糖尿病視網(wǎng)膜病變患者血清轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β水平變化及其在監(jiān)測(cè)抗VEGF藥物治療效果中的作用

楊 潔 朱曉敏 胡子毅 張會(huì)民 馮子龍

糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)是眼科常見且可致盲的眼病之一，其患者眼底表現(xiàn)多樣，以增生型DR(PDR)為致盲的首要原因。PDR的病變特征多與視網(wǎng)膜或視盤上新生血管形成有關(guān)。近年，抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)藥物已廣泛應(yīng)用于糖尿病性黃斑水腫(DME)患者的治療[1-4]，不僅被證實(shí)對(duì)DR引起的黃斑水腫有效，且可以促進(jìn)視網(wǎng)膜和視盤上的新生血管消退、減少血管滲漏，進(jìn)而延緩PDR進(jìn)展[5-6]。而尋找有效的生物標(biāo)志物來(lái)監(jiān)測(cè)抗VEGF藥物的臨床療效則具有重要的參考價(jià)值。目前已報(bào)道超敏C反應(yīng)蛋白(hsCRP)、細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)等全身性炎癥因子可能在抗VEGF藥物治療非應(yīng)答者中起重要作用[7]。除了血管生成和炎癥外，視網(wǎng)膜纖維化也被證實(shí)是PDR發(fā)病機(jī)制中的一個(gè)有害因素。而轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因-β(TGF-β)作為多功能細(xì)胞因子，不僅參與了視網(wǎng)膜纖維化過程，還可促進(jìn)新生血管形成[8]。有研究證實(shí)，檢測(cè)血清TGF-β1水平可作為監(jiān)測(cè)玻璃體內(nèi)阿柏西普治療非PDR(NPDR)和PDR患者臨床療效的有效生物學(xué)指標(biāo)[9]，但TGF-β在監(jiān)測(cè)其他抗VEGF藥物治療效果中的作用未見報(bào)道。雷珠單抗是我國(guó)最常使用的治療黃斑相關(guān)性疾病的一線抗VEGF單克隆抗體藥物，主要與VEGF-A結(jié)合，阻斷其與VEGF受體(VEGFR)-1和VEGFR-2的相互作用，從而減少內(nèi)皮細(xì)胞增殖、血管滲漏和新生血管的形成[10]。本研究將通過測(cè)定DR患者血清TGF-β水平來(lái)評(píng)估其在監(jiān)測(cè)雷珠單抗治療效果中的作用，為指導(dǎo)臨床治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料本研究共納入2020 年1月至2020年12 月本院收治的PDR患者40例(PDR組)、NPDR患者40例(NPDR組)、無(wú)DR癥狀的糖尿病患者40例(糖尿病組)，所有患者在登記前均閱讀并簽署書面知情同意書。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡≥18歲；(2)明確診斷為1型或2型糖尿病患者；(3)經(jīng)眼底檢查、光學(xué)相干斷層掃描(OCT)、眼底熒光素血管造影(FFA)檢查符合視網(wǎng)膜病變的診斷[11]，并進(jìn)一步明確臨床分期；黃斑中心凹厚度(FMT)>250 μm者。排除標(biāo)準(zhǔn)：與糖尿病無(wú)關(guān)的黃斑水腫、角膜病變、青光眼、葡萄膜炎、白內(nèi)障、近期眼部手術(shù)(6個(gè)月內(nèi))者；受試者在先前診斷為其他增生型血管疾病、炎癥性疾病或玻璃體積血情況等；既往接受過視網(wǎng)膜激光光凝或玻璃體內(nèi)注藥治療，包括抗VEGF藥物和激素類者；治療藥物過敏者；無(wú)法完成隨訪者。所有研究對(duì)象均通過雙眼眼底鏡檢查、FFA評(píng)估PDR和NPDR的診斷。另外納入同時(shí)期年齡、性別相匹配的40位健康對(duì)照者作為對(duì)照組，在納入本研究時(shí)，所有研究對(duì)象均經(jīng)過全面的眼科學(xué)評(píng)估和知情同意簽字，并進(jìn)行了空腹靜脈血采樣。本研究嚴(yán)格遵守《赫爾辛基宣言》規(guī)定，而且研究方案得到了我院倫理審查機(jī)構(gòu)的批準(zhǔn)。

1.2 治療方法所有NDR和PNDR患者均在我院接受玻璃體內(nèi)抗VEGF藥物治療。在手術(shù)環(huán)境下，玻璃體內(nèi)注射雷珠單抗前30 min采用復(fù)方托吡卡胺滴眼液常規(guī)散瞳，使用50 g·L-1聚維酮碘溶液消毒結(jié)膜、結(jié)膜表面麻醉后，顳上角膜后側(cè)4.0 mm垂直眼球壁部位進(jìn)針，深度約1 cm，到達(dá)玻璃體后注射雷珠單抗注射液(諾適得)0.05 mL。所有玻璃體內(nèi)注射均在無(wú)菌條件下進(jìn)行。術(shù)后應(yīng)用鹽酸左氧氟沙星滴眼液滴眼預(yù)防感染。

1.3 觀察指標(biāo)及測(cè)量方法眼科臨床評(píng)價(jià)包括雙眼檢眼鏡檢查(Optomap 200Tx超廣角掃描激光檢眼鏡，英國(guó)OPTOS公司)、FFA檢查(TOPCON-50DX眼底照相機(jī)，日本TOPCON公司)和頻域OCT(SD-OCT)(Spectralis OCT激光眼科診斷儀，德國(guó)Heidelberg公司)檢查。所有參與者均接受空腹靜脈采血。NDR和PNDR患者在玻璃體內(nèi)注射抗VEGF藥物治療前和治療后需進(jìn)行2次血液樣本采集。離心獲取血清樣本，并儲(chǔ)存于-80 ℃環(huán)境中。血清樣本用于VEGF-A和TGF-β定量分析?；颊唠S訪1個(gè)月，觀察治療前、治療后1個(gè)月FMT變化。應(yīng)用ELISA試劑盒(上海通蔚生物公司)測(cè)定血清VEGF-A、TGF-β水平，以水平軸為標(biāo)準(zhǔn)品濃度，垂直軸為吸光度，采用相關(guān)軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算待測(cè)指標(biāo)水平，試驗(yàn)前所有試劑混合均勻。

2 結(jié)果

2.1 四組受試者一般資料對(duì)比四組受試者性別構(gòu)成比和年齡比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)。糖尿病組、PDR組、NPDR組患者糖化血紅蛋白(HbAlc)均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)，糖尿病組、PDR組、NPDR組患者HbAlc、糖尿病病程和胰島素使用史比例比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)(表1)。

表1 四組受試者一般資料對(duì)比

2.2 四組受試者治療前血清VEGF-A、TGF-β水平和FMT比較糖尿病組、NPDR組、PDR組患者血清VEGF-A、TGF-β水平均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。NPDR組和PDR組患者血清TGF-β水平和FMT較對(duì)照組和糖尿病組均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)，且PDR組升高更明顯，PDR組與NPDR組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表2)。

表2 四組受試者治療前血清VEGF-A、TGF-β水平和FMT比較

2.3 ROC曲線分析血清TGF-β水平用于患者分層的臨床價(jià)值經(jīng)ROC曲線分析，血清TGF-β水平可以診斷糖尿病患者(AUC=0.860，P<0.001)、糖尿病人群中的DR患者(AUC=0.756，P<0.001)以及鑒別診斷NPDR和PDR患者(AUC=0.734，P<0.001)，血清TGF-β的最佳閾值分別為461.62 ng·L-1、990.16 ng·L-1、1114.21 ng·L-1(圖1)。

圖1 ROC曲線分析血清TGF-β水平用于患者分層的臨床價(jià)值 A:糖尿病患者vs.對(duì)照人群；B:DR患者vs.非DR的糖尿病患者；C：PDR患者vs. NPDR患者。

2.4 多元線性回歸分析血清TGF-β水平與其他臨床因素之間的關(guān)系經(jīng)多元線性回歸分析，校正年齡、性別、胰島素使用史和是否為PDR等混雜因素后，血清TGF-β水平與HbAlc、糖尿病病程均有關(guān)[95%CITGF-β=1.543(1.118～1.849)，95%CIHbAlc=2.699(1.751～4.002)，均為P<0.001]。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，血清TGF-β水平與HbAlc、糖尿病病程均呈正相關(guān)性(r=0.703、0.656，均為P<0.001)(圖2)。

圖2 治療前各指標(biāo)基線值相關(guān)性分析散點(diǎn)圖 A：血清TGF-β水平與HbAlc關(guān)系散點(diǎn)圖；B：血清TGF-β水平與糖尿病病程關(guān)系散點(diǎn)圖。

2.5 NPDR組和PDR組患者治療前后FMT、血清TGF-β、VEGF-A水平變化重復(fù)測(cè)量的方差分析結(jié)果顯示，隨訪1個(gè)月后，兩組患者血清VEGF-A水平較基線值降低(P<0.001)，且兩組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；這兩組患者治療前后血清VEGF-A水平變化趨勢(shì)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。兩組患者治療前后血清TGF-β水平和FMT值變化趨勢(shì)均存在組別和時(shí)間交互效應(yīng)(均為P<0.001)；治療后NPDR組患者血清TGF-β水平和FMT值均顯著低于治療前基線值(均為P<0.001)，而PDR組患者治療前后血清TGF-β水平和FMT值差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.326、0.129)(表3)。

表3 NPDR組和PDR組患者血清VEGF-A、TGF-β水平和FMT變化

2.6 抗VEGF藥物治療后1個(gè)月血清VEGF-A、TGF-β水平與FMT的關(guān)系Spearman秩相關(guān)分析結(jié)果顯示，治療后1個(gè)月，DR患者(包括NPDR組和PDR組患者)血清TGF-β水平與FMT呈正相關(guān)性(r=0.808，P<0.001)，血清VEGF-A水平與FMT無(wú)相關(guān)性(r=0.013，P=0.907)(圖3)。

圖3 治療后1個(gè)月DR患者血清VEGF-A、TGF-β水平與FMT的相關(guān)性分析散點(diǎn)圖 A：血清TGF-β水平與FMT關(guān)系散點(diǎn)圖；B：血清VEGF-A水平與FMT關(guān)系散點(diǎn)圖。

3 討論

DR屬于糖尿病視網(wǎng)膜微血管并發(fā)癥之一，通常由于視網(wǎng)膜損害，導(dǎo)致新生血管生成及纖維增生，最終引起視網(wǎng)膜脫落而致盲[12]。DR的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，血管生成和炎癥是DR發(fā)病機(jī)制中最主要的驅(qū)動(dòng)因素[11]。研究證實(shí)，VEGF參與眼部新生血管形成，是影響DR發(fā)生及發(fā)展的主要因素；眼部微循環(huán)障礙會(huì)加速VEGF釋放到玻璃體內(nèi)，過高的VEGF會(huì)對(duì)視網(wǎng)膜新生血管生成形成刺激，增加新生血管形成及黃斑水腫風(fēng)險(xiǎn)。雷珠單抗為抗VEGF代表藥物之一，可阻斷玻璃體內(nèi)VEGF主要活性亞型VEGF-A，并抑制新生血管生成。同時(shí)，雷珠單抗能逆轉(zhuǎn)視網(wǎng)膜與虹膜的新生血管，促使血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡及新生血管閉塞，通過阻斷VEGF、維持血-視網(wǎng)膜屏障穩(wěn)定性，進(jìn)而達(dá)到減少視網(wǎng)膜血管滲漏、緩解視網(wǎng)膜水腫的目的[13]。因此，應(yīng)用抗VEGF藥物治療能從機(jī)制上有效改善黃斑水腫，達(dá)到DR治療的效果。

目前，對(duì)于DR療效的評(píng)價(jià)有影像學(xué)指標(biāo)和生物學(xué)標(biāo)志物，其中影像學(xué)指標(biāo)主要是超廣角FFA[14-15]、OCT[16]和SD-OCT[17-18]，但由于其成本較高并未得到普及。而生物標(biāo)志物主要為房水、玻璃體中的細(xì)胞因子或生長(zhǎng)因子。不過由于玻璃體樣本量小，風(fēng)險(xiǎn)較大，因而目前多數(shù)研究集中于房水樣本。眾所周知，VEGF-A是病理性血管生成的主要促進(jìn)因子，可激活VEGFR-1和VEGFR-2，而VEGF-B則選擇性地結(jié)合VEGFR-1。VEGF-A蛋白以內(nèi)皮細(xì)胞為靶點(diǎn)，具有多種作用，包括細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移、血管生成和通透性增加。有研究指出，降低VEGF-A水平可以防止VEGF-A 誘導(dǎo)血管滲漏和促進(jìn)新血管生成，減少DR患者FMT，提高手術(shù)的安全性[19]。而VEGF-B在眼科的作用仍然存在爭(zhēng)議，目前關(guān)于VEGF-B的作用研究多集中于心腦血管疾病、惡性腫瘤等方面。因此，VEGF-A被認(rèn)為是DR中至關(guān)重要的生物標(biāo)志物，與DR的嚴(yán)重程度相關(guān)[20]。除了血管生成和炎癥外，視網(wǎng)膜纖維化已成為DR進(jìn)展機(jī)制中的一個(gè)主要有害因素。TGF-β信號(hào)通路與纖維化和細(xì)胞外間質(zhì)重塑密切相關(guān)，一些報(bào)道強(qiáng)調(diào)，TGF-β不僅可促進(jìn)視網(wǎng)膜纖維化，還可以促進(jìn)血管生成，例如TGF-β亞型(1、2、3)均能夠誘導(dǎo)VEGF的表達(dá)[8]。

從易操作性、樣本易得性等方面考量，循環(huán)標(biāo)志物具有天然優(yōu)勢(shì)。前瞻性研究發(fā)現(xiàn)，HbAlc≥7%與HbAlc<7%患者間最佳矯正視力提高或FMT降低比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[21]。進(jìn)一步擴(kuò)大研究發(fā)現(xiàn)，抗VEGF藥物治療后視力改善與患者血糖控制、用藥史、血壓、體重指數(shù)或腎功能等均無(wú)關(guān)[22]。因此，尋找新的標(biāo)志物對(duì)于指導(dǎo)臨床用藥具有重要意義。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)無(wú)論是PDR患者還是NPDR患者，經(jīng)抗VEGF藥物治療后1個(gè)月，血清VEGF-A水平均普遍降低，且兩組間無(wú)明顯差異，血清VEGF-A水平變化與FMT值也無(wú)顯著相關(guān)性，說明監(jiān)測(cè)血清VEGF-A水平并不能完全反應(yīng)抗VEGF藥物的治療效果。有趣的是，Cutsem等[23]臨床試驗(yàn)也證實(shí)，注射抗VEGF藥物后，其治療反應(yīng)并不受血清VEGF-A或胎盤生長(zhǎng)因子水平的影響。此外，在治療前，糖尿病組、NPDR組和PDR組患者血清VEGF-A水平普遍高于對(duì)照組，而這3組患者間差異并無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明血清VEGF-A水平既不能預(yù)測(cè)DR分期，也不能預(yù)測(cè)臨床結(jié)果。

但是值得注意的是，在本研究中，經(jīng)雷珠單抗注射后1個(gè)月時(shí)，NPDR組患者血清TGF-β水平逐漸降低，而PDR組患者血清TGF-β水平變化卻較基線值不明顯，這一結(jié)果可能與PDR患者不受控制的視網(wǎng)膜新血管生成有關(guān)，雖然VEGF信號(hào)被抗VEGF藥物所抑制，但是視網(wǎng)膜纖維化仍然存在。另一方面，根據(jù)我們對(duì)受試者的分層分析，血清TGF-β可以被認(rèn)為是一個(gè)具有敏感性和特異性的DR進(jìn)展生物標(biāo)志物。而本研究證實(shí)血清TGF-β水平對(duì)于預(yù)測(cè)糖尿病患者、糖尿病人群中的DR患者以及鑒別診斷NPDR和PDR患者都能夠提供一定的可參考信息。此外，經(jīng)雷珠單抗注射1個(gè)月后，NPDR患者FMT降低程度顯著，且黃斑水腫基本消失，而PDR組患者FMT值降低不明顯，血清TGF-β水平也沒有顯著變化，說明抗VEGF藥物對(duì)NPDR患者療效更突出。且此時(shí)DR患者血清TGF-β水平與FMT呈正相關(guān)性，說明在臨床病例管理中，不僅可以監(jiān)測(cè)患者黃斑水腫和視網(wǎng)膜基底部，還可以監(jiān)測(cè)臨床實(shí)驗(yàn)室參數(shù)，如血清TGF-β水平。TGF-β參與DR發(fā)生有以下幾種機(jī)制[8,24-25]：(1)TGF-β促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增生、黏附及細(xì)胞外基質(zhì)增生；(2)激活絲裂原活化蛋白激酶，誘導(dǎo)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞表達(dá)VEGF，促進(jìn)視網(wǎng)膜新生血管形成；(3)促進(jìn)纖維連接蛋白的合成，導(dǎo)致血管纖維化。在糖尿病內(nèi)皮細(xì)胞外基質(zhì)生成和血管重塑中TGF-β亦發(fā)揮重要作用。近期研究結(jié)果表明，TGF-β可通過刺激活化素受體樣激酶5合成維持早期DR視網(wǎng)膜血管完整性，延緩視網(wǎng)膜病變進(jìn)展[8]。因此，不難推測(cè)，由于抗VEGF藥物的抗新生血管形成的作用，對(duì)抗了TGF-β促進(jìn)視網(wǎng)膜新生血管形成、內(nèi)皮細(xì)胞增生等的作用，在抗VEGF藥物治療過程中表現(xiàn)為隨著療效的提升及癥狀的改善，血清TGF-β水平呈逐漸下降趨勢(shì)。

總之，血清TGF-β水平可以被認(rèn)為是預(yù)測(cè)從 NPDR到PDR疾病進(jìn)展的一個(gè)生物標(biāo)志物，它亦可能是抗VEGF藥物臨床療效的次要終點(diǎn)。但是本研究樣本數(shù)量有限，日后需要更大規(guī)模的追蹤研究以加強(qiáng)數(shù)據(jù)支持和關(guān)于TGF-β在DR中的預(yù)后價(jià)值的結(jié)論。