黑花生中黃酮和多糖類物質(zhì)的提取方法研究

江 丹，余 策，陳 陽，陳志元，孫代華，張繼斌，丁 苗

（勁牌持正堂藥業(yè)有限公司，湖北省中藥配方顆粒工程技術(shù)研究中心，中藥保健食品質(zhì)量與安全湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 黃石 435100）

花生是我國主要的油料作物，營養(yǎng)價(jià)值比糧食高，含有大量蛋白質(zhì)和脂肪，有“長生果”之稱，作為重要?jiǎng)?chuàng)匯農(nóng)產(chǎn)品和具有很強(qiáng)國際競爭力的大型農(nóng)產(chǎn)品[1]，近年來，在國內(nèi)市場和世界貿(mào)易中的地位及影響力一直處于上升狀態(tài)[2]。我國花生產(chǎn)量及出口量從2000年以來一直穩(wěn)居前列[3]?；ㄉ谵r(nóng)產(chǎn)品經(jīng)濟(jì)和貿(mào)易中的地位十分重要[4-6]。黑花生也稱富硒黑花生，作為具有推廣前景的優(yōu)良品種，具備高蛋白、高精氨酸、高硒、高鉀含量的優(yōu)良特性[7]。黑花生富含黃酮、二氫黃酮、多糖等多種有效成分，具有抗氧化、抗腫瘤、抗菌、抗炎、降血壓、降血脂、降血糖等多種功能[8-9]。國內(nèi)外對(duì)黑花生的黃酮和多糖類的提取方法研究較少，試驗(yàn)以總黃酮和總多糖為目標(biāo)，研究黑花生的提取方法，為進(jìn)一步開發(fā)和利用黑花生資源提供理論基礎(chǔ)和試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑花生，購自湖北大冶靈鄉(xiāng)；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、D-無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，中國食品藥品檢定研究院提供；95%乙醇（食品級(jí)）；超純水，公司超純水系統(tǒng)提供；甲醇、乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、濃硫酸、重蒸苯酚，均為分析純。

AB135-S型電子天平，梅特勒-托利多公司產(chǎn)品；FA2004型電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；TU-1901型紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用有限公司產(chǎn)品；SFG-02.500型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司產(chǎn)品；DZKW-D-1型電熱恒溫水浴鍋，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司產(chǎn)品；SK8200LHC型超聲提取器，上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 黑花生總黃酮和總多糖的提取

稱取20 g黑花生，加入料液比為1∶10（g∶mL）的60%乙醇，于90℃下加熱回流提取2次，2 h/次，提取結(jié)束后，用濾紙過濾，收集并合并2次提取液，測量體積，分別測定總黃酮和總多糖的含量，計(jì)算黑花生總黃酮和總多糖提取量。

1.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選擇影響黑花生提取工藝的5個(gè)主要因素即提取溶劑、料液比、提取溫度、提取時(shí)間和提取次數(shù)進(jìn)行單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，各因素設(shè)計(jì)3個(gè)水平以上不等。

試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

1.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，分別選取提取溶劑、料液比、提取溫度和提取時(shí)間，進(jìn)一步研究4個(gè)因素對(duì)提取量的影響，優(yōu)化提取工藝，每個(gè)因素選取4個(gè)水平，采用L16（44）進(jìn)行正交試驗(yàn)。

1.5 總黃酮和總多糖含量測定

總黃酮含量的測定參照Gogna的比色法[10]，總多糖含量的測定參考苯酚-硫酸比色法[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 總黃酮和總多糖單因素試驗(yàn)

2.1.1 提取溶劑對(duì)總黃酮和總多糖提取量的影響

提取溶劑對(duì)黑花生總黃酮和總多糖提取量的影響見圖1。

由圖1可知，總黃酮和總多糖的提取量均隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大而呈現(xiàn)出先后減少的趨勢，總黃酮的提取率在40%乙醇中提取量達(dá)到最大值7.75 mg/g，而總多糖的提取率在20%乙醇中提取量達(dá)到最大值71.13 mg/g。故選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)20%，30%，40%進(jìn)行正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)。

圖1 提取溶劑對(duì)黑花生總黃酮和總多糖提取量的影響

2.1.2 料液比對(duì)黑花生總黃酮和總多糖提取量的影響

料液比對(duì)黑花生總黃酮和總多糖提取量的影響見圖2。

圖2 料液比對(duì)黑花生總黃酮和總多糖提取量的影響

由圖2可知，隨著料液比增加，黑花生總黃酮和總多糖提取量呈上升趨勢，但不是無限增加，當(dāng)料液比大于1∶20時(shí)，總黃酮和總多糖提取量的增長趨勢變緩，這可能是因?yàn)榱弦罕冗^低，不利于總黃酮和總多糖的提取，過高將會(huì)達(dá)到飽和，考慮總黃酮和總多糖提取后續(xù)工序中需要進(jìn)行濃縮，為減少生產(chǎn)成本故選擇料液比為1∶10，1∶15，1∶20（g∶mL）進(jìn)行正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)。

2.1.3 提取溫度對(duì)黑花生總黃酮和總多糖提取量的影響

提取溫度對(duì)黑花生總黃酮和總多糖提取量的影響見圖3。

圖3 提取溫度對(duì)黑花生總黃酮和總多糖提取量的影響

由圖3可知，隨著提取溫度的逐漸升高，黑花生總黃酮和總多糖的提取量呈現(xiàn)先增后減的趨勢，總黃酮在提取溫度為70℃的時(shí)候，提取量達(dá)到最大值7.41 mg/g；與總黃酮不同，總多糖的提取量在80℃時(shí)達(dá)到最大值40.80 mg/g，綜合考慮選擇提取溫度為70，80，90℃進(jìn)行正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)。

2.1.4 提取時(shí)間對(duì)黑花生總黃酮和總多糖提取量的影響

提取時(shí)間對(duì)黑花生總黃酮和總多糖提取量的影響見圖4。

由圖4可知，提取量在1.5 h時(shí)達(dá)到最大值，延長浸提時(shí)間，提取量緩慢下降，3.0 h時(shí)總多糖提取量增加，可能浸提更充分?？紤]生產(chǎn)成本和提取效率，選擇1.0，1.5，2.0 h進(jìn)行正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)。

圖4 提取時(shí)間對(duì)黑花生總黃酮和總多糖提取量的影響

2.1.5 提取次數(shù)對(duì)黑花生總黃酮和總多糖提取量的影響

提取次數(shù)對(duì)黑花生總黃酮和總多糖提取量的影響見圖5。

由圖5可知，提取1次即可將大部分黃酮提取出來，總多糖需要提取2次才可基本提取完全，綜合考慮選擇提取2次。

圖5 提取次數(shù)對(duì)黑花生總黃酮和總多糖提取量的影響

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 正交試驗(yàn)?zāi)Ｐ团c顯著性檢驗(yàn)

正交試驗(yàn)總黃酮和總多糖含量分析見表2。

由表2可知，影響提取總黃酮含量的因素依次為提取溫度＞提取次數(shù)＞料液比＞提取溶劑＞提取時(shí)間；影響總多糖因素依次為料液比＞提取溶劑＞提取次數(shù)＞提取溫度＞提取時(shí)間。提取黑花生總黃酮最佳條件為料液比1∶20（g∶mL），50%乙醇90℃下提取2次，1.0 h/次；提取黑花生總多糖最佳條件為料液比1∶15（g∶mL），20%乙醇80℃下提取2次，2.0 h/次。

2.2.2 設(shè)計(jì)驗(yàn)證

為了檢驗(yàn)正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)的可行性，在黑花生總黃酮和總多糖最佳提取條件下進(jìn)行驗(yàn)證，制備的黑花生提取物中總黃酮含量為88.3 mg/g，總多糖含量為667.2 mg/g。在此條件下檢測預(yù)測結(jié)果的可靠性，重復(fù)3次提取黑花生總黃酮和總多糖，制備的黑花生提取物2種有效成分含量分別為87.8±0.3 mg/g和667.7%±0.5 mg/g，與預(yù)測值很接近，說明該模型反映出的提取條件可靠，此優(yōu)化方法可行。

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)黑花生總黃酮和總多糖提取參數(shù)，確定最佳提取條件，總黃酮料液比1∶20（g∶mL），50%乙醇90℃下提取2次，1.0 h/次；總多糖料液比1∶15（g∶mL），20%乙醇80℃下提取2次，2.0 h/次。根據(jù)效應(yīng)曲線圖結(jié)果及驗(yàn)證結(jié)果表明，按照最佳條件制備的黑花生提取物中總黃酮含量為88.3 mg/g，總多糖含量為667.2 mg/g，為進(jìn)一步研究黑花生總黃酮和總多糖提供參考依據(jù)。