基于NOS 通路探討DAHP 對(duì)腦外傷大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用

倪禮禮,姚 佳,汪學(xué)猛,杜 煜

(1.洛陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與藥品學(xué)院,河南 洛陽 471900;2.信陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)院,河南 信陽 464000)

腦外傷屬于臨床常見顱腦損傷類型之一,通常會(huì)造成患者行為、精神、記憶學(xué)習(xí)等方面功能障礙,具有較高的致死率和致殘率,嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[1]。 腦外傷機(jī)制較復(fù)雜,主要涉及神經(jīng)損傷、腦水腫、血腦屏障等,目前尚未有統(tǒng)一定論。 一氧化氮(nitric oxide,NO)屬于神經(jīng)介質(zhì),正常狀態(tài)下少量NO 可調(diào)節(jié)血流、擴(kuò)張血管,而過量的NO 則會(huì)對(duì)神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生毒性[2]。 研究發(fā)現(xiàn)腦損傷后可激活一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)生成大量的NO,進(jìn)而加重神經(jīng)損傷[3]。 2,4-二胺-6-羥基嘧啶(2,4-diamino-6-hydroxypyrimidine,DAHP)為三磷酸鳥苷環(huán)化水解酶 1 ( guanosine triphosphate cyclohydrolase 1,GCH1)抑制劑,可通過抑制GCH1的合成進(jìn)而降低誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)的表達(dá),影響NO 的合成,然而其在腦損傷中的作用研究不多[4]。 本研究通過復(fù)制腦外傷模型大鼠,并給予DAHP 干預(yù),旨在探究其對(duì)腦外傷大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用及可能的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

70 只SPF 級(jí)SD 健康大鼠,雄性,8 周齡,體重(200±20)g,由河南環(huán)宇康禾生物科技有限公司提供[SCXK(豫)2020-0004],動(dòng)物飼養(yǎng)在洛陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與藥品學(xué)院實(shí)驗(yàn)室[SYXK(豫)2020-0027],濕度(40±10)%,溫度(22±3)℃,采用晝夜交替12 h 光照,期間大鼠自由飲食、飲水,一周后用于造模,實(shí)驗(yàn)遵循3R 原則。 本研究經(jīng)洛陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(LDS2020024)。

1.2 主要試劑與儀器

DAHP(購自美國Cayman 公司,批號(hào):81260-1);四氫生物蝶呤(tetrahydrobiopterin,BH4)(購自美國MCE 公司,批號(hào):HY-107383);蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(購自碧云天生物技術(shù)有限公司,批號(hào):C0105);Tunel 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(購自美國ROCHE 公司,批號(hào):11684817910);NO 檢測(cè)試劑盒(購自美國Solarbio 公司,批號(hào):BC147);BCA 蛋白檢測(cè)試劑盒(購自美國Thermo Scientific 公司,批號(hào):23225);兔抗鼠神經(jīng)型一氧化氮合酶(nNOS)、iNOS、β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)一抗(購自美國Sigma公司,批號(hào):SAB4502010、SAB4502012、A5441);兔抗鼠核因子-κB(NF-κB)、腫瘤壞死因子-α(TNFα)、環(huán)氧化酶-2(COX-2)一抗(購自美國R&D 公司,批號(hào):MAB5078、AF-425-PB、AF4198);兔抗鼠半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、B 淋巴細(xì)胞瘤-2 基因(Bcl-2)一抗、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記二抗(購自英國Abcam 公司,批號(hào):ab179517、ab185002、ab10032);光學(xué)顯微鏡(購自日本奧林巴斯公司,型號(hào):IX51);熒光顯微鏡(購自舜宇光學(xué)科技集團(tuán)有限公司,型號(hào):CX40);酶標(biāo)儀(購自美國BioTek 公司,型號(hào):Synergy NEO2);凝膠成像儀(購自德國Royal 公司,型號(hào):Gel IX Imager)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 模型制備

隨機(jī)挑選58 只大鼠進(jìn)行造模,另選取12 只大鼠作為假手術(shù)組,參照改良Feeney 法制備腦挫傷大鼠[5],自制打擊器,將打擊器在大鼠腦表面上方垂直固定,將打擊器沿著金屬套管自30 cm 高度垂直落下打擊大鼠頭部,造成右側(cè)腦半球腦挫裂傷。 造模后2 h,待大鼠清醒后根據(jù)Longa 等[6]神經(jīng)功能缺損評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)對(duì)大鼠神經(jīng)功能進(jìn)行評(píng)定,將評(píng)分2~3 分大鼠納入模型,剔除操作不當(dāng)、未成功大鼠,造模成功大鼠48 只。 假手術(shù)組僅打開骨窗不采取打擊器打擊。

1.3.2 動(dòng)物分組與給藥

將造模成功大鼠隨機(jī)分為模型組、DAHP 組、NOS 激活劑組(BH4 組)、DAHP+BH4 組,每組12只。 DAHP 組:造模后2 h 尾靜脈注射0.5 g/kg 的DAHP[7];BH4 組:造模后2 h 尾靜脈注射0.3 mg/kg 的BH4[8],DAHP+BH4 組:造模后2 h 尾靜脈注射0.5 g/kg 的DAHP 與0.3 mg/kg 的BH4;假手術(shù)組、模型組均注射等量生理鹽水;注射體積均為10 mL/kg,各組每天給藥1 次,連續(xù)處理1 周。

1.3.3 定位航行、空間探索實(shí)驗(yàn)評(píng)估大鼠行為學(xué)

末次處理后,評(píng)估大鼠行為學(xué)。 將水池4 象限中點(diǎn)作為入水點(diǎn),將大鼠從隨意象限放入水池面對(duì)池壁,記錄大鼠尋找逃避平臺(tái)的時(shí)間,為逃避潛伏期。 撤去逃避平臺(tái),將大鼠從原平臺(tái)對(duì)側(cè)放入水池中,連續(xù)記錄游泳120 s 內(nèi)在各象限所用時(shí)間,計(jì)算原平臺(tái)象限游泳時(shí)間與逃避潛伏期比例,即為空間探索時(shí)間比例。

1.3.4 HE 染色觀察大鼠腦組織形態(tài)學(xué)變化

行為學(xué)評(píng)估結(jié)束后,將大鼠處死,獲取全腦組織,在4%多聚甲醛中過夜固定后,取損傷區(qū),制備腦組織石蠟切片,厚度為3 μm,參考HE 染色試劑盒對(duì)切片進(jìn)行染色,經(jīng)乙醇脫水、二甲苯透明、樹膠封片后,在光學(xué)顯微鏡下觀察腦組織形態(tài)學(xué)變化。

1.3.5 Tunel 染色觀察腦組織細(xì)胞凋亡

制備腦組織冰凍切片,添加蛋白酶K 溶液室溫下孵育10 min,清洗后,添加TdT 緩沖液孵育20 min,避光添加Tunel 工作液孵育1 h,清洗后封片,置于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞染色情況。 用Image-Pro 軟件定量分析腦組織細(xì)胞凋亡率=綠色熒光細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.3.6 腦組織中NO 水平的測(cè)定

將腦組織剪切為碎塊后,添加9 倍體積生理鹽水,置于勻漿器內(nèi)勻漿,采用Griess 法檢測(cè)腦組織NO 水平。

1.3.7 免疫印跡法檢測(cè)腦組織中蛋白表達(dá)

TRIzol 法提取腦組織總蛋白,BCA 法檢測(cè)蛋白含量,統(tǒng)一定量30 μg 進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳,將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上,經(jīng)5%脫脂奶粉封閉后加入nNOS、iNOS、NF-κB、TNF-α、COX-2、 Caspase-3、 Bcl-2、 β-actin 一 抗(均 為1 ∶1000),4℃過夜孵育后,用HRP 標(biāo)記二抗(1 ∶5000)37℃孵育膜2 h,添加ECL 顯色液曝光后,用凝膠成像系統(tǒng)采集圖像,以β-actin 作為內(nèi)參,定量評(píng)估各蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析,進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn),P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠行為學(xué)比較

與假手術(shù)組相比,模型組逃避潛伏期延長(zhǎng),空間探索時(shí)間比例降低(P<0.05);與模型組相比,DAHP 組逃避潛伏期縮短,空間探索時(shí)間比例升高,BH4 組逃避潛伏期延長(zhǎng),空間探索時(shí)間比例降低(P<0.05);DAHP+BH4 組逃避潛伏期短于BH4 組,空間探索時(shí)間比例高于BH4 組(P<0.05)。 見表1。

表1 各組大鼠逃避潛伏期、空間探索時(shí)間比例比較(±s,n=12)Table 1 Comparison of escape latency and proportion of space exploration time of rats in each group

表1 各組大鼠逃避潛伏期、空間探索時(shí)間比例比較(±s,n=12)Table 1 Comparison of escape latency and proportion of space exploration time of rats in each group

注:與假手術(shù)組相比,aP<0.05;與模型組相比,bP<0.05;與DAHP 組相比,cP<0.05;與BH4 組相比,dP<0.05。Note. Compared with sham operation group, aP<0.05. Compared with model group, bP < 0.05. Compared with DAHP group, cP < 0.05.Compared with BH4 group, dP<0.05.

組別Groups逃避潛伏期(s)Escape latency空間探索時(shí)間比例(%)Proportion of space exploration time假手術(shù)組Sham operation group 37.47±4.64 58.65±4.51模型組Model group 61.64±8.75a 37.18±3.46a DAHP 組DAHP group 45.24±4.68ab 44.89±3.42ab BH4 組BH4 group 72.16±7.43abc 29.87±3.41abc DAHP+BH4 組DAHP+BH4 group 62.58±8.13acd 36.11±4.38acd

2.2 DAHP 對(duì)大鼠腦組織形態(tài)學(xué)的影響

假手術(shù)組腦組織神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)正常,排列有序,細(xì)胞核著色均勻;模型組神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生腫脹、變形、細(xì)胞核固縮,著色加深,壞死細(xì)胞增多,伴有炎性細(xì)胞浸潤;與模型組相比,DAHP 組神經(jīng)細(xì)胞組織形態(tài)得到一定緩解,壞死細(xì)胞減少,炎性浸潤程度減輕,BH4 組壞死神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量增多,細(xì)胞核固縮,染色變深,損傷程度加重,DAHP+BH4 組細(xì)胞形態(tài)變化不顯著。 見圖1。

圖1 HE 染色檢測(cè)腦組織形態(tài)學(xué)變化Note. A, Sham operation group. B, Model group. C, DAHP group. D, BH4 group. E, DAHP+BH4 group.Figure 1 HE staining was used to detect the morphological changes of brain tissue

2.3 DAHP 對(duì)大鼠腦組織細(xì)胞凋亡的影響

與假手術(shù)組相比,模型組大鼠腦組織細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05);與模型組相比,DAHP 組大鼠腦組織細(xì)胞凋亡率降低,BH4 組大鼠腦組織細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05);DAHP+BH4 組大鼠腦組織細(xì)胞凋亡率低于BH4 組(P<0.05)。 見圖2 和表2。

圖2 Tunel 染色檢測(cè)腦組織細(xì)胞凋亡情況Note. A, Sham operation group. B, Model group. C, DAHP group. D, BH4 group. E, DAHP+BH4 group.Figure 2 Tunel staining was used to detect apoptosis in brain tissue

表2 各組大鼠腦組織細(xì)胞凋亡率比較(±s,n=12)Table 2 Comparison of apoptosis rate of brain tissue in each group

表2 各組大鼠腦組織細(xì)胞凋亡率比較(±s,n=12)Table 2 Comparison of apoptosis rate of brain tissue in each group

注:與假手術(shù)組相比,aP<0.05;與模型組相比,bP<0.05;與DAHP 組相比,cP<0.05;與BH4 組相比,dP<0.05。Note. Compared with sham operation group, aP<0.05. Compared with model group, bP < 0.05. Compared with DAHP group, cP < 0.05.Compared with BH4 group, dP<0.05.

組別Groups 凋亡率(%)Apoptosis rate假手術(shù)組Sham operation group 0模型組Model group 38.19±4.36a DAHP 組DAHP group 27.87±3.64ab BH4 組BH4 group 47.64±4.97abc DAHP+BH4 組DAHP+BH4 group 38.73±4.13acd

2.4 DAHP 對(duì)大鼠腦組織NOS 通路的影響

與假手術(shù)組相比,模型組大鼠腦組織nNOS、iNOS 蛋白表達(dá)、NO 水平升高(P<0.05);與模型組相比,DAHP 組大鼠腦組織nNOS、iNOS 蛋白表達(dá)、NO 水平降低,BH4 組大鼠腦組織nNOS、iNOS 蛋白表達(dá)、NO 水平升高(P<0.05);DAHP+BH4 組大鼠腦組織nNOS、iNOS 蛋白表達(dá)、NO 水平低于BH4 組(P<0.05)。 見圖3 和表3。

圖3 免疫印跡法檢測(cè)大鼠腦組織中nNOS、iNOS 蛋白表達(dá)Note. A, Sham operation group. B, Model group. C,DAHP group. D, BH4 group. E, DAHP+BH4 group.Figure 3 Western blot was used to detect the protein expression of nNOS and iNOS in rat brain

表3 各組大鼠腦組織中nNOS、iNOS、NO 水平比較(±s,n=12)Table 3 Comparison of nNOS, iNOS and NO levels in brain tissue of rats in each group

表3 各組大鼠腦組織中nNOS、iNOS、NO 水平比較(±s,n=12)Table 3 Comparison of nNOS, iNOS and NO levels in brain tissue of rats in each group

注:與假手術(shù)組相比,aP<0.05;與模型組相比,bP<0.05;與DAHP 組相比,cP<0.05;與BH4 組相比,dP<0.05。Note. Compared with sham operation group, aP<0.05. Compared with model group, bP<0.05. Compared with DAHP group, cP<0.05. Compared with BH4 group, dP<0.05.

組別Groups nNOS/β-actin iNOS/β-actin NO(μmol/L)假手術(shù)組Sham operation group 0.19±0.03 0.21±0.04 1.03±0.03模型組Model group 0.38±0.05a 0.82±0.08a 1.64±0.11a DAHP 組DAHP group 0.26±0.04ab 0.51±0.05ab 1.39±0.05ab BH4 組BH4 group 0.51±0.06abc 1.04±0.13abc 1.92±0.07abc DAHP+BH4 組DAHP+BH4 group 0.40±0.05acd 0.79±0.08acd 1.62±0.12acd

2.5 DAHP 對(duì)大鼠腦組織炎性因子NF-κB、TNFα、COX-2 的影響

與假手術(shù)組相比,模型組大鼠腦組織NF-κB、TNF-α、COX-2 蛋白表達(dá)升高(P<0.05);與模型組相比,DAHP 組大鼠腦組織NF-κB、TNF-α、COX-2 蛋白表達(dá)降低,BH4 組大鼠腦組織NF-κB、TNF-α、COX-2 蛋白表達(dá)升高(P<0.05);DAHP+BH4 組大鼠腦組織NF-κB、TNF-α、COX-2 蛋白表達(dá)低于BH4組(P<0.05)。 見圖4 和表4。

圖4 免疫印跡法檢測(cè)腦組織中NF-κB、TNF-α、COX-2 蛋白表達(dá)Note. A, Sham operation group. B, Model group. C,DAHP group. D, BH4 group. E, DAHP+BH4 group.Figure 4 Western blot was used to detect the protein expression of NF-κB, TNF-α and COX-2 in brain tissue

表4 各組大鼠腦組織中NF-κB、TNF-α、COX-2 蛋白表達(dá)比較(±s,n=12)Table 4 Comparison of protein expression of NF-κB, TNF-α and COX-2 in brain tissue of rats in each group

表4 各組大鼠腦組織中NF-κB、TNF-α、COX-2 蛋白表達(dá)比較(±s,n=12)Table 4 Comparison of protein expression of NF-κB, TNF-α and COX-2 in brain tissue of rats in each group

注:與假手術(shù)組相比,aP<0.05;與模型組相比,bP<0.05;與DAHP 組相比,cP<0.05;與BH4 組相比,dP<0.05。Note. Compared with sham operation group, aP<0.05. Compared with model group, bP<0.05. Compared with DAHP group, cP<0.05. Compared with BH4 group, dP<0.05.

組別Groups NF-κB/β-actin TNF-α/β-actin COX-2/β-actin假手術(shù)組Sham operation group 0.16±0.03 0.15±0.03 0.16±0.03模型組Model group 0.95±0.09a 0.61±0.07a 0.66±0.09a DAHP 組DAHP group 0.33±0.04ab 0.28±0.05ab 0.43±0.08ab BH4 組BH4 group 1.14±0.11abc 0.89±0.12abc 0.87±0.07abc DAHP+BH4 組DAHP+BH4 group 0.97±0.07acd 0.63±0.09acd 0.68±0.06acd

2.6 DAHP 對(duì)大鼠腦組織凋亡蛋白表達(dá)的影響

與假手術(shù)組相比,模型組大鼠腦組織Caspase-3蛋白表達(dá)升高,Bcl-2 蛋白表達(dá)降低(P<0.05);與模型組相比,DAHP 組大鼠腦組織Caspase-3 蛋白表達(dá)降低,Bcl-2 蛋白表達(dá)升高,BH4 組大鼠腦組織Caspase-3 蛋白表達(dá)升高,Bcl-2 蛋白表達(dá)降低(P<0.05);DAHP+BH4 組大鼠腦組織Caspase-3 蛋白表達(dá)低于BH4 組,Bcl-2 蛋白表達(dá)高于BH4 組(P<0.05)。 見圖5 和表5。

圖5 免疫印跡法檢測(cè)大鼠腦組織中凋亡蛋白表達(dá)情況Note. A, Sham operation group. B, Model group. C,DAHP group. D, BH4 group. E, DAHP+BH4 group.Figure 5 Western blot was used to detect the expression of apoptotic protein in rat brain

表5 各組大鼠腦組織中Caspase-3、Bcl-2 蛋白表達(dá)比較(±s,n=12)Table 5 Comparison of Caspase-3 and Bcl-2 protein expression in brain tissue of rats in each group

表5 各組大鼠腦組織中Caspase-3、Bcl-2 蛋白表達(dá)比較(±s,n=12)Table 5 Comparison of Caspase-3 and Bcl-2 protein expression in brain tissue of rats in each group

注:與假手術(shù)組相比,aP<0.05;與模型組相比,bP<0.05;與DAHP 組相比,cP<0.05;與BH4 組相比,dP<0.05。Note. Compared with sham operation group, aP<0.05. Compared with model group, bP < 0.05. Compared with DAHP group, cP < 0.05.Compared with BH4 group, dP<0.05.

組別Groups Caspase-3/β-actin Bcl-2/β-actin假手術(shù)組Sham operation group 0.25±0.03 1.25±0.15模型組Model group 0.63±0.08a 0.41±0.06a DAHP 組DAHP group 0.45±0.05ab 0.55±0.05ab BH4 組BH4 group 0.78±0.06abc 0.22±0.03abc DAHP+BH4 組DAHP+BH4 group 0.61±0.09acd 0.42±0.05acd

3 討論

繼發(fā)性腦損傷后短時(shí)間內(nèi),腦組織中會(huì)出現(xiàn)的大量炎性細(xì)胞浸潤,組織中炎癥反應(yīng)會(huì)進(jìn)一步加重腦損傷程度,此外腦損傷后腦組織出現(xiàn)缺血、缺氧,造成細(xì)胞代謝異常,引發(fā)組織病理損傷,加速神經(jīng)元死亡[9]。 本研究采用改良Feeney 法制備腦外傷模型大鼠,經(jīng)定位航行與空間探索實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)模型組大鼠逃避潛伏期要顯著長(zhǎng)于假手術(shù)組,而空間探索時(shí)間比例明顯低于假手術(shù)組,提示腦外傷導(dǎo)致大鼠記憶功能障礙,神經(jīng)功能受損。 HE 染色發(fā)現(xiàn),模型組大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生腫脹、變形、細(xì)胞核固縮,著色加深,壞死細(xì)胞增多,伴有炎性細(xì)胞浸潤,說明模型大鼠腦組織出現(xiàn)炎性損傷,神經(jīng)細(xì)胞受損,這與以往腦外傷模型動(dòng)物特征相似[10],提示模型大鼠腦組織受損,神經(jīng)功能發(fā)生障礙,腦外傷大鼠模型制備成功。

NOS 信號(hào)通路與腦損傷的發(fā)生密切相關(guān),其通過催化形成NO,發(fā)揮對(duì)腦組織神經(jīng)的保護(hù)或損傷作用。 機(jī)體中的NOS 主要包括內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)、iNOS 及nNOS,過往研究發(fā)現(xiàn)在腦損傷早期eNOS 表達(dá)較高,通過催化生成NO 發(fā)揮對(duì)腦組織的神經(jīng)保護(hù)作用,而在腦損傷中、后期nNOS、iNOS 大量表達(dá)則會(huì)釋放對(duì)腦神經(jīng)有害的NO[11]。Yong 等[12]研究發(fā)現(xiàn)缺血再灌注損傷大鼠腦組織中eNOS 水平降低,iNOS 水平升高,給予電針治療后,能夠顯著上調(diào)eNOS,下調(diào)iNOS 水平,緩解神經(jīng)功能缺損、神經(jīng)元凋亡。 川芎嗪類似物CXC195 通過抑制NADPH 氧化酶和iNOS 的表達(dá),發(fā)揮對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用[13]。 本研究發(fā)現(xiàn),與假手術(shù)組相比,模型組大鼠腦組織中nNOS、iNOS 蛋白表達(dá)、NO 水平升高,提示NOS 信號(hào)通路的激活與腦外傷的發(fā)生相關(guān)。

BH4 為炎性因子及神經(jīng)遞質(zhì)合成的輔助因子,而GCH1 為BH4 合成主要限速酶,二者與神經(jīng)損傷、疼痛的發(fā)生相關(guān)。 DAHP 為GCH1 抑制劑,可通過抑制GCH1 的合成進(jìn)而降低BH4 合成,研究發(fā)現(xiàn)采用DAHP 能夠抑制GCH1 的表達(dá),進(jìn)而降低iNOS的表達(dá),影響NO 的合成[14]。 近期有研究顯示DAHP 能夠通過下調(diào)iNOS 表達(dá),進(jìn)而降低腦缺血再灌注損傷大鼠梗死面積,減輕腦水腫,發(fā)揮對(duì)腦組織的保護(hù)作用[15]。 Li 等[16]研究發(fā)現(xiàn)DAHP 通過抑制凋亡和激活磷脂酰肌醇-3 激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路對(duì)發(fā)揮對(duì)局灶性腦缺血的保護(hù)作用[16]。 本研究發(fā)現(xiàn)采用BH4 處理模型大鼠后,逃避潛伏期延長(zhǎng),空間探索時(shí)間比例降低,腦組織損傷程度加重;而采用BH4 聯(lián)合DAHP 處理模型大鼠后,與BH4 組比較,大鼠逃避潛伏期縮短,空間探索時(shí)間比例升高,腦組織損傷程度有所緩解,提示DAHP 可通過抑制iNOS 信號(hào)通路的表達(dá),進(jìn)而緩解腦外傷大鼠腦組織神經(jīng)損傷。 在腦損傷后過量炎癥反映會(huì)導(dǎo)致COX-2、iNOS 表達(dá)升高,過往研究發(fā)現(xiàn)在腦損傷后24 h 內(nèi),COX-2 達(dá)到最大值,其水平與病情嚴(yán)重程度密切有關(guān)[17]。 此外腦損傷后NF-κB 表達(dá)大量升高,進(jìn)一步刺激iNOS 合成大量的NO,上調(diào)促炎癥因子TNF-α 表達(dá),加重炎癥損傷[18]。 本研究發(fā)現(xiàn)模型組大鼠腦組織中COX-2、NF-κB、TNF-α 蛋白表達(dá)明顯升高,給予BH4 后能夠進(jìn)一步升高上述炎癥因子的表達(dá),聯(lián)合DAHP 后則能抑制上述炎癥因子的表達(dá),提示DAHP 可能通過抑制NOS 表達(dá)進(jìn)而緩解對(duì)腦外傷大鼠炎癥損傷。

神經(jīng)細(xì)胞凋亡參與腦損傷的發(fā)生、發(fā)展過程,細(xì)胞凋亡數(shù)量的多少,與損傷嚴(yán)重程度密切相關(guān)[19]。 本研究通過Tunel 染色檢測(cè)發(fā)現(xiàn),模型組大鼠腦組織中神經(jīng)細(xì)胞凋亡率明顯升高,給予BH4 處理后細(xì)胞凋亡加重,聯(lián)合DAHP 處理后細(xì)胞凋亡降低,提示DAHP 可通過減輕神經(jīng)細(xì)胞凋亡,保護(hù)腦組織。 Caspase-3 是細(xì)胞死亡的最終執(zhí)行者,而Bcl-2 作為抗凋亡蛋白能夠抑制Caspase-3 激活,阻斷Bax 等凋亡蛋白的激活,研究發(fā)現(xiàn)腦損傷后24 h Caspase-3 表達(dá)達(dá)到最高峰,而Bcl-2 表達(dá)則最低[20]。 本研究發(fā)現(xiàn)模型組大鼠腦組織中Caspase-3蛋白表達(dá)升高,Bcl-2 蛋白表達(dá)降低,給予BH4 后能夠Caspase-3 蛋白表達(dá)進(jìn)一步升高,Bcl-2 蛋白表達(dá)進(jìn)一步降低,聯(lián)合DAHP 后Caspase-3 蛋白表達(dá)降低,Bcl-2 蛋白表達(dá)升高,提示DAHP 可能通過抑制凋亡蛋白激活,發(fā)揮抗凋亡作用,保護(hù)腦外傷大鼠神經(jīng)功能。

綜上所述,DAHP 能夠緩解腦外傷大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡,降低炎性損傷,緩解神經(jīng)功能障礙,其機(jī)制可能與抑制iNOS 信號(hào)通路有關(guān)。 然而本研究也存在不足,腦外傷機(jī)制較復(fù)雜,DAPH 是否還通過其他途徑發(fā)揮對(duì)腦組織神經(jīng)保護(hù)作用,尚待后續(xù)深入探究。