葡萄籽原花青素調(diào)控NLRP3/Caspase-1通路介導(dǎo)的焦亡途徑對糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠的保護(hù)作用△

王彤彤 莊天微 謝 偉 帥 印 樸天華 帥天姣

糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)是糖尿病人群嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥，會引起視網(wǎng)膜損害，造成視力下降，可降低患者的工作能力及生活質(zhì)量，發(fā)展到晚期可導(dǎo)致失明，已成為亟待解決的公共衛(wèi)生問題之一[1-2]。高血糖會觸發(fā)活性氧(ROS)的過量產(chǎn)生，誘發(fā)視網(wǎng)膜組織強烈的氧化應(yīng)激與炎癥損傷，是DR的主要發(fā)病機制，抗氧化和抗炎是緩解DR進(jìn)展的有效手段[3-4]。NLRP3是組織細(xì)胞調(diào)控炎癥反應(yīng)的重要信號分子，可促進(jìn)下游Caspase-1蛋白表達(dá)，激活焦亡途徑，誘導(dǎo)細(xì)胞炎性壞死即細(xì)胞焦亡，在DR的發(fā)生發(fā)展過程中具有關(guān)鍵調(diào)控作用，下調(diào)NLRP3/Caspase-1通路表達(dá)，可顯著抑制高糖誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜組織炎癥，增強其抗氧化應(yīng)激活性，減輕過氧化損傷，改善DR癥狀[5-7]，表明NLRP3/Caspase-1信號通路是治療DR的重要作用靶點。葡萄籽原花青素是提取自葡萄籽中的一種類黃酮物質(zhì)，是具有高效清除自由基功效的天然抗氧化劑。近年來研究表明，葡萄籽原花青素可下調(diào)NLRP3蛋白表達(dá)，抑制高糖引發(fā)的炎癥與氧化應(yīng)激反應(yīng)，改善糖尿病大鼠腎缺血-再灌注損傷，并可通過抗炎及抗氧化活性抑制缺血-再灌注引發(fā)的視網(wǎng)膜組織細(xì)胞凋亡，保護(hù)視網(wǎng)膜功能[8-9]。但葡萄籽原花青素是否可通過調(diào)控NLRP3/Caspase-1通路介導(dǎo)的焦亡途徑延緩DR病情發(fā)展，目前還未見相關(guān)報道，本研究通過建立DR大鼠模型，對此進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SD大鼠購自牡丹江醫(yī)學(xué)院[許可證號：SCXK(黑)2019-0003]，SPF級，雄性，體重210～230 g，飼養(yǎng)在牡丹江醫(yī)學(xué)院動物中心獨立動物房中[使用證號：SYXK(黑)2019-006]：室溫 21～25 ℃，濕度45%～55%，每天定時通風(fēng)換氣，保持12 h/12 h明暗循環(huán)照明，食水不限，適應(yīng)飼養(yǎng)1周后嚴(yán)格遵循動物使用的3R原則進(jìn)行實驗。

1.2 主要試劑與儀器葡萄籽原花青素(純度95%)購自南京標(biāo)科生物科技有限公司；VX-765購自美國Selleck生物科技有限公司；HE染色試劑盒、TUNEL試劑盒、ROS測定試劑盒、丙二醛(MDA)測定試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒、過氧化氫酶(CAT)測定試劑盒、白細(xì)胞介素(IL)-1β測定試劑盒、IL-18測定試劑盒、糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所有限公司；兔源GAPDH一抗、兔源NLRP3一抗均購自美國Abcam公司；兔源Caspase-1一抗購自艾美捷科技有限公司。小動物眼底鏡購自上海玉研科學(xué)儀器有限公司；One Touch II型血糖儀購自美國強生公司；Multiskan MK3酶標(biāo)儀購自美國Thermo Fisher Scientific公司；CX41光學(xué)顯微鏡購自日本Olympus公司；Tanon-4100全自動數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)購自上海天能科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 DR模型建立及分組給藥參照文獻(xiàn)[10]制備DR模型：大鼠在動物中心適應(yīng)飼養(yǎng)1周后，腹腔注射65 mg·kg-1鏈脲佐菌素(以0.1 mol·L-1枸櫞酸鈉緩沖液溶解)一次，之后3 d內(nèi)每天尾靜脈采血測量血糖，血糖濃度不斷升高，并選擇72 h后血糖濃度≥16.7 mmol·L-1且出現(xiàn)“三多一少”癥狀的大鼠進(jìn)行眼底鏡檢查，當(dāng)大鼠眼底動靜脈異常、毛細(xì)血管擴張并出現(xiàn)微血管瘤時，表示DR模型建立成功，隨機分為模型組、葡萄籽原花青素組、VX-765組、葡萄籽原花青素+VX-765組(每組各12只)，另取12只大鼠，腹腔注射等劑量0.1 mol·L-1枸櫞酸鈉，設(shè)為對照組。

以9 g·L-1氯化鈉溶液溶解購買的葡萄籽原花青素與VX-765，配制400 g·L-1葡萄籽原花青素溶液[8]、5000 g·L-1VX-765溶液[11]、葡萄籽原花青素(400 g·L-1)+VX-765(5000 g·L-1)的混合溶液，葡萄籽原花青素組大鼠腹腔注射10 mL·kg-1葡萄籽原花青素溶液及10 mL·kg-1的9 g·L-1氯化鈉溶液；VX-765組大鼠腹腔注射10 mL·kg-1VX-765溶液及10 mL·kg-1的9 g·L-1氯化鈉溶液；葡萄籽原花青素+VX-765組大鼠腹腔注射10 mL·kg-1葡萄籽原花青素溶液+VX-765混合溶液；模型組和對照組大鼠腹腔均注射20 mL·kg-1的9 g·L-1氯化鈉溶液干預(yù)，每天干預(yù)1次，持續(xù)14 d。

1.3.2 標(biāo)本采集末次藥物干預(yù)結(jié)束后24 h，將大鼠置于乙醚氣體中麻醉，使用5 mL注射器從頸動脈采血2 mL，于4 ℃、2500 r·min-1離心15 min，吸出上清保存在-80 ℃；接著頸椎脫臼法處死大鼠，每組隨機選取6只大鼠摘下雙側(cè)眼球，于眼前節(jié)開窗注入40 g·L-1多聚甲醛固定液固定；然后去除玻璃體、晶狀體和角膜，分離出視網(wǎng)膜組織，進(jìn)行脫水、石蠟包埋后，沿眼球矢狀面縱切，得到厚約4 μm的連續(xù)視網(wǎng)膜薄片；剩余6只大鼠摘下雙側(cè)眼球，分離出視網(wǎng)膜組織，保存在液氮中。

1.3.3 大鼠視網(wǎng)膜組織病理學(xué)變化及視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞焦亡情況檢測將1.3.2中的視網(wǎng)膜石蠟切片作常規(guī)脫蠟處理后，進(jìn)行水化，選出3張切片行HE染色，以蒸餾水漂洗后脫水、透明、封片，在光鏡下觀察視網(wǎng)膜組織病理學(xué)形態(tài)并任選5個視野拍照；另選出3張切片，采用TUNEL試劑盒染色，在光鏡下任選5個視野拍照觀察，通過ImageJ軟件計數(shù)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGC)焦亡數(shù)及總數(shù)量，計算RGC焦亡率=RGC焦亡數(shù)/RGC總數(shù)量×100%。

1.3.4 大鼠視網(wǎng)膜組織SOD、CAT、ROS、MDA及血清中AGEs、IL-1β與IL-18水平測定取1.3.2中的視網(wǎng)膜組織，加入高強度RIPA裂解液勻漿，部分勻漿離心(4 ℃，3000 r·min-1離心20 min)后吸出上清，使用總蛋白定量測定試劑盒通過BCA法測定總蛋白濃度，然后每組取出0.15 mL勻漿，采用試劑盒測定其中SOD、CAT、ROS、MDA水平。

取1.3.2中的血清放在4 ℃冰箱中解凍，采用酶聯(lián)免疫試劑盒測定各組血清中AGEs、IL-18、IL-1β水平。

1.3.5 大鼠視網(wǎng)膜組織NLRP3/Caspase-1通路蛋白表達(dá)水平檢測1.3.4中剩余的視網(wǎng)膜組織蛋白樣品液，根據(jù)測定結(jié)果將各組蛋白濃度調(diào)至相等，加入適量上樣緩沖液，煮沸變性、快速離心，混勻后上樣，經(jīng)電泳(120 V，70 min)、濕轉(zhuǎn)(40 mA，60 min)后，將轉(zhuǎn)移至PVDF膜上的蛋白用50 g·L-1脫脂奶粉封閉(37.5 ℃，1.5 h)；根據(jù)相對分子質(zhì)量截取目的蛋白GAPDH、NLRP3、Caspase-1條帶，以相應(yīng)的兔源一抗(GAPDH、NLRP3、Caspase-1抗體)孵育(4 ℃，9 h)，TBST溶液漂洗(3次，每次5 min)；羊抗兔二抗孵育(37.5 ℃，2 h)后TBST溶液再次漂洗(3次，每次5 min)；滴加化學(xué)發(fā)光液顯色1 min后，以凝膠成像系統(tǒng)拍攝并用ImageJ軟件分析各蛋白灰度值，采用GAPDH為內(nèi)參蛋白，計算各蛋白相對表達(dá)量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析本研究利用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。檢驗水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠的眼底鏡檢測情況與對照組相比，模型組大鼠眼底均可觀察到明顯的動靜脈異常、毛細(xì)血管擴張、微血管瘤出現(xiàn)；與模型組相比，葡萄籽原花青素組、VX-765組大鼠眼底動靜脈異常、毛細(xì)血管擴張等情況明顯好轉(zhuǎn)；葡萄籽原花青素+VX-765組大鼠眼底病變輕于葡萄籽原花青素組、VX-765組，與模型組差異較小(圖1)。

圖1 各組大鼠的眼底鏡檢查結(jié)果 A：對照組；B：模型組；C：葡萄籽原花青素組；D：VX-765組；E：葡萄籽原花青素+VX-765組。

2.2 各組大鼠視網(wǎng)膜組織病理學(xué)變化對照組大鼠視網(wǎng)膜組織各層細(xì)胞排列整齊緊密，結(jié)構(gòu)層次分明，未見病理改變；模型組大鼠視網(wǎng)膜組織明顯變薄，結(jié)構(gòu)疏松，細(xì)胞結(jié)構(gòu)層次紊亂、排列不規(guī)則，RGC變少、稀疏，呈現(xiàn)嚴(yán)重病理損傷變化；葡萄籽原花青素組及VX-765組大鼠視網(wǎng)膜組織形態(tài)結(jié)構(gòu)得到恢復(fù)，病理損傷均有不同程度減輕；與葡萄籽原花青素組及VX-765組相比，葡萄籽原花青素+ VX-765組大鼠視網(wǎng)膜組織病理損傷進(jìn)一步減輕，形態(tài)結(jié)構(gòu)幾乎恢復(fù)正常(圖2)。

圖2 HE染色檢測各組大鼠視網(wǎng)膜組織病理學(xué)變化(×200) A：對照組；B：模型組；C：葡萄籽原花青素組；D：VX-765組；E：葡萄籽原花青素+VX-765組。

2.3 各組大鼠RGC焦亡情況與對照組[(0.47±0.13)%]相比，模型組大鼠RGC焦亡率[(34.16±4.28)%]明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，葡萄籽原花青素組[(15.39±3.54)%]及VX-765組[(15.43±3.67)%]大鼠RGC焦亡率均降低(均為P<0.05)；與葡萄籽原花青素組及VX-765組相比，葡萄籽原花青素+VX-765組大鼠RGC焦亡率[(0.65±0.20)%]均降低(均為P<0.05)(圖3)。

2.4 各組大鼠視網(wǎng)膜組織抗氧化活性與對照組相比，模型組大鼠視網(wǎng)膜組織中SOD與CAT水平均明顯降低(均為P<0.05)；與模型組相比，葡萄籽原花青素組及VX-765組大鼠視網(wǎng)膜組織中SOD與CAT水平均升高(均為P<0.05)；與葡萄籽原花青素組及VX-765組相比，葡萄籽原花青素+ VX-765組大鼠視網(wǎng)膜組織中SOD與CAT水平均升高(均為P<0.05)(表1)。

表1 各組大鼠視網(wǎng)膜組織中SOD與CAT水平

2.5 各組大鼠視網(wǎng)膜組織過氧化水平與對照組相比，模型組大鼠視網(wǎng)膜組織ROS與MDA水平均明顯升高(均為P<0.05)；與模型組相比，葡萄籽原花青素組及VX-765組大鼠視網(wǎng)膜組織ROS與MDA水平均降低(均為P<0.05)；與葡萄籽原花青素組及VX-765組相比，葡萄籽原花青素+ VX-765組大鼠視網(wǎng)膜組織ROS與MDA水平均降低(均為P<0.05)(表1)。

2.6 各組大鼠血清中炎癥因子水平與對照組相比，模型組大鼠血清中炎癥因子AGEs、IL-1β與IL-18水平均明顯升高(均為P<0.05)；與模型組相比，葡萄籽原花青素組及VX-765組大鼠血清中炎癥因子AGEs、IL-1β與IL-18水平均降低(均為P<0.05)；與葡萄籽原花青素組及VX-765組相比，葡萄籽原花青素+ VX-765組大鼠血清炎癥因子AGEs、IL-1β與IL-18水平均降低(均為P<0.05)(表2)。

表2 各組大鼠血清中炎癥因子AGEs、IL-1β與IL-18水平

2.7 各組大鼠視網(wǎng)膜組織NLRP3/Caspase-1通路蛋白表達(dá)水平與對照組相比，模型組大鼠視網(wǎng)膜組織中NLRP3、Caspase-1蛋白相對表達(dá)水平均明顯升高(均為P<0.05)；與模型組相比，葡萄籽原花青素組及VX-765組大鼠視網(wǎng)膜組織中NLRP3、Caspase-1蛋白相對表達(dá)水平均降低(均為P<0.05)；與葡萄籽原花青素組及VX-765組相比，葡萄籽原花青素+VX-765組大鼠視網(wǎng)膜組織NLRP3、Caspase-1蛋白相對表達(dá)水平均降低(均為P<0.05)(圖4)。

圖4 各組大鼠視網(wǎng)膜組織NLRP3、Caspase-1蛋白表達(dá)水平 A：對照組；B：模型組；C：葡萄籽原花青素組；D：VX-765組；E：葡萄籽原花青素+VX-765組。與對照組相比，aP<0.05；與模型組相比，bP<0.05；與葡萄籽原花青素組相比，cP<0.05；與VX-765組相比，dP<0.05。

3 討論

近年來，隨著營養(yǎng)物質(zhì)攝入的富足，DR患病率逐年增加，已成為引起全世界視力損害和失明的主要原因之一，抗血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)藥物是目前臨床常用的DR治療用藥，但該類藥物一般針對DR病情進(jìn)展到新生血管形成時的患者，且需每月注射，會使患者產(chǎn)生較大的精神壓力，并帶來沉重的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。因此，尋找新型藥物在DR的早期預(yù)防及治療中具有重要意義[10,12-13]。本研究以腹腔注射鏈脲佐菌素的方法誘導(dǎo)建立DR模型，結(jié)果顯示，建模大鼠血糖濃度明顯升高，視網(wǎng)膜組織中ROS與MDA水平，血清中AGEs、IL-1β與IL-18水平顯著升高，SOD與CAT水平顯著降低，視網(wǎng)膜組織明顯變薄，結(jié)構(gòu)疏松，細(xì)胞結(jié)構(gòu)層次紊亂、排列不規(guī)則，RGC變少、稀疏，呈現(xiàn)嚴(yán)重病理損傷變化，RGC焦亡嚴(yán)重，表明腹腔注射鏈脲佐菌素可升高大鼠血糖，刺激炎癥因子和ROS大量生成，引發(fā)強烈的炎癥反應(yīng)，減弱抗氧化活性，導(dǎo)致RGC變性焦亡，造成視網(wǎng)膜組織嚴(yán)重的病理損傷，促使DR發(fā)生發(fā)展，提示大鼠DR模型誘導(dǎo)成功。

許多研究表明，高糖引發(fā)的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)是DR發(fā)生的重要因素，抗炎與抗氧化藥物的應(yīng)用在DR的預(yù)防、病情緩解及早期治療中發(fā)揮著重要作用[14-15]。葡萄籽原花青素作為一種天然黃酮類抗氧化劑，可明顯減輕糖尿病大鼠炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激損傷，保護(hù)其腎組織免受缺血-再灌注損傷，還可減弱過氧化氫誘導(dǎo)的人晶狀體上皮細(xì)胞氧化損傷，通過抑制缺血-再灌注導(dǎo)致的炎癥及氧化應(yīng)激損傷而保護(hù)視網(wǎng)膜組織，因而推測葡萄籽原花青素可能對DR具有治療作用[8-9,16]。本研究結(jié)果顯示，葡萄籽原花青素可減輕DR大鼠視網(wǎng)膜組織病理損傷，降低其RGC焦亡率，視網(wǎng)膜組織中ROS與MDA水平，血清中AGEs、IL-1β與IL-18水平，升高視網(wǎng)膜組織中SOD與CAT水平，表明葡萄籽原花青素可清除高糖誘導(dǎo)產(chǎn)生的ROS，降低炎癥因子水平，增強大鼠抗氧化功能，減輕視網(wǎng)膜組織炎癥及氧化應(yīng)激損傷，抑制RGC焦亡，緩解DR進(jìn)展。

NLRP3炎癥小體信號在DR的發(fā)病及病情發(fā)展過程中起到重要的調(diào)控作用，高糖可誘導(dǎo)并促進(jìn)NLRP3炎癥小體形成，進(jìn)而激活下游Caspase-1焦亡信號通路，導(dǎo)致視網(wǎng)膜組織細(xì)胞變性死亡[5-7,17]，抑制NLRP3/Caspase-1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，可增強糖尿病大鼠抗氧化活性，減輕炎癥，降低氧化應(yīng)激水平，緩解視網(wǎng)膜組織病變，因而干擾NLRP3/Caspase-1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是防治DR的有效手段[18]。本研究以葡萄籽原花青素處理DR大鼠，可降低視網(wǎng)膜組織中NLRP3與Caspase-1蛋白表達(dá)，且以葡萄籽原花青素和NLRP3抑制劑VX-765聯(lián)合處理DR大鼠，可增強葡萄籽原花青素對DR大鼠的治療作用，兩者具有協(xié)同作用，表明葡萄籽原花青素抑制DR大鼠RGC焦亡，保護(hù)其視網(wǎng)膜組織，可能是通過下調(diào)NLRP3/Caspase-1通路實現(xiàn)的。

總之，葡萄籽原花青素可顯著抑制高糖誘導(dǎo)的ROS及炎癥因子產(chǎn)生，減輕炎癥反應(yīng)和過氧化反應(yīng)，緩解視網(wǎng)膜組織病理學(xué)損傷，抑制RGC焦亡，延緩DR病情進(jìn)展，下調(diào)NLRP3/Caspase-1信號通路可能是其發(fā)揮上述藥理功效的作用機制。本研究為DR的臨床治療帶來了新的希望，但關(guān)于其藥理機制的研究還不夠深入，后續(xù)還會通過激活NLRP3/Caspase-1信號通路進(jìn)行對照驗證。