金雀異黃酮對(duì)大鼠視網(wǎng)膜缺血-再灌注損傷的保護(hù)作用△

張 靜

視網(wǎng)膜缺血-再灌注(I/R)損傷是指視網(wǎng)膜組織缺血再次恢復(fù)血流灌注后，再灌注區(qū)視網(wǎng)膜發(fā)生進(jìn)一步損傷，病因主要包括視網(wǎng)膜血管阻塞、急性青光眼、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變、糖尿病視網(wǎng)膜病變[1-3]。由于視網(wǎng)膜高度依賴氧供應(yīng)，I/R誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激被認(rèn)為是視網(wǎng)膜損傷的直接原因[4-6]，I/R損傷會(huì)增加活性氧(ROS)水平，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和壞死，這是引起細(xì)胞死亡的重要原因[7]。炎癥同樣也是I/R損傷發(fā)生的另一重要原因[8-9]。

現(xiàn)有研究證實(shí)，黃酮類藥物具有廣泛的藥理活性，主要包括抗炎、抗氧化、改善血脂代謝、改善心血管疾病預(yù)后等作用[10-12]。金雀異黃酮(GEN)是大豆異黃酮的主要活性成分之一。已有研究表明，GEN對(duì)降低血脂水平、抗脂質(zhì)過(guò)氧化、改善心血管疾病、抗癌等方面都具有良好的效果[13-16]，此外,有研究表明,GEN對(duì)大鼠心肌I/R損傷具有保護(hù)作用，減少心肌細(xì)胞凋亡[17]，但其在視網(wǎng)膜I/R損傷后的保護(hù)作用相關(guān)研究較少。本研究通過(guò)建立大鼠視網(wǎng)膜I/R損傷模型，觀察GEN對(duì)視網(wǎng)膜I/R損傷的改善作用，并初步探討其相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料SPF 級(jí)健康無(wú)眼疾SD雄性大鼠，鼠齡為12周，體重200～220 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。GEN(GEN純度≥98%)購(gòu)自嘉興禾晟生物制品有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組與處理選取30只健康Wistar大鼠，按照隨機(jī)數(shù)字表法將其分為假手術(shù)組、I/R組和I/R+GEN組，每組各10只。I/R組和I/R+GEN組大鼠采用前房灌注生理鹽水升高眼壓法制備視網(wǎng)膜I/R損傷模型，I/R組大鼠術(shù)后每天予以腹腔注射生理鹽水(1 mL·kg-1·d-1)，I/R+GEN組大鼠術(shù)后每天予以注射GEN (40 mL·kg-1·d-1)；假手術(shù)組大鼠行相應(yīng)假手術(shù)后每天予以注射生理鹽水(1 mL·kg-1·d-1)，連續(xù)處理7 d后，頸椎脫臼法處死各組大鼠，取眼部組織。

1.2.2 視網(wǎng)膜I/R損傷模型構(gòu)建采用前房灌注生理鹽水升高眼壓法制備大鼠視網(wǎng)膜I/R損傷模型:腹腔注射異戊巴比妥鈉麻醉大鼠，鹽酸奧布卡因進(jìn)行結(jié)膜表面麻醉 2 次，同時(shí)復(fù)方托吡卡胺滴眼液散瞳 2 次。輸液器連接30 G針頭，自大鼠顳側(cè)角膜緣穿刺進(jìn)入前房并固定，升高輸液瓶(生理鹽水250 mL)至形成109.7 mmHg(1 kPa=7.5 mmHg)的眼壓[18]，若觀察到球結(jié)膜蒼白、眼底血管斷流，表明視網(wǎng)膜缺血性損傷構(gòu)建成功；1 h后降低輸液瓶，使其高度與大鼠水平一致，將前房灌注針頭拔出，以眼結(jié)膜顏色變紅、視網(wǎng)膜血管血流恢復(fù)為大鼠視網(wǎng)膜I/R損傷模型構(gòu)建成功。同時(shí)排除造模時(shí)角膜貫穿傷或造模后外傷性白內(nèi)障的大鼠。假手術(shù)組大鼠僅穿刺，前房不灌注生理鹽水。

1.2.3 HE染色檢測(cè)各組大鼠視網(wǎng)膜各層厚度I/R 損傷后7 d處死各組大鼠，摘除眼球并在40 g·L-1多聚甲醛中固定24 h后，對(duì)視網(wǎng)膜組織進(jìn)行石蠟包埋并切片，使用HE(Macklin，上海)染色，400倍光學(xué)顯微鏡(Olympus，日本東京)下觀察并采集圖像。既往研究表明，視網(wǎng)膜厚度可反映視網(wǎng)膜細(xì)胞數(shù)量的變化[19]，因此本研究測(cè)量了視網(wǎng)膜各層的厚度來(lái)量化細(xì)胞丟失的程度以判斷大鼠視網(wǎng)膜的缺血性損傷。測(cè)量整個(gè)視網(wǎng)膜厚度(內(nèi)界膜和色素上皮之間)、外核層(ONL)和外叢狀層(OPL)、內(nèi)叢狀層(IPL)、內(nèi)核層(INL)和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層(GCL)的厚度。每組記錄6眼的平均值作為代表值，重復(fù)3次。

1.2.4 免疫組織化學(xué)測(cè)定各組大鼠RGC相對(duì)存活率I/R損傷后7 d處死大鼠，摘除眼球并在40 g·L-1多聚甲醛中固定24 h后，從眼球中分離視網(wǎng)膜，PBS沖洗，進(jìn)行視網(wǎng)膜中Ⅲ型微管蛋白免疫組織化學(xué)染色，熒光顯微鏡(Zaiss，德國(guó))下觀察染色情況，并計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞的平均密度，即樣本區(qū)內(nèi)RGC存活細(xì)胞總數(shù)除以樣本區(qū)面積,結(jié)果取與假手術(shù)組作為對(duì)照進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化后的相對(duì)存活率。

1.2.5 細(xì)胞凋亡的測(cè)定采用TUNEL(Roche,德國(guó))法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。PBS洗滌3組大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞后，利用40 g·L-1多聚甲醛固定細(xì)胞30 min后再次進(jìn)行洗滌，隨后用含體積分?jǐn)?shù)0.1% Triton X-100的PBS重懸細(xì)胞，冰孵2 min后再次洗滌2次。加入50 μL TUNEL檢測(cè)液，37 ℃避光孵育60 min，PBS洗滌2次，250 μL PBS懸浮細(xì)胞，涂片后在熒光顯微鏡下觀察并進(jìn)行定量分析。

1.2.6 各組大鼠視網(wǎng)膜中過(guò)氧化氫酶、丙二醛、總超氧化物歧化酶水平分析取各組大鼠視網(wǎng)膜組織，制備成勻漿后取上清液，按照說(shuō)明書，利用過(guò)氧化氫酶(CAT)、丙二醛(MDA)、總超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(南京建成生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行CAT、MDA、SOD水平的測(cè)定。

1.2.7 Western blot檢測(cè)視網(wǎng)膜I/R損傷后各組大鼠視網(wǎng)膜中NLRP3、ASC及Caspase-1的蛋白表達(dá)使用含有1 mmol·L-1PMSF的RIPA裂解緩沖液(碧云天，中國(guó))提取各組大鼠視網(wǎng)膜組織總蛋白，然后使用增強(qiáng)的BCA蛋白分析試劑盒采用微孔板讀取器(Flexstation 3，美國(guó))測(cè)量NLRP3、ASC、Caspase-1的蛋白濃度。通過(guò)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離40 ng組織蛋白并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜(Bio-Rad，美國(guó))上。用50 g·L-1脫脂乳粉封閉2 h后，用一抗[抗NLRP3、ASC、 Caspase-1(1400)]孵育過(guò)夜后與二抗兔/小鼠抗-IgG(110 000)一起在室溫下孵育2 h后洗滌，隨后利用ECL化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)(Biorad公司，美國(guó))檢測(cè)蛋白質(zhì)條帶并進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量指標(biāo)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間總體比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用 LSD-q法。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠視網(wǎng)膜各功能層的厚度比較大鼠視網(wǎng)膜進(jìn)行HE染色后結(jié)果顯示， I/R組、I/R+GEN組和假手術(shù)組大鼠視網(wǎng)膜總厚度分別為(114.37±7.32)μm、(155.31±6.83)μm、(178.98±13.65)μm，3組總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=14.284，P<0.01)，I/R組大鼠視網(wǎng)膜總厚度低于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=12.681，P<0.01)，I/R+GEN組大鼠視網(wǎng)膜總厚度高于I/R組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=13.957，P<0.01)。I/R組、I/R+GEN組和假手術(shù)組大鼠視網(wǎng)膜IPL厚度分別為(18.95±5.06)μm、(20.69±8.13)μm和(11.73±3.15)μm，INL厚度分別為(17.62±4.69)μm、(25.74±6.78)μm和(11.97±3.56)μm，GCL厚度分別為(19.03±4.74)μm、(26.71±7.85)μm和(12.59±3.24)μm，OPL厚度分別為(6.89±2.41)μm、(7.93±3.46)μm和(9.47±5.24)μm，ONL厚度分別為(19.74±5.85)μm、(23.19±6.19)μm和(29.43±6.23)μm，3組大鼠IPL、INL和GCL厚度總體比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)，I/R組與假手術(shù)組IPL、INL和GCL厚度相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)，I/R+GEN組與I/R組IPL、INL和GCL厚度相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)(圖1)。

圖1 HE染色觀察各組大鼠視網(wǎng)膜各功能層的厚度 A：假手術(shù)組；B：I/R 組；C I/R+GEN組。

2.2 各組大鼠RGC存活率比較免疫熒光分析視網(wǎng)膜中Ⅲ型微管蛋白的含量來(lái)評(píng)估RGC的相對(duì)存活率，結(jié)果顯示，I/R組、I/R+GEN組和假手術(shù)組大鼠視網(wǎng)膜中RGC相對(duì)存活率分別為(26.87±3.12)%、(73.46±7.80)%、(100.00±5.64)%，三組總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=16.825，P<0.01)，I/R組RGC相對(duì)存活率低于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=15.793，P<0.01)，I/R+GEN組RGC相對(duì)存活率高于I/R組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=15.106，P<0.01)(圖2)。

圖2 各組大鼠RGC相對(duì)存活率 A：假手術(shù)組免疫熒光圖；B：I/R組免疫熒光圖；C：I/R+GEN組免疫熒光圖；D：免疫熒光定量分析。

2.3 各組大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞的凋亡和氧化應(yīng)激反應(yīng)利用TUNEL染色對(duì)各組大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，I/R組、I/R+GEN組和假手術(shù)組大鼠視網(wǎng)膜中CAT含量分別為(22.84±5.39)U·mg-1、(41.27±8.64)U·mg-1、(61.52±6.62)U·mg-1，MDA含量分別為(22.75±1.74) nmol·g-1、(10.68±3.46)nmol·g-1、(6.03±2.33)nmol·g-1，SOD含量分別為(0.37±0.05)U·g-1、(0.64±0.04)U·g-1、(0.95±0.08)U·g-1；三組大鼠視網(wǎng)膜中CAT、MDA、SOD水平總體比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.01)，I/R組與I/R+GEN組和假手術(shù)組大鼠視網(wǎng)膜中CAT、MDA、SOD水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。

2.4 三組大鼠視網(wǎng)膜中NLRP3、ASC及Caspase-1的蛋白表達(dá)為了觀察I/R損傷和GEN給藥后各組大鼠視網(wǎng)膜炎癥反應(yīng)變化，本研究對(duì)NLRP3炎癥小體激活進(jìn)行研究，采用Western bolt方法分析炎癥小體復(fù)合物三個(gè)重要組分的相對(duì)表達(dá)水平，結(jié)果顯示，I/R組、I/R+GEN組和假手術(shù)組大鼠視網(wǎng)膜中NLRP3蛋白蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為(413.25±26.34)%、(157.64±20.21)%、(100.00±12.36)%，ASC蛋白蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為(371.29±33.66)%、(176.48±20.59)%、(100.00±15.27)%，Caspase-1蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為(194.67±24.91)%、(443.17±42.39)%、(100.00±11.82)%；3組大鼠NLRP3、ASC和Caspase-1的蛋白相對(duì)表達(dá)量總體比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.01)，I/R組與I/R+GEN組和假手術(shù)組大鼠視網(wǎng)膜中NLRP3蛋白、ASC蛋白、Caspase-1蛋白水平相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)(圖3)。

3 討論

已有研究表明，視網(wǎng)膜I/R損傷機(jī)制與一氧化氮調(diào)控、平衡鈣離子穩(wěn)態(tài)、炎癥反應(yīng)介入、鈣超載、細(xì)胞凋亡、基因調(diào)控及氧自由基損傷等有密切關(guān)系[19]。隨著研究的深入，有研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激可以引起視網(wǎng)膜I/R損傷中多條途徑發(fā)生變化，如細(xì)胞凋亡與增殖、炎癥反應(yīng)、自由基產(chǎn)生、細(xì)胞程序性死亡等[20]。胡世興等[18]研究發(fā)現(xiàn)，缺血60 min再灌注大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞12～48 h表現(xiàn)出凋亡現(xiàn)象，其中24 h最為嚴(yán)重。鄧輝等[21]在探討紅參對(duì)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損傷的影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)紅參可以抑制凋亡基因bcl-2和bax的表達(dá)，減少視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡的發(fā)生[21]。本研究證實(shí)，I/R大鼠視網(wǎng)膜中ONL和GCL均可見凋亡細(xì)胞，該類凋亡細(xì)胞呈棕黃色，分布于各正常細(xì)胞之間，形態(tài)學(xué)上有核固縮、染色質(zhì)凝固、核膜下成環(huán)形或半月形等。本研究結(jié)果與前人研究一致，表明視網(wǎng)膜I/R損傷可以引起細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

GEN是黃酮類化合物常見的一種類型，廣泛存在于豆科植物中，產(chǎn)生于苯丙氨酸代謝過(guò)程中[22]。研究表明，GEN具有降低血脂、抗脂質(zhì)過(guò)氧化、改善心血管疾病、抗癌等作用。本研究發(fā)現(xiàn)，GEN可顯著減少視網(wǎng)膜I/R損傷后視網(wǎng)膜中ONL和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損傷，降低凋亡因子含量，陽(yáng)性反應(yīng)集中在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和內(nèi)界膜周圍，呈現(xiàn)點(diǎn)狀或塊狀著色，部分內(nèi)界膜縱向陽(yáng)性纖維突起可見增粗或增多，穿過(guò)GCL，進(jìn)入IPL內(nèi)側(cè)，呈現(xiàn)陽(yáng)性著色團(tuán)；視網(wǎng)膜細(xì)胞外界膜處也可形成一條著色線，其中ONL可見弱陽(yáng)性纖維，OPL可見陽(yáng)性著色。GEN對(duì)大鼠視網(wǎng)膜I/R損傷的保護(hù)作用可能是通過(guò)以下機(jī)制進(jìn)行：由于視網(wǎng)膜高度依賴氧供應(yīng)，對(duì)受損的血流非常敏感，I/R損傷后誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激被認(rèn)為是視網(wǎng)膜損傷的直接原因[4-6]，I/R損傷后會(huì)增加ROS水平，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和壞死，這是引起細(xì)胞死亡的重要調(diào)節(jié)因子[7]。

研究表明，I/R損傷后可誘導(dǎo)多種炎癥介質(zhì)，包括白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、IL-6和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的分泌[8-9]。另外有大量研究表明，NLRP3炎癥小體參與了視網(wǎng)膜I/R損傷的病理過(guò)程[23-24]，NLRP3 炎癥小體能夠在視網(wǎng)膜I/R中被活化，過(guò)度活化的 NLRP3炎癥小體可使無(wú)活性的 Pro-Caspase-1 轉(zhuǎn)化為有活性的 Caspase-1，Caspase-1可間接介導(dǎo)炎癥因子的釋放，引起病理性的炎癥反應(yīng)增加[25]，缺血后細(xì)胞通過(guò)吞噬天然非特異性免疫系統(tǒng)的細(xì)胞，炎癥反應(yīng)加重，壞死細(xì)胞釋放大量壞死因子介導(dǎo)炎癥應(yīng)激，導(dǎo)致I/R后視網(wǎng)膜的進(jìn)一步損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，I/R組和I/R+GEN組大鼠視網(wǎng)膜中CAT、MDA、SOD水平均明顯降低，NLRP3、ASC和Caspase-1的蛋白表達(dá)水平升高，表明這兩組大鼠視網(wǎng)膜中過(guò)度的氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)的存在，而利用GEN治療后得到明顯改善，這與既往關(guān)于GEN具有抗氧化及抗炎的作用結(jié)論基本一致。該結(jié)果與前人研究一致，說(shuō)明I/R損傷后視網(wǎng)膜細(xì)胞氧化及抗氧化能力失衡，最終給視網(wǎng)膜帶來(lái)嚴(yán)重的破壞，而GEN對(duì)I/R后視網(wǎng)膜損傷具有良好的保護(hù)作用。

本研究雖然闡述了GEN對(duì)大鼠視網(wǎng)膜I/R損傷后對(duì)視網(wǎng)膜的保護(hù)作用是通過(guò)抗氧化和抗炎癥機(jī)制實(shí)現(xiàn)的，但是該研究仍然有一定的局限性。首先，該研究選取大鼠數(shù)量、分組都較少，在后續(xù)研究中應(yīng)當(dāng)擴(kuò)大樣本量更深入研究；其次，本研究是在大鼠中進(jìn)行，與高等哺乳動(dòng)物代謝能力仍有一定差距，在將來(lái)的研究中應(yīng)當(dāng)選擇更多動(dòng)物模型進(jìn)行研究；第三，本研究本沒(méi)有找到GEN在大鼠體內(nèi)的識(shí)別受體，在將來(lái)的研究中應(yīng)當(dāng)進(jìn)一步研究其作用分子機(jī)制，所以，關(guān)于GEN 這一保護(hù)作用的具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究加以揭示。