Krüppel樣因子相關microRNAs在肺癌中調控作用的研究進展*

龔海英 何芳 黃語嫣 龐敏 姜永杰 綜述 蔣莉 鄧太兵 審校

(1.川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科，四川 南充 637000；2.川北醫(yī)學院,四川 南充 637000;3.廣安市人民醫(yī)院，四川 廣安 638001)

據統(tǒng)計，2020年全球惡性腫瘤約有1930萬新發(fā)病例和近1000萬死亡病例，肺癌仍是癌癥死亡的主要原因，為威脅人類健康和社會發(fā)展的重要疾病[1]。盡管近年來肺癌在精準醫(yī)療診治方面得到長足發(fā)展，但其預后并不令人滿意，因此，尋找新的藥物靶點至關重要。有研究發(fā)現(xiàn)復雜的多功能調控因子網絡促成腫瘤進展的潛在機制，如持續(xù)的增殖調控，逃避免疫監(jiān)視，癌基因過度表達，細胞凋亡抑制，以及與在癌癥發(fā)生和轉移中發(fā)揮相互作用[2-3]。越來越多的研究表明，microRNAs(miRNAs)在Krüppel樣因子(Krüppel-like factors, KLFs)調控中起著關鍵作用，其失控可能與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關，miRNAs的上調或下調可以激活或抑制不同KLFs，發(fā)揮不同生物學作用。本研究對近年來KLFs相關miRNAs在肺癌中的研究進展作一綜述，旨在為進一步尋找治療靶點提供參考。

1 Krüppel樣因子家族

Krüppel(Kr)是哺乳動物果蠅的一個分節(jié)基因，能編碼一種和轉錄因子IIIA(Transcription factor,TFIIIA)DNA結合的鋅指模序共有蛋白。目前為止，哺乳動物體內17個家族成員被發(fā)現(xiàn)并得到深入研究[4]。所有KLFs成員C-端由81個氨基酸組成，均含有三個保守的Cys2-His2 鋅指 DNA結合區(qū)[5]，與轉錄因子Sp1(Transcription factor Sp1)的DNA結合域結構相似，因此KLFs是Sp1/Krüppel樣轉錄因子家族中的一個亞家族[6]，通過與富含GC序列(包括 GC盒和GT盒即CACCC盒)的多個基因的啟動子區(qū)結合而發(fā)揮調節(jié)作用。其N-端含有轉錄調節(jié)結構域，包括酸性反激活域、SIN-3相互作用抑制因子結構域和C末端結合蛋白(C-Terminal Binding Protein，CtBP)，可結合輔助因子發(fā)揮不同的功能。通過調節(jié)基因轉錄，在不同條件下KLFs參與多種病理生理過程，如細胞增殖、分化、凋亡、遷移和癌細胞調控等[6]。文獻[7-9]報道，KLFs通過參與調控轉化生長因子-β/Smad(transforming growth factor-β,TGF-β) 、MAPK、Notch、EGFR等信號通路，在多種腫瘤細胞轉移中發(fā)揮調節(jié)作用，如KLF4與胰腺癌、肺癌，KLF6與乳腺癌、卵巢癌等。初步研究發(fā)現(xiàn)[10]肺癌組織中KLF4表達降低，且與腫瘤分化程度呈正相關，與TNM分期呈負相關，miR-200c、miR-148、miR-29 可能通過下調KLF4的表達參與肺癌的發(fā)生、發(fā)展，為進一步探索肺癌調控分子機制奠定了基礎。

2 MicroRNAs

MicroRNAs(miRNAs)是一類具有轉錄后調節(jié)功能的短小非編碼RNA分子，長約17～22個核苷酸。這些分子與其同源轉錄mRNAs/lncRNAs的3′端非編碼區(qū)結合，通過抑制mRNA翻譯或誘導其降解而調節(jié)靶基因的表達[11-12]，它們可同時調節(jié)多個靶基因，參與多條信號通路途徑，成為有吸引力的治療靶點。據報道，不同的miRNAs在同一腫瘤類型中表達上調或者下調，通過調控不同靶基因在腫瘤中作為癌基因或抑癌基因，在腫瘤的增殖、侵襲和遷移、凋亡等生物學過程中發(fā)揮調控作用[13]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，肺癌組織、細胞株、外周血中均存在 miRNAs表達譜的異常，進一步分析發(fā)現(xiàn)，miRNAs的表達失調與肺癌患者存活率、腫瘤耐藥性等具有相關性[14-15]。鑒于miRNAs及KLFs在肺癌中的重要性，本研究簡要討論miRNAs和KLFs之間的相互作用及其與肺癌治療的相關性。

3 Krüppel樣因子相關microRNAs與肺癌

3.1 miRNAs在肺癌細胞增殖中的作用 細胞增殖失控是人類腫瘤的標志，正常的細胞分裂過程涉及一系列高度調控的細胞周期步驟[16]。miRNAs在肺癌增殖過程中扮演癌基因或抑癌基因的作用尚無一致結論，值得深入探討。目前關于肺癌發(fā)病分子機制的研究發(fā)現(xiàn)miRNAs和KLFs在肺癌進展中發(fā)揮關鍵作用，見表1、圖1。體外實驗證實，不同的miRNAs在肺癌中的表達不一，通過調控不同的KLFs參與腫瘤細胞增殖過程。

表1 Krüppel樣因子相關miRNAs在肺癌中的研究概況

圖1 Krüppel樣因子相關miRNAs在肺癌中的調控機制

3.1.1 miRNAs發(fā)揮抑癌基因的作用 Zhao等[17]研究報道，在肺癌中，生物信息學分析和熒光素酶報告基因分析表明，KLF7是miR-185的靶基因，miR-185在非小細胞肺癌組織中表達下調，過表達miR-185能負向調節(jié)KLF7的表達，抑制肺癌細胞的增殖、侵襲和上皮間質轉化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)。Wang等[18]發(fā)現(xiàn)miR-326靶向下調KLF3抑制A549和95D細胞的增殖、遷移、侵襲能力。miR-326表達降低與肺癌患者的不良預后有關。此外，研究還發(fā)現(xiàn)KLF3在體內外通過調節(jié)JAK2/STAT3和PI3K/AKT信號通路參與腫瘤細胞的生長。與Kong等[19]研究報道相反，馬玲等[20]發(fā)現(xiàn)上調或下調miR-141均可增加KLF9的表達水平，從而顯著抑制非小細胞肺癌的增殖和侵襲。

3.1.2 miRNAs發(fā)揮癌基因的作用 Han等[21]研究表明過表達miR-889能靶向下調KLF9水平，促進肺癌細胞的增殖和遷移，上調KLF6能逆轉miR-889對肺癌細胞增殖潛能的促進作用；此外該miR-889的表達水平與腫瘤大小和轉移有關，而與性別、年齡、吸煙史和組織學無關。Qi等[22]研究發(fā)現(xiàn)miR-660-5p在肺癌患者血漿和外泌體中表達顯著上調并能下調KLF9的表達，促進肺癌細胞增殖、遷移和侵襲。肺癌中，miR-20a-5p靶向下調KLF9的表達，促進非小細胞肺癌的增殖和侵襲。研究還發(fā)現(xiàn)miR-20a-5p在腫瘤組織和細胞系中表達上調，且其水平與腫瘤大小、淋巴結轉移呈正相關，腫瘤≥5 cm或伴有淋巴結轉移的肺癌患者miR-20a-5p表達水平尤為明顯[23]。Kong等[19]研究報道m(xù)iR-141在非小細胞肺癌組織和細胞中表達顯著升高，且其表達水平與腫瘤TNM分期、淋巴結轉移顯著有關，與腫瘤大小可能相關，而與年齡、性別無相關性。miR-141通過靶向抑制KLF9表達促進非小細胞肺癌增殖、侵襲，上調KLF9基因可部分逆轉高表達miR-141對非小細胞肺癌細胞增殖、侵襲的促進作用。Tong等[24]研究發(fā)現(xiàn)，生物信息學軟件和熒光素酶分析顯示KLF9是miR-570的靶基因，miR-570能負向調節(jié)KLF9的表達，進而顯著促進肺癌細胞的增殖和侵襲。Wang等[25]發(fā)現(xiàn)，miR-132-3p在肺癌組織和細胞中的表達水平顯著升高并能直接靶向KLF7，通過調節(jié)EMT，促進非小細胞肺癌的增殖、遷移和侵襲。朱麗等[26]采用qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)miR-4262在肺癌細胞中表達上調，轉染miR-4262 inhibitor后能夠逆轉肺癌細胞增殖、遷移、侵襲和EMT等惡性表型。同時，生物信息學軟件和熒光素酶報告基因實驗顯示miR-4262和KLF3互為靶向關系，下調miR-4262通過靶向上調KLF3的表達抑制肺癌細胞A549轉移潛能。劉翼等[27-28]研究均發(fā)現(xiàn)miR-10b能促進肺癌細胞株95-C和A549細胞的增殖及侵襲能力，其作用可能是通過下調KLF4蛋白表達相關，下調miR-10b表達有望成為非小細胞肺癌的潛在治療靶點，與唐靜等[29]報道一致。XU等[30]研究發(fā)現(xiàn)過表達miR-3120-5p能靶向下調KLF4水平，促進非小細胞肺癌的增殖和侵襲，上調KLF4能逆轉miR-3120-5p對非小細胞肺癌生長的促進作用，此研究也發(fā)現(xiàn)miR-3120-5p表達水平與淋巴結轉移和腫瘤分期呈正相關，miR-3120-5p可作為非小細胞肺癌患者的診斷標記物及干預治療的潛在靶點。同時，Meza-Sosa等[31]研究證實miR-7能明顯促進肺癌A549和HaCaT細胞的增殖和EMT。環(huán)狀RNA(Circular RNAs,circRNAs) 是一類新的沒有5′端和3′尾端的共價閉環(huán)的非編碼RNA(Noncoding RNA,ncRNAs)[32]。王燁等[33]研究證實hsa-miR-124-3p負向調控KLF4，促進肺癌細胞的增殖及遷移。Zhao等[34]研究發(fā)現(xiàn)CIRC_0067934在非小細胞肺癌組織和細胞中表達上調并能夠調節(jié)miR-1182/KLF8信號軸和激活Wnt/β-catenin信號通路，促進非小細胞肺癌的增殖、遷移、侵襲和內胚層轉化。

目前研究可知,miR-185、miR-326、miR-889、miR-660-5p、miR-20a-5p、miR-141、miR-570、miR-132-3p、miR-4262、miR-10b、miR-3120-5p、miR-7、miR-1182等不同miRNAs分子靶向調控不同KLFs因子的表達，參與調控腫瘤細胞增殖過程，其參與調控的分子信號通路包括JAK2/STAT3、PI3K/AKT、Wnt/β-catenin信號傳導途徑。此外，同一KLF分子在同一腫瘤類型中也可能受到不同miRNAs基因的調節(jié)，對細胞增殖結局的影響也不一樣。目前為止，本研究對miRNA/KLF軸影響腫瘤細胞增殖的分子機制有了一定的了解，但仍處于初級階段，miRNAs對p53、NF-κB等信號通路的作用機制目前報道鮮少，其他miRNAs、KLFs成員如何調控細胞周期無從得知。因此闡釋miRNA在肺癌細胞增殖中的作用機制仍是未來的研究重點，進行體內實驗探索不同miRNA表達水平在腫瘤增殖中的影響機制，其與肺癌生存及預后的關系似乎更具有臨床價值。

3.2 miRNAs在肺癌細胞凋亡中的作用

3.2.1 miRNAs發(fā)揮抑癌基因的作用 促進癌細胞存活的另一種機制是規(guī)避程序性細胞死亡或凋亡，凋亡失控與腫瘤的形成密切相關。體外實驗研究報道，多種miRNAs參與調控凋亡相關多種基因的表達，抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。體內外實驗均證實A549肺腺癌細胞轉染hsa-miR-145-5p基因后，可通過下調KLF4、八聚體結合轉錄因子4(Octamer-binding transcription factor 4，Oct4)誘導細胞周期阻滯于S/G2期，導致腫瘤生長受抑，遷移、侵襲能力降低并誘導細胞凋亡[35]。Zhuan等[36]報道，通過對41例肺癌組織樣本檢測發(fā)現(xiàn)長非編碼RNA(Long noncoding RNA,lncRNA) TRHDE-AS1在肺癌組織中的表達下調，miR-103在組織中表達顯著上調，并且 TRHDE-AS1過表達使A549和H1299細胞克隆形成能力降低，侵襲能力下降，細胞凋亡率增加，進一步分析證實miR-103是TRHDE-AS1的靶基因，而KLF4是miR-103的靶基因，且與其呈負相關。結果表明TRHDE-AS1/miR-103/KLF4軸調控肺癌發(fā)生，miR-103受到lncRNA TRHDE-AS1的調節(jié)，通過直接靶向KLF4抑制肺癌細胞的增殖、侵襲，加速細胞死亡。Liu等[37]研究發(fā)現(xiàn)下調的miR-376b-3p靶向調控KLF15的表達，誘導細胞周期阻滯于G1/G0期，發(fā)揮抑制非小細胞肺癌的增殖和促進凋亡作用。最新研究發(fā)現(xiàn)[38]KLF6在肺癌組織中顯著下調，分析顯示高表達KLF6與肺癌患者的生存率呈正相關，與臨床分期無相關性，miR-933通過調控KLF6基因的表達，抑制肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力，同時誘導細胞凋亡，影響肺癌的發(fā)生、發(fā)展。

3.2.2 miRNAs發(fā)揮癌基因的作用 Yu等[39]研究證實，lncRNA NEAT1能下調miR-1224的表達并與靶基因KLF3結合，發(fā)揮促進肺癌細胞增殖、侵襲的作用并抑制細胞凋亡。Li等[40]報道在肺癌miR-103表達上調后，通過靶向KLF7促進腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲和EMT，并抑制細胞凋亡，研究還發(fā)現(xiàn)miR-103可通過調節(jié)Wnt/β-catenin信號通路促進非小細胞肺癌內皮細胞轉化。

miRNA/KLF軸可通過調控Wnt/β-catenin等信號途徑參與調節(jié)腫瘤細胞凋亡作用。此外，miRNA是否與Bc1-2、p53、NF-κB等信號通路共同介導細胞凋亡情況，值得思考。

3.3 miRNAs在肺癌細胞遷移和侵襲中的作用 轉移是指癌細胞從腫瘤塊中擴散、通過上皮向間充質轉化獲得更多間充質表型，癌細胞從腫塊向外遷移，侵襲到正常的間質從而產生新腫瘤的過程，腫瘤細胞的遷移和侵襲在腫瘤發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色。大量體外實驗發(fā)現(xiàn)，miRNAs通過調控靶基因的表達，進而調節(jié)腫瘤細胞的遷移和侵襲。

3.3.1 miRNAs發(fā)揮抑癌基因的作用 Jing等[41]報道m(xù)iR-24-3p通過靶向抑制KLF8的表達，在肺腺癌細胞的遷移和EMT中發(fā)揮抑癌作用，上調KLF8的表達可逆轉其抑癌作用。在肺腺癌中，miR-1236-3p通過負向調控KLF8的表達，抑制肺癌細胞株A549細胞的遷移和侵襲[42]。Shi等[43]指出miR-135a在非小細胞肺癌組織和細胞中的表達水平顯著降低，且低表達miR-135a與淋巴結轉移相關。miR-135a通過靶向EMT調節(jié)因子KLF8來抑制非小細胞肺癌細胞的遷移和侵襲。劉克強等[44]研究發(fā)現(xiàn)骨髓間充質干細胞中外泌體miR-190a-5p表達顯著上調，并能夠通過提高肺癌細胞中的miR-190a-5p含量，靶向下調KLF15的表達，從而抑制肺癌細胞遷移和侵襲，為探索肺癌的治療靶點提供了新的視角。最新研究發(fā)現(xiàn)，骨髓間充質干細胞miR-204通過KLF7/AKT/HIF-1α抑制非小細胞肺癌的遷移和侵襲，此外非小細胞肺癌組織中miR-204的表達降低與TNM分期增高有關，低表達miR-204者預示生存率降低[45]。

3.3.2 miRNAs發(fā)揮癌基因的作用 肺癌差異表達的LINC00668與miR-193a直接結合靶向調節(jié)KLF7，促進非小細胞肺癌的遷移和侵襲，由此可見LINC00668/miR-193a/KLF7信號軸與非小細胞肺癌的發(fā)生發(fā)展有關，為非小細胞肺癌的治療和預后提供了潛在靶點[46]。Ding等[47]通過RT-qPCR對31例非小細胞肺癌組織標本檢測miR-25表達水平，結果表明癌組織中高表達miR-25，通過直接靶向KLF4激活ERK信號通路，促進腫瘤細胞遷移和侵襲。

3.3.3 miRNAs在肺癌血管生成中發(fā)揮癌基因的作用 腫瘤相關血管向腫瘤細胞輸送氧氣和營養(yǎng)物質，促進腫瘤細胞的存活和生長，并為腫瘤細胞的轉移提供機會，因此血管生成與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關[48]。Mao等[49]對122例小細胞肺癌患者外周血檢測發(fā)現(xiàn)，與健康對照組相比miR-141在小細胞肺癌血漿和血清中表達上調，進一步分析發(fā)現(xiàn)高表達miR-141與腫瘤大小、淋巴結轉移、遠處轉移和廣泛分期有關。體外實驗中，轉染miR-141模擬物于肺癌細胞株H446和H1048細胞中，檢測發(fā)現(xiàn)KLF12表達下調，基因數據庫及熒光素酶活性測定證實KLF12是miR-141的靶基因，miR-141通過調節(jié)KLF12的水平促進人臍靜脈內皮細胞的增殖、遷移和血管生成。同時，體內實驗也證實miR-141可增加小鼠腫瘤微血管密度并促進腫瘤生長。眾所周知，血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF) 是一種具有高度生物活性的促血管內皮細胞生長因子，通過刺激血管新生在腫瘤細胞遷移和侵襲過程中起著重要作用。miRNAs能否靶向VEGF及其分子機制如何，未來仍需要深入研究。

miRNA調節(jié)腫瘤細胞遷移和侵襲的主要作用靶基因包括KLF8、KLF15、KLF7、KLF4、KLF12等，涉及的主要作用途徑包括KLF7/AKT/HIF-1α、ERK信號通路等，這些靶點在腫瘤中通過調節(jié)不同的信號通路，作用于腫瘤的靶向轉移過程。因此，考慮到轉移對腫瘤患者預后的破壞性影響，開發(fā)針對EMT的基于miRNA/KLF軸的靶向治療方法可能是有益的。

4 miRNAs在腫瘤細胞耐藥中的作用

腫瘤化療耐藥是當前化學治療的主要難題之一，也是影響預后的主要原因。近期研究證實miR-103/KLF4在腫瘤耐藥過程中發(fā)揮重要調控作用。劉勝崗等[50]報道m(xù)iR-103在肺癌順鉑耐藥細胞株中高表達，負向調控KLF4產生耐藥。但目前關于miRNA/KLF與腫瘤化療耐藥機制的案例鮮有報道，未來仍需要深入研究。

5 小結與展望

miRNA與腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲、凋亡和血管生成等生物學行為息息相關，且不同的miRNA表達不一，通過調節(jié)不同KLF家族成員發(fā)揮癌基因或抑癌基因的作用，或許能夠成為當今治療肺癌的一個潛在新靶點。本課題組研究了PI3K/AKT/Bad信號通路在非小細胞肺癌中的作用，探討了其介導凋亡途徑的分子機制，取得了一定的成果[51-53]。miRNA/KLF軸在肺癌JAK2/STAT3、PI3K/AKT、Wnt/β-catenin、ERK等信號通路中具有關鍵作用，但目前其參與肺癌靶向治療和化療耐藥機制的相關研究仍然較少。因此，探討miRNAs對KLFs的調節(jié)有助于深入探討其發(fā)病機制，發(fā)現(xiàn)新的肺癌診斷標志物和潛在治療靶點，靶向miRNAs或KLFs是未來研究肺癌治療和預防的新方向。