不同方法提取酸棗仁皂苷A的比較研究

陳美玲，廖鈺婷，吳鈺婷， 李 琳

（電子科技大學(xué)中山學(xué)院材料與食品學(xué)院，廣東 中山 528400）

中醫(yī)典籍《神農(nóng)本草經(jīng)》中曾記載，酸棗仁可以“安五臟，輕身延年”[1]。酸棗仁是一種具有養(yǎng)心安神功效的中藥[2-3]，為藥食同源產(chǎn)品，通常用于治療失眠[4]。現(xiàn)代研究表明，酸棗仁具有寧心安神、抗炎、抗氧化、抗抑郁、增強(qiáng)免疫功能、提高學(xué)習(xí)和記憶能力等藥理作用[5]，酸棗仁含有多種活性物質(zhì)，如酸棗仁油、黃酮類、皂苷類、生物堿類、維生素類、氨基酸類、多糖類化合物及微量元素等，其中酸棗仁油、酸棗仁皂苷和酸棗仁黃酮被公認(rèn)為具有鎮(zhèn)靜催眠作用，酸棗仁總皂苷的鎮(zhèn)靜催眠作用明顯強(qiáng)于總黃酮[6]。

作為酸棗仁的主要活性物質(zhì)，酸棗仁皂苷A的提取工藝是目前生物研究熱點(diǎn)。在查閱收集大量文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，綜述近年來酸棗仁皂苷的提取、分離純化等工藝研究進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)對(duì)酸棗仁皂苷A提取的傳統(tǒng)工藝大多數(shù)采用回流提取等，檢測(cè)方法大多采用高效液相色譜法-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器[7-9]，使用高效液相色譜法-紫外檢測(cè)器的研究相對(duì)較少。通過比較加熱回流和超聲輔助2種提取工藝對(duì)酸棗仁皂苷A提取率的影響，并利用高效液相色譜法-紫外檢測(cè)器對(duì)酸棗仁皂苷A的含量進(jìn)行檢測(cè)，確定最適的提取方法和工藝參數(shù)，為酸棗仁的進(jìn)一步開發(fā)和應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試驗(yàn)材料

酸棗仁皂苷A標(biāo)準(zhǔn)品，純度99.6%，中國(guó)藥品生物制品檢定所提供；甲醇（色譜純）、石油醚（分析純）、乙腈（色譜純）、95%乙醇（分析純），天津市百世化工有限公司提供；蒸餾水，5L，屈臣氏提供；濾膜，0.22μm，津騰公司提供；注射器，2.5 mL，余姚市通濟(jì)醫(yī)療器械有限公司提供；酸棗仁中藥，食品級(jí)，廣東省中山市中智大藥房提供。

1.1.2 試驗(yàn)儀器

Waters Alliance型高效液相色譜，沃特世科技（上海）有限公司產(chǎn)品；JY92－IID型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波新芝生物公司產(chǎn)品；CP114型電子分析天平，上海奧豪斯公司產(chǎn)品；CCA－1112A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，日本東京理化公司產(chǎn)品；500 mL型索氏提取器，崇州市蜀玻科學(xué)儀器有限責(zé)任公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 酸棗仁皂苷A的提取工藝流程

酸棗仁皂苷的提取工藝流程見圖1。

圖1 酸棗仁皂苷的提取工藝流程

1.2.2 酸棗仁皂苷A回流提取的單因素試驗(yàn)

將10.00 g脫脂酸棗仁粉末置于圓底燒瓶中，按圖1的提取工藝流程，分別研究不同乙醇溶液（30%，50%，70%，90%）、料液比（1∶6，1∶9，1∶12，1∶15，1∶18）、回流提取時(shí)間（1.0，1.5，2.0，2.5 h）并將總4次提取數(shù)作為參考指標(biāo)，以此來判斷提取液能否會(huì)對(duì)皂苷A的含量有所改變。

1.2.3 物理輔助法對(duì)酸棗仁皂苷A的影響

根據(jù)1.2.2酸棗仁皂苷A單因素試驗(yàn)結(jié)果確認(rèn)最適的乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比，在此基礎(chǔ)上考查不同超聲提取的時(shí)間（20，40，60，80 min）、不同超聲功率（250，500，750，1 000 W）對(duì)酸棗仁皂苷A的提取影響。

1.2.4 回流法和物理輔助法最佳工藝條件的確定

依據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，確立了參考標(biāo)準(zhǔn)，以此來對(duì)回流浸提法進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)（見表1），是以酸棗仁皂苷A含量為指標(biāo)，乙醇為體積分?jǐn)?shù)（X1），并結(jié)合料液比（X2）來確立的。而使用超聲輔助提取法的試驗(yàn)設(shè)計(jì)（見表4），則按照超聲時(shí)間（X3）和超聲功率（X4）作為考量來確立。將對(duì)2種提取法進(jìn)行3次對(duì)比試驗(yàn)，分別計(jì)算不同工藝方法下皂苷A的含量變化，由此來確立最佳提取法。

酸棗仁皂苷A回流提取工藝的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平設(shè)計(jì)見表1，酸棗仁皂苷A超聲提取工藝的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平設(shè)計(jì)見表2。

表1 酸棗仁皂苷A回流提取工藝的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平設(shè)計(jì)

表2 酸棗仁皂苷A超聲提取工藝的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平設(shè)計(jì)

1.2.5 檢測(cè)方法

（1）對(duì)照品溶液的制備。對(duì)照品的溶液需要稱取19.20 mg的酸棗仁皂苷A標(biāo)準(zhǔn)品倒入100 mL的容器當(dāng)中，并加入乙腈和水，兩者的比例按3∶7（V∶V）來進(jìn)行溶解，最后使之搖晃均勻，即可得到對(duì)照品溶液。

（2）供試品溶液的制備。準(zhǔn)確稱取酸棗仁粉末（60目篩）10 g，置索氏提取器中，在80℃條件下用乙醚脫脂4 h，棄去乙醚液，待藥渣揮發(fā)盡醚液，按料液比1∶15（g∶mL），藥渣加梯度乙醇（體積分?jǐn)?shù)為30%，50%，70%，90%）回流提取，置于分液漏斗中過濾取濾液，將濾液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮至膏狀，回收膏狀物即得酸棗仁皂苷提取物，提取物加甲醇溶解，定容至10 mL后，過0.22μm濾膜，取得過濾液，將以此來作為供試樣品的溶液。

（3）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備。準(zhǔn)確移取2.0，4.0，6.0，8.0 mL已配置的酸棗仁皂苷A對(duì)照品溶液分別置于10 mL容量瓶中，分別加入乙腈∶水=3∶7（V∶V）溶解并定容，搖勻，配制出一系列酸棗仁皂苷A標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度梯度，分別為38.4，76.8，115.2，153.6μg/mL，按表3所示的色譜條件進(jìn)樣，以進(jìn)樣量（X/μg）為橫坐標(biāo)，酸棗仁皂苷A的峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，計(jì)算酸棗仁皂苷A含量的回歸方程為：

（4）HPLC-UV色譜條件。色譜柱：采用Waters（150 nm×4.6 nm）；柱溫35℃；混合流動(dòng)相：流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為水；流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量20μL，波長(zhǎng)203 nm，梯度洗脫（見表3）。在此色譜條件下，分別精密吸取對(duì)照品20μL進(jìn)樣測(cè)定。

流動(dòng)相梯度洗脫方法時(shí)間見表3，HPLC色譜圖（酸棗仁皂苷A）見圖2。

表3 流動(dòng)相梯度洗脫方法時(shí)間

圖2 HPLC色譜圖（1酸棗仁皂苷A）

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)所得的最佳數(shù)據(jù)均為3個(gè)平行樣的均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同因素對(duì)酸棗仁皂苷A提取的影響

2.1.1 不同體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液對(duì)酸棗仁皂苷A含量的影響

皂苷類化合物在乙醇水溶液中有較大溶解度,且乙醇具有安全無毒、價(jià)廉等優(yōu)點(diǎn),是提取皂苷類化合物的常用溶劑[10]。

不同體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液對(duì)酸棗仁皂苷A含量的影響（n=3）見圖3。

由圖3可知，以體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇為提取溶劑時(shí)，棗苷A的提取率最高，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，通過按照料液比為1∶15（g∶mL），進(jìn)行為期1 h的一次回流提取法，加入體積分?jǐn)?shù)為30%，50%，70%，90%的情況下進(jìn)行提取，在70%的乙醇下，皂苷A的含量會(huì)降低。這可能與酸棗仁中各種物質(zhì)的溶解度有關(guān)。過高的乙醇體積分?jǐn)?shù)可能不利于其他皂甙的溶出，表現(xiàn)為皂甙提取率降低[11]。因此，將體積分?jǐn)?shù)設(shè)定為50%~80%。

圖3 不同體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液對(duì)酸棗仁皂苷A含量的影響（n=3）

2.1.2 料液比對(duì)酸棗仁皂苷A含量的影響

料液比對(duì)酸棗仁皂苷A含量的影響（n=3）見圖4。

圖4 料液比對(duì)酸棗仁皂苷A含量的影響（n=3）

由圖4可知，酸棗仁皂苷A含量隨著乙醇用量的增加而增加。進(jìn)行1 h，1次的回流提取，按照70%的乙醇體積分?jǐn)?shù)進(jìn)行添加，并將料液比設(shè)為1∶6，1∶9，1∶12，1∶15，1∶18，而當(dāng)料液比達(dá)到1∶12時(shí)，皂苷A的提取率最大，提取試劑的增加可以增加質(zhì)量轉(zhuǎn)移能力，并且可以促進(jìn)從皂苷A相提取試劑的皂角的移動(dòng)。因此，將料液比設(shè)定為1∶10~1∶15。

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)酸棗仁皂苷A含量的影響

按添加乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，料液比1∶15，回流次數(shù)1次，設(shè)置提取時(shí)間梯度（1.0，1.5，2.0，2.5 h）。

提取時(shí)間對(duì)酸棗仁皂苷A含量的影響（n=3）見圖5。

由圖5可知，提取時(shí)間為1 h時(shí)，酸棗仁皂苷A含量最高，之后隨時(shí)間延長(zhǎng)而略呈下降趨勢(shì)，可能是由于皂苷A隨提取時(shí)間延長(zhǎng)而受熱分解，可能使三萜類化合物的結(jié)構(gòu)變化[12]，導(dǎo)致含量減少。由此可見，試驗(yàn)的提取時(shí)間共計(jì)需要1 h。

圖5 提取時(shí)間對(duì)酸棗仁皂苷A含量的影響（n=3）

2.1.4 提取次數(shù)對(duì)酸棗仁皂苷A含量的影響

按70%乙醇，提取時(shí)間1 h，料液比1∶15，提取次數(shù)（1，2，3，4次）。

提取次數(shù)對(duì)酸棗仁皂苷A含量的影響（n=3）見圖6。

圖6 提取次數(shù)對(duì)酸棗仁皂苷A含量的影響（n=3）

由圖6可知，酸棗仁中棗皂甙A含量以回流2次最高，回流3次略有下降，這可能是由于長(zhǎng)期加熱造成的結(jié)構(gòu)損壞。由此可見，要對(duì)皂苷A的提取共計(jì)進(jìn)行2次中心組合試驗(yàn)。

2.2 超聲輔助對(duì)酸棗仁皂苷A試驗(yàn)結(jié)果

綜合上述的酸棗仁皂苷A的提取率可以得出，超聲輔助提取酸棗仁皂苷A的提取率高于回流提取法，凡蕓、田洋等人[12-13]得出結(jié)論，在酸棗仁皂苷的提取工藝當(dāng)中，超聲輔助提取是要明顯強(qiáng)于回流提取法。

2.2.1 超聲時(shí)間對(duì)酸棗仁皂苷A含量的影響

按添加乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，回流次數(shù)1次，提取功率750 W，設(shè)置提取時(shí)間（20，40，60，80 min）。

超聲時(shí)間對(duì)酸棗仁皂苷A含量的影響（n=3）見圖7。

圖7 超聲時(shí)間對(duì)酸棗仁皂苷A含量的影響（n=3）

判斷試驗(yàn)時(shí)間是否會(huì)對(duì)皂苷A的提取量有影響時(shí)，可以得出在40 min時(shí)提取率為最高值，但接下來，盡管提取時(shí)間的延長(zhǎng)，皂苷A的提取量卻并不會(huì)隨著時(shí)間增長(zhǎng)而升高，由此可見，當(dāng)時(shí)間來到40 min時(shí)，提取量已經(jīng)完全飽和，隨后溢出的時(shí)間都屬于無效時(shí)間，所以30~60 min為超聲提取最佳時(shí)間。

2.2.2 超聲功率對(duì)酸棗仁皂苷A含量的影響

按添加乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，回流次數(shù)1次，提取時(shí)間40 min，設(shè)置超聲功率（250，500，750，1 000 W）。

超聲功率對(duì)酸棗仁皂苷A含量的影響（n=3）見圖8。

圖8 超聲功率對(duì)酸棗仁皂苷A含量的影響（n=3）

由圖8可知，超聲功率越高，皂苷A含量越大，超聲功率為750 W時(shí)皂苷A含量最高，超聲功率繼續(xù)增加，皂苷A的含量反而會(huì)降低，表明750 W時(shí)皂苷的溶出已基本完全，隨著功率的增加皂苷可能出現(xiàn)降解，故將中心組合試驗(yàn)將超聲功率設(shè)定在500~1 000 W。

2.3 酸棗仁皂苷A提取的中心組合設(shè)計(jì)結(jié)果

2.3.1 回流提取法的優(yōu)化

試驗(yàn)采用響應(yīng)面法-中心復(fù)合法優(yōu)化酸棗仁皂苷A提取工藝，使用方法的優(yōu)點(diǎn)在于能對(duì)試驗(yàn)中的每個(gè)影響因素進(jìn)行連續(xù)分析，使結(jié)果更為直觀[14]。響應(yīng)面圖可以反映兩因素之間的交互效應(yīng)，坡度反映各因素變化對(duì)響應(yīng)值的影響，而等高線的形狀及疏密程度則反映了兩因素交互效應(yīng)的強(qiáng)弱[15]。

在單因素試驗(yàn)中確定最佳的回流時(shí)間和回流次數(shù)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面分析乙醇濃度、料液比2個(gè)因素對(duì)酸棗仁皂苷A的影響。

酸棗仁皂苷提取的中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4 酸棗仁皂苷提取的中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)回流浸提的情況，進(jìn)行了響應(yīng)面分析，再經(jīng)過二次回歸擬合后，最終得到了酸棗仁皂苷A含量（Y1）與乙醇體積分?jǐn)?shù)（X1）、料液比（X2）的回歸方程為：

響應(yīng)曲面回歸方程模型的方差分析見表5。

表5 響應(yīng)曲面回歸方程模型的方差分析

依據(jù)表5進(jìn)行方差分析，模型為p=0.024 1，表明該模型方程顯著。模型失擬項(xiàng)p值為0.758 1＞0.05，這說明，該模型的失擬項(xiàng)較為平庸，而后將該模型與試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，兩者的擬合度十分契合，試驗(yàn)變量較小，且模型擬合度R2=0.910 3，大于90%，表明回歸方程對(duì)酸棗仁皂苷A含量的預(yù)測(cè)值與實(shí)際值有比較好的相關(guān)性，可用該模型分析酸棗仁中酸棗仁皂苷A提取工藝。

依據(jù)酸棗仁皂苷A回流提取進(jìn)行構(gòu)建的二次回歸模型，在通過Design Expert10軟件進(jìn)行繪制，得出其三維響應(yīng)面圖及等值線圖。將影響因素作為中心值，以此來判斷乙醇濃度和料液比是否會(huì)對(duì)皂苷A中的乙醇含量造成變化。

回流提取酸棗仁皂苷A含量影響的響應(yīng)面圖和等高線圖見圖9。

由圖9可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比能夠?qū)υ碥誂含量造成變化，在皂苷含量到達(dá)頂峰時(shí)，乙醇體積分?jǐn)?shù)（X1）的增加會(huì)降低皂苷A的含量，這意味著乙醇能夠遏制皂苷A，通過分析響應(yīng)面圖，便能夠得出其提取時(shí)的黃金時(shí)期，即在70%的乙醇體積分?jǐn)?shù)，料液比在12∶1時(shí)，通過回流進(jìn)行1 h的提取，共計(jì)2次。

2.3.2 超聲輔助提取法的優(yōu)化

通過單因素試驗(yàn)，確定最佳回流時(shí)間及回流次數(shù)，通過其情況利用響應(yīng)面分析是否會(huì)對(duì)皂苷A產(chǎn)生變化，并根據(jù)超聲時(shí)間、超聲功率2個(gè)因素來決定。

超聲輔助提取的中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果見表6。

表6 超聲輔助提取的中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果

超聲輔助提取酸棗仁皂苷A含量（Y2）與超聲時(shí)間（X3）、超聲功率（X4）的回歸方程為：

響應(yīng)曲面回歸方程模型的方差分析見表7。

表7 響應(yīng)曲面回歸方程模型的方差分析

根據(jù)表7進(jìn)行的方差分析得出結(jié)論，關(guān)于模型p=0.001 7的方程能夠直觀看到，其擬合度達(dá)到R2=0.926 4，大于90%，表明回歸方程對(duì)酸棗仁皂苷A質(zhì)量濃度的預(yù)測(cè)值與實(shí)際值有比較好的相關(guān)性，由此說明回歸模型與試驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合程度較高，試驗(yàn)誤差較小，可用該模型分析酸棗仁中酸棗仁皂苷A提取工藝。

根據(jù)超聲輔助提取法，構(gòu)建酸棗仁皂苷A的二次回歸模型，通過Design Expert 10軟件對(duì)響應(yīng)面的三維空間及等高線圖進(jìn)行繪制，將其一影響因素作為中心值（編碼水平為0），依此便可看到超聲時(shí)間和超聲頻率，能否會(huì)使皂苷A的含量發(fā)生變化。

超聲輔助酸棗仁皂苷A含量影響的響應(yīng)面圖和等高線圖見圖10。

圖10 超聲輔助酸棗仁皂苷A含量影響的響應(yīng)面圖和等高線圖

由圖10可知，超聲時(shí)間（X3）、超聲功率（X4）2個(gè)因素對(duì)酸棗仁皂苷A含量具有一定的影響。當(dāng)皂苷含量值處于頂峰飽和狀態(tài)下，增加對(duì)其超聲作業(yè)的時(shí)限并不會(huì)對(duì)該含量起到促進(jìn)作用，反而會(huì)使其含量降低，超聲頻率也會(huì)使其含量有所下降，從響應(yīng)面圖來看，便能得到皂苷A的最優(yōu)提取法所需要的環(huán)境條件，便是在體積分?jǐn)?shù)達(dá)到70 %的乙醇，料液比為12∶1時(shí)，需要進(jìn)行750 W的超聲功率，超聲時(shí)間為40 min。

2.3.3 穩(wěn)定性測(cè)試

（1）回流提取穩(wěn)定性測(cè)試。以上試驗(yàn)數(shù)據(jù)已經(jīng)充分確立了回流提取法的標(biāo)準(zhǔn)步驟，故而開始進(jìn)行共計(jì)3次的平行試驗(yàn)，采用回流提取共2次。

回流提取穩(wěn)定性測(cè)試見表8。

表8 回流提取穩(wěn)定性測(cè)試

對(duì)測(cè)定后的最佳條件進(jìn)行了驗(yàn)證和分析，通過3次測(cè)定的平均值，得到酸棗仁皂苷A含量分別為1.268，1.279，1.295 mg/g，平均含量是1.281±0.014 mg/g與預(yù)測(cè)值（1.30 mg/g）接近，該模型充分符合預(yù)期，具有可靠性。

（2）超聲輔助提取穩(wěn)定性測(cè)試。根據(jù)回流提取試驗(yàn)中取得的數(shù)據(jù)和條件能夠?qū)Τ曒o助提取的條件進(jìn)行設(shè)定，將乙醇的體積分?jǐn)?shù)和料液比進(jìn)行參考，確定了需要的份額，并在此基礎(chǔ)上設(shè)定超聲功率為750 W，超聲時(shí)間為40 min共計(jì)3次的超聲輔助提取的平行試驗(yàn)。

超聲輔助提取穩(wěn)定性測(cè)試見表9。

表9 超聲輔助提取穩(wěn)定性測(cè)試

對(duì)測(cè)定后的最佳條件進(jìn)行了驗(yàn)證和分析，通過3次測(cè)定的平均值，得到酸棗仁皂苷A含量分別為1.501，1.496，1.485 mg/g，平均含量是1.494+0.008 mg/g與預(yù)測(cè)值（1.50 mg/g）接近，該模型充分符合預(yù)期，具有可靠性。

2.4 酸棗仁皂苷最佳提取工藝的對(duì)比

依照兩類提取法的試驗(yàn)數(shù)據(jù)，可以得出回流提取法對(duì)皂苷A含量最高為1.281 mg/g，而超聲提取法則為1.494 mg/g。由此得出，超聲提取法的提取量高于回流提取法，相差14.25%，可見超聲提取法是提取皂苷A的最優(yōu)提取工藝。

3 結(jié)論

酸棗仁皂苷A是酸棗仁中重要活性成分，屬于三萜皂苷類，具有鎮(zhèn)靜安眠、抗心肌缺血、增強(qiáng)免疫等藥理作用[16]。對(duì)于從酸棗仁中提取皂苷大多是以回流提取法為主，但其因?yàn)樾实拖潞腿缃竦募夹g(shù)進(jìn)步，現(xiàn)在多以使用超聲輔助提取法為主。通過結(jié)合響應(yīng)面制圖和數(shù)據(jù)分析，超聲輔助提取法優(yōu)于單純的回流提取法，酸棗仁皂苷的最佳提取條件為提取溶劑70%的乙醇溶液，料液比1∶12，超聲時(shí)間40 min，超聲功率750 W。通過對(duì)2種提取方法進(jìn)行對(duì)比可知，超聲輔助提取效率顯然要高于回流提取，故而應(yīng)該選擇更佳的超聲輔助提取，能夠極大地節(jié)約成本。