鯽魚源維氏氣單胞菌噬菌體的分離及生物學(xué)特性

戴瑜來,戴楊鑫,許寶青,林啟存,馬恒甲,蔡麗娟

(杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院,浙江 杭州 310024)

維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)是一種人—獸—魚共患的條件致病菌[1]，該菌可感染草魚[2]、鯽[3]、泥鰍[4]、青蝦[5]、中華絨螯蟹[6]、中華條頸龜[7]、達(dá)氏鱘[8]、虹鱒[9]、大黃魚[10]等多種水生動(dòng)物，引發(fā)的疾病發(fā)病快、死亡率高，對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失。研究人員發(fā)現(xiàn)，維氏氣單胞菌對β-內(nèi)酰胺類(氨芐西林鈉、苯唑西林)、大環(huán)內(nèi)酯類(硫氰酸紅霉素、乙酰螺旋霉素)、喹諾酮類(恩諾沙星)、氨基糖苷類(硫酸新霉素、卡那霉素)、四環(huán)素類(四環(huán)素、強(qiáng)力霉素)、磺胺類(磺胺嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺甲噁唑)、氯霉素類(甲砜霉素、氟苯尼考)等抗菌藥均產(chǎn)生了一定的耐藥性[11-15]，且極可能會(huì)隨著抗菌藥的繼續(xù)濫用而在水生動(dòng)物臨床上更加快速且廣泛地傳播。同時(shí)，抗菌藥的廣譜性會(huì)破壞水體環(huán)境及養(yǎng)殖動(dòng)物腸道中正常微生物群系的平衡，影響?zhàn)B殖魚類的生長發(fā)育，進(jìn)而造成水產(chǎn)養(yǎng)殖效率低下。因此，尋找安全、高效、環(huán)保的生物抑菌劑具有重要意義。噬菌體(Baceriophage)是一類能夠感染細(xì)菌、真菌、放線菌或螺旋菌等微生物的病毒總稱，它具有裂解宿主專一性強(qiáng)、研發(fā)時(shí)間短，不影響正常菌群，對人和動(dòng)物安全，耐藥風(fēng)險(xiǎn)低且無環(huán)境污染等優(yōu)點(diǎn)，其在細(xì)菌病防控領(lǐng)域的應(yīng)用研究呈逐年上升趨勢[16]。目前，已報(bào)道用于水生動(dòng)物細(xì)菌病防控的噬菌體研究數(shù)量有限，為了豐富水產(chǎn)致病菌的噬菌體庫，篩選具有潛在應(yīng)用價(jià)值的菌株，本試驗(yàn)以維氏氣單胞菌為宿主菌，分離篩選烈性噬菌體，研究其生物學(xué)特性，旨在為進(jìn)一步探索噬菌體防控技術(shù)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株 維氏氣單胞菌(XJJYCA01)分離自發(fā)病鯽魚，LB斜面保存于4 ℃。

1.2 試劑與儀器 試劑耗材：LB培養(yǎng)基、SM液、接種環(huán)、5 mL注射器、0.22 μm過濾頭、一次性培養(yǎng)皿等，均購自生工生物工程(上海)股份有限公司。儀器：UV-2600紫外分光光度計(jì)、離心機(jī)(Eppendorf Centrifuge 5427R和Hermle Z323K)、HS-2恒溫水浴鍋、Hitachi H-7650型電子顯微鏡、JJ-Y系列電子天平、生化培養(yǎng)箱等。

1.3 噬菌體分離與純化 參照王志麗[17]的雙層平板法進(jìn)行維氏氣單胞菌的富集、篩選、純化，略作修改。步驟如下：(1)無菌操作解剖，取發(fā)病鯽魚腸道置于滅菌培養(yǎng)皿中，用生理鹽水洗脫腸道內(nèi)容物，4 000 r/min離心10 min后過0.22 μm濾頭備用；(2)挑取維氏氣單胞菌(XJJYCA01)單菌落接種到含有5 mL LB液體培養(yǎng)基的試管中，28 ℃ 120 r/min搖床上過夜培養(yǎng)；翌日，將其轉(zhuǎn)到含25～30 mL液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，28 ℃ 120 r/min震蕩培養(yǎng)3 h，使其達(dá)到對數(shù)期(OD值0.4～0.6)，然后向菌液中加入5 mL病魚腸道洗脫液，再28 ℃振蕩培養(yǎng)48 h。之后將混合液以12 000 r/min離心10 min，小心吸取上清轉(zhuǎn)移至另一無菌螺旋離心管后備用；(3)取100 μL分離液與200 μL對數(shù)期的宿主菌混合，放置5～15 min后加到融化并冷卻至45 ℃的半固體培養(yǎng)基中，混勻立即倒入底層瓊脂平板上，鋪勻，28 ℃ 倒置培養(yǎng)24 h。翌日觀察噬菌斑的生成情況；(4)用滅菌牙簽挑取單個(gè)噬菌斑，接到5 mL液體培養(yǎng)基中富集10 min，然后向其中加入200 μL宿主菌菌液，28 ℃培養(yǎng)2～3 h至液體澄清后，12 000 r/min離心取上清，即得到高效價(jià)的噬菌體。

1.4 噬菌體效價(jià)的測定 采用噬斑法測定噬菌體效價(jià)。吸取100 μL純化的噬菌體液進(jìn)行10倍稀釋，將稀釋的噬菌體液分別與200 μL的XJJYCA01混合，利用雙層平板法觀察噬菌斑的個(gè)數(shù)。效價(jià)(PFU/mL)=噬菌斑數(shù)×10×稀釋倍數(shù)。

1.5 噬菌體的電鏡觀察 參照Ramíre-orozco等[18]的方法，采用磷鎢酸負(fù)染法，用Hitachi H-7650型電子顯微鏡進(jìn)行電鏡觀察。

1.6 噬菌體最適感染復(fù)數(shù)(MOI)測定 培養(yǎng)XJJYCA01至對數(shù)生長期(OD600≈0.5，約為1×108CFU/mL)，按照不同的感染復(fù)數(shù)(1 000，100，10，1，0.1，0.01，0.001)各取0.2 mL混合，并加入1.6 mL的LB液體培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)4 h。經(jīng)培養(yǎng)后，9 000 r/min離心10 min，0.22 μm過濾。收集上清，測定噬菌體效價(jià)，以產(chǎn)生最高噬菌體效價(jià)的MOI為最佳感染復(fù)數(shù)。

1.7 一步生長曲線 參照柏琴琴[19]并略作修改。具體操作如下：將XJJYCA01培養(yǎng)至對數(shù)生長期。將噬菌體SJTJYCA01效價(jià)濃度稀釋到1×108PFU/mL。1 mL噬菌體稀釋液和10 mL宿主菌細(xì)菌懸液混合于錐形瓶P1中，混合10 min后，取0.1 mL加入到含有10 mL LB培養(yǎng)液的錐形瓶P2中，混合均勻，再從錐形瓶B2中取0.2 mL至含有20 mL液體培養(yǎng)基的P3中，混合均勻后在28 ℃及180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)。從0開始每隔一段時(shí)間取樣。所取樣品經(jīng)9 000 r/min離心2 min，取上清液用雙層平板法測定過濾液中噬菌體的效價(jià)。以取樣時(shí)間為橫坐標(biāo)，噬菌體效價(jià)的對數(shù)值為縱坐標(biāo)，繪制一步生長曲線。裂解量=裂解期平均噬菌體數(shù)/潛伏期平均噬菌體數(shù)。

1.8 熱穩(wěn)定性及pH穩(wěn)定性 將噬菌體SJTJYCA01裂解液稀釋至1×1010PFU/mL，分裝到3個(gè)5 mL 離心管中，每管各裝3 mL。將離心管分別放置于40 ℃、60 ℃、80 ℃的恒溫水浴鍋中，每隔20 min測定各管中噬菌體的效價(jià)，直至測到60 min。以SM液為介質(zhì)，用NaOH和HCl調(diào)節(jié)pH(3～11)。將噬菌體SJTJYCA01裂解液稀釋至1×1010PFU/mL，取10 μL加入到990 μL不同pH的SM液中，28 ℃水浴2 h后測定各離心管中噬菌體的滴度。每個(gè)pH試驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 噬菌體分離與純化 從發(fā)病鯽魚腸道中獲得的分離液經(jīng)雙平板法后在平板上可見有大量噬菌斑產(chǎn)生，圖1A可見噬菌斑呈圓形，中間透明，邊緣清晰整齊，無暈環(huán)，但大小不一，分布不均勻，直徑在0.2～1.1 mm，噬菌斑的存在說明腸道分離液中有宿主菌的噬菌體存在。噬菌體經(jīng)純化增殖后，梯度稀釋，用雙層平板法計(jì)數(shù)，該噬菌體的效價(jià)可達(dá)3.0×1012PFU/mL，噬菌體命名為SJTJYCA01。

圖1 噬菌體的噬菌斑(A)和超微形態(tài)圖(B)Fig.1 Plaque morphology (A) and TEM image (B) of phage

2.2 噬菌體的超顯微形態(tài) 通過電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，本試驗(yàn)分離的噬菌體為有尾噬菌體，屬于尾病毒目短尾噬菌體科，頭部直徑在45～60 nm，尾部長在16～26 nm，見圖1B。

2.3 最適感染復(fù)數(shù) 噬菌體SJTJYCA01和宿主菌XJJYCA01的MOI為0.1時(shí)的效價(jià)最高(效價(jià)值達(dá)2.55×109)，說明噬菌體SJTJYCA01和宿主菌XJJYCA01的最適感染復(fù)數(shù)為0.1。見表1。

表1 噬菌體SJTJYCA01的最適感染復(fù)數(shù)Table 1 Determination of optimal MOI of SJTJYCA01

2.4 一步生長曲線 一步生長曲線的結(jié)果見圖2，噬菌體SJTJYCA01的潛伏期為20 min，裂解期達(dá)40 min，裂解量為裂解期平均噬菌體數(shù)(14 458 PFU/mL)/ 潛伏期平均噬菌體數(shù)(255 PFU/mL)=57。

2.5 熱穩(wěn)定性 在40 ℃條件下，噬菌體SJTJYCA01的存活率不隨時(shí)間的增加而減少；在60 ℃條件下，噬菌體SJTJYCA01的存活率大幅下降，作用20 min后存活率僅為原噬菌體的3%；在80 ℃條件下，各個(gè)時(shí)間段均未見有噬菌體存活。見圖3。

圖2 噬菌體的一步生長曲線Fig.2 One-step growth curve of phage

圖3 噬菌體SJTJYCA01的熱穩(wěn)定性Fig.3 Thermal stability of SJTJYCA01

2.6 pH穩(wěn)定性 噬菌體SJTJYCA01對強(qiáng)酸強(qiáng)堿均較為敏感，在pH 5～10時(shí)較為穩(wěn)定；噬菌體SJTJYCA01的最適pH 7。見圖4。

圖4 噬菌體SJTJYCA01的pH穩(wěn)定性Fig.4 pH stability of SJTJYCA01

3 討論

近年來，國內(nèi)外有關(guān)維氏氣單胞菌病例的報(bào)道逐年增多，其流行呈明顯上升趨勢，并已成為一種危害嚴(yán)重的人—獸—魚共患病原菌[20]。噬菌體作為一種新興的生物抑菌劑日漸受到學(xué)者們的關(guān)注[21]。目前，國內(nèi)外關(guān)于維氏氣單胞菌噬菌體的研究鮮有報(bào)道，僅可見Taruna等[22]從池水中分離到維氏氣單胞菌的噬菌體VTCCBPA5和呂孫建等[23-24]從中華鱉養(yǎng)殖塘中分離得到的非特異性寬譜噬菌體NTHP01(以嗜水氣單胞菌為宿主分離獲得)。

本試驗(yàn)以鯽魚源維氏氣單胞菌為宿主菌，從發(fā)病鯽魚的腸道中分離獲得噬菌體SJTJYCA01。該噬菌體在宿主菌上可形成圓形、透亮，具有典型烈性噬菌體特征的噬菌斑[25]；參照《病毒分類——國際病毒分類委員會(huì)第九次報(bào)告》，對噬菌體SJTJYCA01的形態(tài)進(jìn)行觀察分析，結(jié)果可判定該噬菌體為尾病毒目短尾噬菌體科噬菌體(頭徑45～60 nm，尾長16～26 nm)，此與Taruna等[22]分離獲得的VTCCBPA5同屬于短尾噬菌體科(頭徑56 nm，尾長5 nm)，卻有別于呂孫建等[24]分離獲得的肌尾噬菌體科噬菌體NTHP01(頭徑60～145 nm，尾長80～455 nm)。因此，這是鯽魚源維氏氣單胞菌短尾科烈性噬菌體在中國的首次報(bào)道。

感染復(fù)數(shù)是研究噬菌體與宿主之間量化與產(chǎn)出的重要生物學(xué)指標(biāo)，在不同感染復(fù)數(shù)條件下，噬菌體感染宿主菌后分裂得到的噬菌體子代的數(shù)量不同，因此，確定最適感染復(fù)數(shù)對于噬菌體進(jìn)一步的應(yīng)用研究具有重要作用。本試驗(yàn)獲得噬菌體SJTJYCA01的最適感染復(fù)數(shù)為0.1，與王志麗[17]分離的鱉源氣單胞菌噬菌體的最適感染復(fù)數(shù)相同，說明該噬菌體裂解效率較高，少量的噬菌體侵染宿主菌即可產(chǎn)生噬菌體子代；噬菌體感染宿主菌的潛伏期和裂解期的長短及裂解量的大小通常與噬菌體、宿主菌及生長條件有關(guān)，從潛伏期可得知噬菌體吸附于細(xì)胞并釋放出子代噬菌體的最短時(shí)間，潛伏期和裂解量則是噬菌體增殖的2個(gè)特征性指標(biāo)。噬菌體SJTJYCA01潛伏期和裂解期分別為20 min、40 min， 較噬菌體VTCCBPA5(潛伏期35 min)[22]、泥鰍源氣單胞菌的噬菌體pAh1(潛伏期30 min)[26]和鱉源氣單胞菌的噬菌體(潛伏期50 min)[17]要短，遠(yuǎn)小于噬菌體NTHP01(潛伏期150 min)[23]，且同樣對宿主菌具有較高的裂解量。

目前，氣單胞菌屬細(xì)菌(包括維氏氣單胞菌)能造成多種水生動(dòng)物發(fā)生運(yùn)動(dòng)性氣單胞菌敗血癥[27]，該病在浙江、湖南、湖北、江西等地的發(fā)病高峰期為每年的6～9月(養(yǎng)殖水溫在20～30 ℃，pH一般呈弱堿或弱酸性)，常常出現(xiàn)急性暴發(fā)病，嚴(yán)重時(shí)的死亡率可達(dá)90%以上。本試驗(yàn)分離獲得的噬菌體SJTJYCA01在溫度低于40 ℃時(shí)能保持較好的穩(wěn)定性和活性，并在pH 7附近最為穩(wěn)定。因此，噬菌體SJTJYCA01能很好的適應(yīng)水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境，在水生動(dòng)物細(xì)菌性疾病防控中應(yīng)用具有極大的可能性。本試驗(yàn)篩選獲得的維氏氣單胞菌烈性噬菌體，不僅豐富了水產(chǎn)致病菌噬菌體的菌種資源，并將為噬菌體作為生物抑菌劑的開發(fā)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。