蛋白表達(dá)明顯升高，Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)明顯降低，Bcl-2/Bax比值顯著升高(P<0.05)，呈一定的劑量依賴性。見圖3、表4。

表4 地佐辛對MIRI大鼠心肌組織Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)的影響

圖3 大鼠心肌組織Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)(IHC)

2.6 地佐辛對MIRI大鼠心肌組織β2AR、β-arrestin2、IκBα、NF-κB p65蛋白表達(dá)的影響 Western blot結(jié)果顯示，與Sham組相比，MIRI組大鼠心肌組織β2AR、β-arrestin2、IκBα蛋白表達(dá)顯著降低，NF-κB p65蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)；與MIRI組相比，地佐辛高、中劑量組大鼠心肌組織β2AR、β-arrestin2、IκBα蛋白表達(dá)明顯升高，NF-κB p65蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)，呈一定的劑量依賴性。見表5、圖4。

表5 地佐辛對MIRI大鼠心肌組織β2AR/β-arrestin2/NF-κB p65通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

圖4 大鼠心肌組織β2AR/β-arrestin2//NF-κB p65通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

3 討論

再灌注治療是指通過藥物溶栓，支架植入術(shù)，或切除血栓將血液灌注缺血區(qū)域。但研究顯示在急性缺血性心肌再灌注治療過程中，一些接受再灌注治療的患者可能會增加心肌細(xì)胞死亡和心肌梗塞面積。再灌注治療是導(dǎo)致心肌細(xì)胞死亡的重要因素[13-14]。血流突然恢復(fù)后，心肌細(xì)胞受復(fù)雜事件(如鈣超載，離子穩(wěn)態(tài)損失和氧自由基產(chǎn)生)的影響，激活細(xì)胞內(nèi)損傷級聯(lián)反應(yīng)，從而導(dǎo)致凋亡發(fā)生[15-16]。目前尚無有效的治療方法，因此解決或減輕局部缺血和再灌注損傷仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)。

地佐辛是一種對5-羥色胺和去甲腎上腺素再攝取具有抑制作用的新型阿片樣受體拮抗鎮(zhèn)痛藥，可以激動κ受體，部分激動δ受體，已經(jīng)在臨床上用于超前鎮(zhèn)痛和手術(shù)后鎮(zhèn)痛，其鎮(zhèn)痛效果可在肌內(nèi)或靜脈內(nèi)注射后的10～90 min內(nèi)達(dá)到峰值，鎮(zhèn)痛作用與嗎啡相似或稍高，精神依賴性及相關(guān)不良反應(yīng)較少[17]，是一種應(yīng)用前景廣闊的新型藥物。地佐辛具有很好的抗炎鎮(zhèn)痛作用，可顯著降低腹腔鏡手術(shù)患者血清炎性因子水平，還可抑制TLR4-NF-κB通路，降低神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓組織TNF-α、IL-6水平[18]，降低腦缺血再灌注引起的神經(jīng)元凋亡[19]，改善缺血再灌注引起的多種遠(yuǎn)端器官損傷，如肺、腎等。此外有研究發(fā)現(xiàn)，κ-和/或δ-阿片受體的激活可直接參與心肌保護(hù)[20]，同類阿片藥物對MIRI具有顯著的心肌保護(hù)作用，如嗎啡可抑制炎癥因子和氧化應(yīng)激反應(yīng)，降低血清CK、CK-MB、心肌肌鈣蛋白I(cTnI)水平和心肌梗死面積，減少大鼠心肌細(xì)胞凋亡，減輕大鼠MIRI[21]。由此推測，地佐辛可能對心肌缺血再灌注損傷有保護(hù)作用。雖然地佐辛的研究較多，但在心肌缺血再灌注相關(guān)報(bào)道鮮少，因此在進(jìn)行動物藥效試驗(yàn)時(shí)，設(shè)置濃度梯度，目的是為了考察藥物的量效關(guān)系，為藥物的安全性和臨床用藥提供參考。本研究通過結(jié)扎大鼠冠狀動脈左前降支復(fù)制MIRI模型，結(jié)果顯示隨著地佐辛濃度的增加，模型大鼠的血清CK、CK-MB、TNF-α、IL-6水平依次降低；纖維斷裂和炎性細(xì)胞浸潤情況依次減輕，并且凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2的表達(dá)和Bcl-2/Bax比值依次升高，Bax、Caspase-3的表達(dá)依次降低，心肌細(xì)胞凋亡減少；這提示，地佐辛可呈劑量依賴性地抑制炎癥反應(yīng)，減少心肌細(xì)胞凋亡，減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷。

NF-κB是一種轉(zhuǎn)錄因子，與NF-κB/Rel蛋白家族中不同亞單位形成的二聚體，包括p65、RelB、c-Rel、p50和p52，其中最主要的是NF-κB p65，它的活化可將其從NF-κB抑制蛋白IκBα中快速釋放，進(jìn)入細(xì)胞核，促進(jìn)多種促炎細(xì)胞因子的表達(dá)；抑制NF-κB途徑，可減少缺血再灌注誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡[22]。有研究發(fā)現(xiàn)β2AR激活程度對心功能有重要影響，交感神經(jīng)對心功能的調(diào)控作用是通過激活心肌細(xì)胞上的β-AR實(shí)現(xiàn)的，β2AR可與去甲腎上腺素(NE)結(jié)合，調(diào)節(jié)心血管功能和行為特征；地佐辛可阻斷去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(NET)的作用，抑制神經(jīng)元突觸前膜對NE的再攝取[23]。而且β2AR激動劑能在免疫和炎癥反應(yīng)中抑制NF-κB活性[24]，但是這一過程要通過β-arrestin2發(fā)揮作用。β2AR的表達(dá)增加可通過上調(diào)β-arrestin2的表達(dá)，抑制IκBα的降解，穩(wěn)定NF-κB/IκBα復(fù)合物，抑制NF-κB的活化，減少炎性因子的釋放[25]。Wen等[26]發(fā)現(xiàn)，β-arrestin2基因的敲除可顯著惡化缺血再灌注引起的肝損傷，β2AR激動劑可上調(diào)β-arrestin2的表達(dá)，然后通過抑制TLR4-NF-κB途徑減輕小鼠肝缺血再灌注誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和肝臟炎癥。本研究采用Western blot進(jìn)一步檢測心肌組織中β2AR、β-arrestin2、IκBα、NF-κB p65蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示MIRI模型組大鼠心肌組織中β2AR、β-arrestin2、IκBα蛋白表達(dá)顯著降低，NF-κB p65蛋白表達(dá)顯著升高，而經(jīng)地佐辛干預(yù)的大鼠心肌組織β2AR、β-arrestin2、IκBα蛋白表達(dá)明顯升高，NF-κB p65蛋白表達(dá)明顯降低；這提示地佐辛對MIRI大鼠的保護(hù)作用可能與上調(diào)β2AR、β-arrestin2、IκBα的表達(dá)，從而降低NF-κB p65表達(dá)有關(guān)。

4 結(jié)論與啟示

地佐辛可抑制炎癥反應(yīng)，減少心肌細(xì)胞凋亡，對MIRI大鼠具有保護(hù)作用；其作用機(jī)制可能與上調(diào)β2AR、β-arrestin2、IκBα的表達(dá)，降低NF-κB p65表達(dá)有關(guān)。因條件限制本研究僅從動物水平進(jìn)行了探討，后續(xù)可考慮采用心肌細(xì)胞，從體外細(xì)胞水平進(jìn)行深入研究；且可考慮干預(yù)β2AR/β-arrestin2/NF-κB p65通路從反面驗(yàn)證本研究結(jié)果。