柔嫩艾美耳球蟲(chóng)gam22基因重組質(zhì)粒的免疫原性及保護(hù)效果

董 青,王京森,李 新,王曉岑,李建華

(1. 吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院,吉林 長(zhǎng)春 130062 ； 2. 河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)藥學(xué)院,河南 鄭州 450011)

雞球蟲(chóng)病是由艾美耳屬(Eimeria)的球蟲(chóng)寄生于雞腸道引起腸道炎癥、便血和產(chǎn)蛋率下降的寄生蟲(chóng)病[1]，其中柔嫩艾美耳球蟲(chóng)(Eimeriatenella)的致病力最強(qiáng)[2-3]。免疫預(yù)防是防控柔嫩艾美耳球蟲(chóng)病的重要手段，其中基因工程疫苗是當(dāng)前研究的重要內(nèi)容之一。目前已報(bào)道的柔嫩艾美耳球蟲(chóng)保護(hù)性抗原有蟲(chóng)體表面抗原(如Et3-1E和EtSAG4[4]等)、微線蛋白(如EtMIC2和EtMIC3等)、棒狀體蛋白(如EtROP5和EtRON2等)以及配子體抗原(Etgam22[5]和Etgam59等)等。曹李琴[6]成功擴(kuò)增出柔嫩艾美耳球蟲(chóng)配子體Etgam22基因，該基因的開(kāi)放性閱讀框大小為597 bp，編碼198個(gè)氨基酸，蛋白大小約為22 kDa，通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)該基因編碼區(qū)存在4個(gè)抗原決定簇，且該蛋白具有無(wú)規(guī)則卷曲、轉(zhuǎn)角區(qū)域、折疊等二級(jí)結(jié)構(gòu)，預(yù)示此蛋白免疫原性良好。目前使用的雞球蟲(chóng)保護(hù)性抗原表達(dá)系統(tǒng)有原核表達(dá)、真核表達(dá)和甲病毒復(fù)制子載體等，細(xì)菌、病毒以及改造后的雞球蟲(chóng)也可作為疫苗載體。甲病毒構(gòu)建的重組質(zhì)粒具有高效表達(dá)目的基因、引起Th1型細(xì)胞免疫反應(yīng)、在胞漿中表達(dá)目的蛋白之后便引發(fā)凋亡而被機(jī)體清理、安全性好等優(yōu)點(diǎn)，已用于弓形蟲(chóng)、瘧原蟲(chóng)、柔嫩艾美耳球蟲(chóng)疫苗的研究。本試驗(yàn)選用Etgam22基因，構(gòu)建pSMART2b-Etgam22重組質(zhì)粒并表達(dá)該蛋白，通過(guò)動(dòng)物試驗(yàn)檢測(cè)其誘導(dǎo)雞體免疫應(yīng)答和抗柔嫩艾美耳球蟲(chóng)保護(hù)效果。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 1日齡海蘭褐雛雞，購(gòu)自長(zhǎng)春市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，飼養(yǎng)在無(wú)球蟲(chóng)環(huán)境中。

1.2 材料 柔嫩艾美耳球蟲(chóng)由本實(shí)驗(yàn)室保存，定期傳代復(fù)壯；甲病毒復(fù)制子載體pSMART2b和293T細(xì)胞保存于本實(shí)驗(yàn)室；DH5α感受態(tài)細(xì)胞、質(zhì)粒快速小提試劑盒，均購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；Percoll，購(gòu)自GE公司；DL2 000 Marker、DL15 000 Marker、DNA膠回收試劑盒、反轉(zhuǎn)錄相關(guān)試劑、BamH Ⅰ和ClaⅠ限制性內(nèi)切酶、PrimeSTAR GXL DNA Polymerase等，均購(gòu)自TaKaRa公司；RIPA裂解液，購(gòu)自碧云天生物科技有限公司；無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒小提試劑盒，購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；ClonExpressII?One Step Cloning Kit，購(gòu)自諾唯贊生物科技股份有限公司；雞抗柔嫩艾美耳球蟲(chóng)陽(yáng)性血清為本實(shí)驗(yàn)室前期制備；胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基，均購(gòu)自BI公司；IL-2和IFN-γ 細(xì)胞因子ELISA試劑盒，購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.3 柔嫩艾美耳球蟲(chóng)配子體收集

1.3.1 柔嫩艾美耳球蟲(chóng)孢子化卵囊的收集 從4 ℃冰箱中取出保存在2.5%重鉻酸鉀溶液中的孢子化卵囊，1 500 g離心10 min，棄掉上清，重復(fù)上述步驟3次；在沉淀中加入10% NaClO溶液，4 ℃中存放20 min殺菌，離心取沉淀加入PBS溶液，重復(fù)上述步驟3次，用一定體積PBS重懸蟲(chóng)體備用。

1.3.2 雞柔嫩艾美耳球蟲(chóng)配子體的分離和純化 配制SAC(1L)溶液(NaCl 9.85 g；CaCl20.55 g；葡萄糖 1.8 g；BSA 1 mg/mL；PMSF 0.17 g；Tris 1.21 g；透明質(zhì)酸酶 0.5 mg/mL)備用。將1日齡雛雞飼養(yǎng)在無(wú)球蟲(chóng)污染的環(huán)境中，于21日齡時(shí)接種1×104個(gè)孢子化卵囊，約132 h后剖殺雞只收集盲腸，剖開(kāi)盲腸后用4 ℃預(yù)冷的SAC溶液沖洗腸道，刮取腸黏膜并浸入SAC溶液中，于37 ℃恒溫?fù)u床消化1.5 h。然后分別用60目銅篩、260目網(wǎng)篩和17 μm孔徑的濾膜過(guò)濾去除組織碎片。將收集的濾液于3 500 g離心15 min，用PBS重懸蟲(chóng)體，重復(fù)洗滌離心2次[7]。用PBS重懸蟲(chóng)體并加入紅細(xì)胞裂解液，然后加入Percoll制成含有配子體的30% Percoll懸液，總體積為5 mL；取1支10 mL離心管，先向管底加入2 mL 50% Percoll分離液，再將含有配子體的30% Percoll懸液置于上層，3 500 g 水平離心10 min；將所得配子體沉淀用PBS反復(fù)洗滌5次，收集配子體沉淀保存于-20 ℃。

1.4 引物設(shè)計(jì)與合成 從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取柔嫩艾美耳球蟲(chóng)Etgam22基因序列(GenBank:KY887585.1)，利用Oligo 7設(shè)計(jì)擴(kuò)增目的片段的引物，根據(jù)諾唯贊ClonExpressII?One Step Cloning Kit說(shuō)明書，在上、下游引物的5′端加入與插入載體兩端同源的序列(方框內(nèi)序列)，便于用無(wú)縫克隆技術(shù)連接目的片段與載體。引物由吉林庫(kù)美生物公司合成，其序列為：上游引物(Forward primer)：GCGTGGGTCTGGATCGGATCCGATGAGGACTATCCTAGCCACCC(BamH Ⅰ);下游引物(Reverse primer)：CGGGCCCTAGGATGCATCGATGTTGATGTCGGTAAGCTGCTCTT(ClaⅠ)。

1.5 Etgam22基因的PCR擴(kuò)增 采用TRIzol法提取柔嫩艾美耳球蟲(chóng)配子體總RNA，取2 μg 總RNA用于反轉(zhuǎn)錄成cDNA，先加入Oligo(dT)引物1 μL，用H2O 補(bǔ)齊至總體積13 μL，65 ℃ 5 min，然后迅速冰浴2 min；再向上述體系中加入M-MLV 1 μL，RRI 1 μL，dNTP 1 μL，5×M-MLV Buffer 4 μL，于PCR儀中進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄42 ℃ 1 h，70 ℃ 15 min，4 ℃保存。以獲得的cDNA為模板，按照如下反應(yīng)體系(50 μL)擴(kuò)增Etgam22基因：5×Buffer 10 μL，dNTP 4 μL，PrimeSTAR GXL Enzymes 1 μL，F(xiàn)orward primer 1 μL，Reverse primer 1 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 31 μL。將PCR擴(kuò)增程序設(shè)置如下：98 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，68 ℃ 40 s，共34個(gè)循環(huán)；68 ℃再延伸5 min，4 ℃保存。將PCR產(chǎn)物用于凝膠電泳檢測(cè)，并用膠回收試劑盒回收目的片段。

1.6 重組質(zhì)粒pSMART2b-Etgam22的構(gòu)建 用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和ClaⅠ對(duì)pSMART2b載體進(jìn)行雙酶切，膠回收線性化pSMART2b。按照ClonExpressII?One Step Cloning Kit說(shuō)明書，以無(wú)縫克隆方式將Etgam22基因與線性化pSMART2b載體進(jìn)行連接。然后將重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞。篩選陽(yáng)性單克隆菌落后，將培養(yǎng)獲得的菌液提取質(zhì)粒并進(jìn)行PCR鑒定。委托吉林庫(kù)美生物公司對(duì)鑒定陽(yáng)性的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，對(duì)序列正確的菌種進(jìn)行保種。

1.7 重組質(zhì)粒pSMART2b-Etgam22的蛋白表達(dá)鑒定 利用無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒提取pSMART2b-Etgam22重組質(zhì)粒和pSMART2b空載體，用脂質(zhì)體法將兩種載體分別轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞，同時(shí)設(shè)置293T細(xì)胞空白對(duì)照。轉(zhuǎn)染24 h后用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白。SDS-PAGE電泳后進(jìn)行Western Blot，用雞抗柔嫩艾美耳球蟲(chóng)陽(yáng)性血清作為一抗，對(duì)pSMART2b-Etgam22融合蛋白進(jìn)行免疫反應(yīng)性分析。

1.8 雛雞抗體水平以及IFN-γ和IL-2細(xì)胞因子的檢測(cè) 選取7日齡雛雞隨機(jī)分為3組，分別為白對(duì)照組(陰性對(duì)照)、紅對(duì)照組(未免疫感染組)和pSMART2b-Etgam22免疫組。將pSMART2b-Etgam22以30 μg的劑量在7、14日齡和21日齡免疫雛雞。分別在未免疫前以及一免、二免、三免后7 d采血、收集血清，ELISA法檢測(cè)Etgam22抗體水平，利用商品化ELISA試劑盒檢測(cè)雞IFN-γ和IL-2分泌水平。

1.9 抗球蟲(chóng)免疫保護(hù)效果評(píng)價(jià) 在28日齡時(shí)對(duì)紅對(duì)照組、pSMART2b-Etgam22免疫組的每羽雞接種1×104個(gè)柔嫩艾美耳球蟲(chóng)孢子化卵囊。觀察死亡情況，攻蟲(chóng)1周后稱重并剖殺，檢測(cè)體重變化、卵囊數(shù)量、盲腸病變，計(jì)算存活率、增重率、卵囊值、盲腸病變計(jì)分，計(jì)算抗球蟲(chóng)指數(shù)(Anticoccidial index,ACI)=(存活率+相對(duì)增重率)-(卵囊值+病變值)，分析其保護(hù)作用。

2 結(jié)果

2.1 柔嫩艾美耳球蟲(chóng)gam22基因的克隆與重組質(zhì)粒pSMART2b-Etgam22的構(gòu)建 對(duì)PCR擴(kuò)增獲得的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，得到了1條長(zhǎng)度約597 bp的目的條帶，與Etgam22基因的預(yù)期片段大小一致(圖1A)。用無(wú)縫克隆技術(shù)連接的pSMART2b-Etgam22重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，對(duì)篩選到的陽(yáng)性菌液提取重組質(zhì)粒，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，得到了1條大小約13 035 bp的目的條帶(圖1B)。將重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳可觀察到1條約597 bp的目的條帶(圖1C)。對(duì)PCR鑒定陽(yáng)性的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，經(jīng)BLAST分析發(fā)現(xiàn)載體上連接的目的條帶與GenBank中柔嫩艾美耳球蟲(chóng)gam22基因序列(KY887585.1)的同源性為100%，說(shuō)明重組質(zhì)粒pSMART2b-Etgam22構(gòu)建成功。

圖1 柔嫩艾美耳球蟲(chóng)Etgam 22基因的克隆與重組質(zhì)粒pSMART2b-Etgam22構(gòu)建Fig. 1 Cloning of E.tenella gam 22 gene and construction of recombinant plasmid pSMART2b-Etgam22A：Etgam22的PCR擴(kuò)增(M： DL-2 000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； 1：Etgam22基因PCR產(chǎn)物)； B：pSMART2b-Etgam22的構(gòu)建(M： DL-15 000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； 1：重組質(zhì)粒pSMART2b-Etgam22)； C：Etgam22的PCR鑒定(M： DL-2 000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； 1：重組質(zhì)粒pSMART2b-Etgam22的PCR鑒定)A：PCR amplification of Etgam22； B：Construction of pSMART2b-Etgam22； C：PCR identification of Etgam22

2.2 pSMART2b-Etgam22蛋白表達(dá)分析 收取細(xì)胞蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳,發(fā)現(xiàn)重組質(zhì)粒pSMART2b-Etgam22轉(zhuǎn)染細(xì)胞樣品約在57kDa位置處有特異條帶，空載pSMART2b本身表達(dá)的蛋白約35kDa，而在57kDa處無(wú)條帶，說(shuō)明目的基因在293T細(xì)胞中得到了表達(dá)(圖2A)。進(jìn)行Western Blot分析，與293T細(xì)胞蛋白(Negative control)和轉(zhuǎn)染pSMART2b的293T細(xì)胞蛋白(pSMART2b)相比，pSMART2b-Etgam22轉(zhuǎn)染組細(xì)胞蛋白可在約57 kDa處觀察到1條被抗柔嫩艾美耳球蟲(chóng)陽(yáng)性血清識(shí)別的單一條帶(圖2B)，與該融合蛋白的理論大小一致，說(shuō)明pSMART2b-Etgam22融合蛋白成功表達(dá)，且具有良好的免疫反應(yīng)性。

圖2 pSMART2b-Etgam22轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后表達(dá)蛋白的分析Fig. 2 Analysis of the protein expression by pSMART2b-Etgam22 after transfection into 293T cellsA：考馬斯亮藍(lán)染色； B：Western BlotA：Coomassie brilliant blue staining； B：Western Blot (M：蛋白Marker； 1：pSMART2b-Etgam22； 2：pSMART2b； 3：293T細(xì)胞)

2.3 雛雞抗體水平和細(xì)胞因子水平檢測(cè) 每次免疫和攻蟲(chóng)前心臟采血收集血清，用ELISA法檢測(cè)雞體的抗體水平。結(jié)果顯示免疫前與一免后pSMART2b-Etgam22組與白對(duì)照組相比抗體水平差異不顯著(P>0.05)，在二免和三免后隨著免疫次數(shù)的增加，pSMART2b-Etgam22組的抗體水平與白對(duì)照組相比顯著升高(P<0.01)(圖3)。

圖3 雞血清中抗體水平變化Fig.3 The changing antibody levels in chicken serum**：差異完全顯著，P<0.01；ns：差異不顯著，P>0.05；下圖同 **：Difference was completely significant，P<0.01； ns：No significant difference，P>0.05. The same as below

ELISA試劑盒檢測(cè)雞只IFN-γ和IL-2水平變化，結(jié)果顯示，在免疫前與一免后pSMART2b-Etgam22組與白對(duì)照組相比IFN-γ和IL-2水平差異不顯著(P>0.05)，隨著免疫次數(shù)的增加，pSMART2b-Etgam22組免疫雞只的IFN-γ和IL-2水平與白對(duì)照組相比升高顯著(P<0.01)(圖4、圖5)。

圖4 雞血清中IFN-γ含量Fig. 4 The quantity of IFN-γ in chicken serum

圖5 雞血清中IL-2含量Fig. 5 The quantity of IL-2 in chicken serum

2.4 抗柔嫩艾美耳球蟲(chóng)的保護(hù)效果評(píng)價(jià) 與紅對(duì)照組相比，pSMART2b-Etgam22免疫組增重明顯(P<0.01)，卵囊排出量顯著降低，卵囊數(shù)量減少率為68.05%，盲腸病變計(jì)分降低(表1)，死亡率降低，相對(duì)增重率增高，病變值和卵囊值變低(表2)。綜合評(píng)價(jià)pSMART2b-Etgam22免疫組的抗球蟲(chóng)指數(shù)為165(表2)，顯示良好的抗柔嫩艾美耳球蟲(chóng)免疫保護(hù)效果。

表1 重組質(zhì)粒pSMART2b-Etgam22抗柔嫩艾美耳球蟲(chóng)保護(hù)效果Table 1 The protective efficacy of recombinant plasmid pSMART2b-Etgam22 against E. tenella challenge infection

表2 重組質(zhì)粒pSMART2b-Etgam22抗柔嫩艾美耳球蟲(chóng)指數(shù)(ACI)Table 2 Anticoccidial index of recombinant plasmid pSMART2b-Etgam22 after E. tenella challenge infection

3 討論

巨型艾美耳球蟲(chóng)(Eimeriamaixma)的配子體滅活抗原(主要為Emgam56、Emgam230和Emgam82)是商品化亞單位疫苗CoxAbic的主要抗原成分，該疫苗能顯著降低毒害艾美耳球蟲(chóng)、柔嫩艾美耳球蟲(chóng)和堆型艾美耳球蟲(chóng)的卵囊排出量[9]。目前雞球蟲(chóng)配子體抗原研究較少，只有少數(shù)幾種被發(fā)現(xiàn)并用于疫苗研究，如柔嫩艾美耳球蟲(chóng)Etgam56、Etgam59和Etgam22，毒害艾美耳球蟲(chóng)Engam22，堆型艾美爾球蟲(chóng)Eagam56，巨型艾美耳球蟲(chóng)Emgam56、Emgam82和Emgam230。這些抗原在這3種艾美耳球蟲(chóng)中同源且有許多共同點(diǎn)，都具有較好的免疫保護(hù)原性[10]。張艷[11]選用巨型艾美耳球蟲(chóng)Emgam56基因制備DNA疫苗pcDNA-Emgam56，該疫苗能使感染雞只體重相對(duì)增重89.7%，卵囊排出量減少53.7%，說(shuō)明Emgam56具有較好的免疫原性，可對(duì)免疫雞只提供較好的免疫保護(hù)效果。劉悅等[12]發(fā)現(xiàn)柔嫩艾美耳球蟲(chóng)配子體Etgam56具有較好的抗原性和交叉性，可分別被柔嫩艾美耳球蟲(chóng)雞康復(fù)血清和毒害艾美耳球蟲(chóng)雞康復(fù)血清識(shí)別。Stefanie等[13]發(fā)現(xiàn)鼠源Etgam56單克隆抗體腹腔接種感染柔嫩艾美耳球蟲(chóng)的雞只后，可使卵囊減少率為78%，對(duì)該抗體識(shí)別的抗原決定部位(Etgam56的N端部分)進(jìn)行原核表達(dá)，制備的重組蛋白疫苗不能為雞只提供有效的免疫保護(hù)，這可能與抗原的構(gòu)象有關(guān)。朱玉蘭[14]對(duì)柔嫩艾美耳球蟲(chóng)Etgam59進(jìn)行原核表達(dá)，制備重組蛋白疫苗進(jìn)行保護(hù)性研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)免疫組卵囊減少率為58.9%，該疫苗具有一定保護(hù)效果。堆型艾美耳球蟲(chóng)重組蛋白rEagam56和rEagam82及兩者的聯(lián)合免疫均能給雞只提供一定免疫保護(hù)，疫苗組的ACI分別為148.24、143.92和148.74。

與gam56和gam82相似，gam22參與形成毒害艾美耳球蟲(chóng)和柔嫩艾美耳球蟲(chóng)等球蟲(chóng)的卵囊壁，具有成為免疫保護(hù)性抗原的潛力[15-16]。曹李琴[6]用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)柔嫩艾美耳球蟲(chóng)配子體Etgam22蛋白，制備疫苗后進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)，柔嫩艾美耳球蟲(chóng)的卵囊減少率為23.83%。Rafiqi等[5]同樣利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)柔嫩艾美耳球蟲(chóng)Etgam22蛋白，以Montanide ISA 71 VG為佐劑制備重組蛋白疫苗，動(dòng)物試驗(yàn)表明該疫苗可使每克糞便卵囊數(shù)減少68.5%，總卵囊減少率為45.23%。用毒害艾美耳球蟲(chóng)重組配子體蛋白rEngam22與rEngam59聯(lián)合免疫雞只，發(fā)現(xiàn)免疫后的感染雞只相對(duì)增重率為97.02%，卵囊減少率為41.93%[17]。本試驗(yàn)采用的pSMART2b是基于塞姆利基森林病毒(Semliki forest virus,SFV)改造的DNA載體，具有高效率的真核表達(dá)調(diào)控元件等，如啟動(dòng)子人巨噬細(xì)胞病毒(Cytomegalovirus，CMV)[18]。鄧瑤等[19]比較了與傳統(tǒng) DNA 疫苗載體pcDNA3.1在轉(zhuǎn)染和蛋白表達(dá)效率方面的不同，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在同等劑量以及同等情況下轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，基于甲病毒衍生的載體表達(dá)量是 pcDNA3.1 載體的3倍左右，這表明了基于甲病毒衍生的復(fù)制型載體在基因工程苗應(yīng)用方面的優(yōu)勢(shì)。目前甲病毒復(fù)制子載體在寄生蟲(chóng) DNA疫苗方面的應(yīng)用還較少。朱剛[20]選擇甲病毒復(fù)制子載體和弓形蟲(chóng)表面膜蛋白 SAG3構(gòu)建重組質(zhì)粒pSMART2b-SAG3，分3次免疫小鼠并做攻蟲(chóng)試驗(yàn)。結(jié)果證明pSMART2b-SAG3可使免疫組小鼠存活率升高，對(duì)照組小鼠全部死亡，說(shuō)明重組質(zhì)粒對(duì)小鼠抗弓形蟲(chóng)感染可以產(chǎn)生一定的保護(hù)力。在雞球蟲(chóng)疫苗方面，祝濤[21]構(gòu)建了重組質(zhì)粒 pSMART2b-Rhomboid3并制備疫苗免疫雛雞，該疫苗的ACI 達(dá)到 184.22。本試驗(yàn)利用甲病毒表達(dá)系統(tǒng)來(lái)表達(dá)抗原基因Etgam22，結(jié)果顯示將pSMART2b-Etgam22免疫雛雞后可成功誘導(dǎo)雞體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，動(dòng)物試驗(yàn)表明柔嫩艾美耳球蟲(chóng)卵囊排出量減少，減少率為68.05%，其抗球蟲(chóng)指數(shù)為165，具有一定抗球蟲(chóng)保護(hù)效果。提示該表達(dá)系統(tǒng)在雞球蟲(chóng)疫苗研制中具有較好的應(yīng)用潛力,在后續(xù)的工作中需要對(duì)免疫劑量、使用佐劑和免疫程序等方面進(jìn)行優(yōu)化，為進(jìn)一步制備雞球蟲(chóng)疫苗提供了科學(xué)依據(jù)。