黃芪多糖對野百合堿誘導(dǎo)大鼠肺動脈高壓的減緩作用及其機(jī)制研究

張玉坤 何東平

摘 要 目的 研究黃芪多糖對野百合堿誘導(dǎo)大鼠肺動脈高壓的減緩作用及可能機(jī)制。方法 將100只SD雄性大鼠隨機(jī)分為正常對照組、野百合堿組、黃芪多糖低劑量組和黃芪多糖高劑量組。除正常對照組外，其余組大鼠按60 mg/kg單次腹腔注射野百合堿。黃芪多糖低劑量組及高劑量組大鼠在給藥后的第2～28天分別按200 mg/kg及400 mg/kg腹腔注射黃芪多糖，每日1次。每組25只大鼠各取15只進(jìn)行研究，檢測各組大鼠平均肺動脈壓（mPAP）、右心肥厚指數(shù)（RVHI），觀察其肺動脈及心肌細(xì)胞形態(tài)變化，檢測其肺組織中白細(xì)胞介素17（IL-17）mRNA及蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果 與正常對照組比較，野百合堿組及黃芪多糖各劑量組大鼠mPAP、RVHI均顯著升高（P<0.01），肺組織中IL-17的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P<0.01），肺動脈及心肌細(xì)胞有明顯病理改變;與野百合堿組比較，黃芪多糖各劑量組大鼠mPAP、RVHI均顯著降低（P<0.01），肺組織中IL-17的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P<0.01），肺動脈及心肌細(xì)胞病理變化有改善;與黃芪多糖低劑量組比較，黃芪多糖高劑量組大鼠上述指標(biāo)水平及病理改變的改善更明顯。結(jié)論 黃芪多糖能降低野百合堿誘導(dǎo)大鼠的肺動脈高壓，并改善肺動脈結(jié)構(gòu)及心肌病理改變，推測其機(jī)制可能與下調(diào)大鼠肺組織中IL-17的表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞 黃芪多糖;野百合堿;肺動脈高壓;白細(xì)胞介素17

中圖分類號 R972;R965 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2022）01-0064-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2022.01.11

ABSTRACT? ?OBJECTIVE To study the mitigation effect and its possible mechanism of Astragalus membranaceus polysaccharide on the pulmonary hypertension induced by monocrotaline in rats. METHODS One hundred SD male rats were randomly divided into normal control group， monocrotaline group， A. membranaceus polysaccharide low-dose and high-dose groups. In addition to the normal control group， rats in other groups were injected with monocrotaline by single intraperitoneal injection of 60 mg/kg. On days 2 to 28 after administration， rats in the A. membranaceus polysaccharide low-dose and high-dose groups were intraperitoneally injected with A. membranaceus polysaccharide of 200 mg/kg and 400 mg/kg， respectively， once a day. There were 25 rats in each group， and 15 rats were taken for index detection. The mean pulmonary artery pressure （mPAP） and right heart hypertrophy index （RVHI） were detected， and morphology changes of pulmonary artery and cardiomyocytes were monitored.? mRNA and protein expression of IL-17 in their lung tissues were detected. RESULTS Compared with normal control group， mPAP and RVHI of monocrotaline group and A. membranaceus polysaccharide groups were increased significantly （P<0.01）; mRNA and protein expression of IL-17 in lung tissues were significantly increased （P<0.01）， and there were obvious pathological changes in pulmonary artery and cardiomyocytes. Compared with monocrotaline group， mPAP and RVHI were significantly decreased in A. membranaceus polysaccharide groups（P<0.01）， while mRNA and protein expression of IL-17 in lung tissue were decreased significantly （P<0.01）; pathological changes in pulmonary artery and cardiomyocytes were improved. Compared with A. membranaceus polysaccharide low-dose group， above indexes and? pathological changes were improved significantly in high-dose group. CONCLUSIONS A. membranaceus polysaccharide can reduce monocrotaline-induced pulmonary hypertension， improve pulmonary artery structure and myocardial remodeling in rats， the mechanism of which is presumably related to the down-regulation of IL-17 expression in lung tissue of rats.

KEYWORDS? ?Astragalus membranaceus polysaccharide; monocrotaline; pulmonary hypertension; IL-17

肺動脈高壓是一類以肺動脈重構(gòu)為特征的進(jìn)展性心肺血管惡性疾病，其發(fā)病機(jī)制目前尚未完全闡明，但肺血管重構(gòu)及肺動脈血流動力學(xué)的改變是肺動脈高壓發(fā)病中重要的病理生理過程[1]。有研究顯示，肺動脈高壓患者肺血管中CD4+T淋巴細(xì)胞表達(dá)升高，CD4+T淋巴細(xì)胞在肺動脈高壓中發(fā)揮作用的主要途徑之一為分泌各類細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素6（interleukin 6，IL-6）、IL-10、IL-17等[2-3]。其中，IL-17主要分泌自CD4+T淋巴細(xì)胞。已有研究表明，IL-17表達(dá)水平可影響肺動脈高壓疾病的發(fā)展：上調(diào)IL-17的表達(dá)能促進(jìn)該疾病的發(fā)展，下調(diào)IL-17的表達(dá)能減緩該疾病的發(fā)展并能改善肺血管的重塑[4-5]。而黃芪多糖可提高體細(xì)胞免疫功能，增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞活性，并且可以對CD4+T淋巴細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子起調(diào)節(jié)作用[6-7];且黃芪多糖有降壓作用，能不同程度地促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞游走與增殖，有利于血管生成[8-9]，但目前黃芪多糖對肺動脈高壓影響的研究很少[10-11]。本研究主要探討黃芪多糖通過調(diào)節(jié)IL-17的表達(dá)對野百合堿誘導(dǎo)大鼠肺動脈高壓的減緩作用，并探討其可能機(jī)制，以期為黃芪多糖治療肺動脈高壓的臨床研究提供一定的動物實驗基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 主要儀器

ChemiDoc XRS+型全自動凝膠成像系統(tǒng)、PowerPac HC電泳儀購自美國Bio-Rad公司;CX31型光學(xué)顯微鏡購自日本Olympus公司;DYY-Ⅲ-6B 型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀購自北京六一儀器廠;DU640型紫外分光光度計購自美國Beckman Coulter公司。

1.2 主要藥品與試劑

野百合堿（批號C2401-1G，純度99.64%）購自美國Sigma公司;注射用黃芪多糖（國藥準(zhǔn)字Z20040086）購自天津賽諾制藥有限公司;Trizol RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、擴(kuò)增試劑盒及DNA Marker（批號分別為D9108A、DRR037A、D334A、DL1000）均購自日本TaKaRa公司;實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RT-PCR）引物由寶生物工程（大連）有限公司合成;UltraPure瓊脂糖（批號16500500）購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司;鼠IL-17單克隆一抗及辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠多克隆二抗（批號sc-374218、sc-2005）均購自美國Santa Cruz公司;鼠β-actin單克隆一抗（內(nèi)參，批號bsm- 33036M）購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司;凱基膜蛋白提取試劑盒（批號BC3710）購自北京索萊寶科技有限公司;十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳上樣緩沖液（批號02432319）購自美國Thermo Fisher Scientific公司;ECL發(fā)光液（批號WBKLS0100）購自美國Millipore公司;其余試劑均為分析純或?qū)嶒炇页Ｓ靡?guī)格，水為蒸餾水。

1.3 實驗動物

雄性清潔級SD大鼠共100只由重慶醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供，平均8～10周齡，體質(zhì)量200～250 g，于溫度22～25 ℃、濕度40%～60%環(huán)境中適應(yīng)性喂養(yǎng)，自由攝食飲水。動物合格證號：SYXK（渝）2018-0003。

2 方法

2.1 分組及給藥、造模

分組：將100只SD大鼠隨機(jī)分為正常對照組、野百合堿組、黃芪多糖低劑量組和黃芪多糖高劑量組，每組25只。分組后所有實驗動物的飼養(yǎng)目標(biāo)周期為28 d，考慮本實驗大鼠飼養(yǎng)過程中可能出現(xiàn)死亡或者造模失敗等因素，將25只大鼠按照1～25進(jìn)行編號，到飼養(yǎng)目標(biāo)周期后每組隨機(jī)抽取15只大鼠進(jìn)行研究。

參考文獻(xiàn)[12-16]，通過一次性腹腔注射野百合堿（60 mg/kg）誘導(dǎo)大鼠肺動脈高壓。將野百合堿結(jié)晶溶解在0.5 mmol/L HCl溶液中，再用0.5 mmol/L NaHCO3溶液調(diào)節(jié)至pH為7.4的溶液。給藥：野百合堿組（造模組）大鼠在分組第1天腹腔單次注射野百合堿（60 mg/kg）;將注射用黃芪多糖0.25 g溶解在10 mL生理鹽水中，根據(jù)預(yù)實驗設(shè)計了兩種干預(yù)劑量，即低劑量（200 mg/kg）和高劑量（400 mg/kg）。黃芪多糖低劑量組大鼠在分組第1天腹腔單次注射野百合堿（60 mg/kg），然后在第2～28天腹腔注射黃芪多糖200 mg/kg，每日1次;黃芪多糖高劑量組大鼠在分組第1天腹腔單次注射野百合堿60? mg/kg，然后在第2～28天腹腔注射黃芪多糖400 mg/kg，每日1次;正常對照組大鼠在第2～28天腹腔注射等體積生理鹽水，每日1次。所有實驗組大鼠給藥后飼養(yǎng)目標(biāo)周期為28 d。

2.2 大鼠平均肺動脈壓的檢測

所有實驗大鼠造模及給藥28 d后腹腔注射10%水合氯醛（30 mL/kg）將其充分麻醉，仰臥位固定并充分暴露游離大鼠右側(cè)頸外靜脈，將5F微導(dǎo)管一邊接多導(dǎo)生理記錄儀，另一邊從右側(cè)頸外靜脈插入至右心房、右心室及肺動脈主干，當(dāng)記錄儀上出現(xiàn)典型壓力曲線波時，記錄右室收縮壓及肺動脈壓，并計算大鼠的平均肺動脈壓（mean pulmonary artery pressure，mPAP）：mPAP=1/3×肺動脈收縮壓+2/3×肺動脈舒張壓。參考臨床常用標(biāo)準(zhǔn)，本研究以野百合堿組大鼠較正常對照組大鼠mPAP明顯升高10 mm Hg（1 mmHg=0.133 kPa）及以上提示造模成功。

2.3 右心肥厚指數(shù)的檢測

參考文獻(xiàn)[17-18]，對大鼠的左心室和室間隔（LV+S）與右心室游離壁（RV）進(jìn)行分離：沿房室溝剪掉大血管根部和左、右心房，然后沿后室壁間溝分離右心室的游離壁，用濾紙充分吸干，分別稱量LV+S、RV的質(zhì)量，并計算大鼠的右心肥厚指數(shù)（right ventricular hypertrophy index，RVHI）來間接反映肺動脈平均壓力：RVHI=RV的質(zhì)量/（LV+S）的質(zhì)量。

2.4 肺內(nèi)小動脈和心肌組織形態(tài)改變的觀察

處死大鼠并取出其全肺，分離左右肺組織，以生理鹽水沖洗，然后用4%多聚甲醛固定肺組織，石蠟包埋，常規(guī)石蠟切片后行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察肺內(nèi)小動脈的形態(tài)改變。于右心室尖取1.0 cm×0.3 cm大小的游離心肌組織，浸入10%甲醇固定，常規(guī)石蠟切片后行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察心肌組織的形態(tài)改變。

2.5 肺組織中IL-17 mRNA表達(dá)水平的檢測

采用RT-PCR法進(jìn)行檢測。按照Trizol RNA提取試劑盒說明書步驟提取大鼠肺組織總RNA，采用紫外分光光度法及瓊脂糖凝膠電泳法分析提取RNA的純度及完整性。依據(jù)TaKaRa DRR037A反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，以1 μg總RNA為模板，合成cDNA。按照TaKaRa D334A擴(kuò)增試劑盒說明書建立反應(yīng)體系，以PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。IL-17基因反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，57.8 ℃退火30 s，72 ℃延伸35 s，32個循環(huán);72 ℃ 10 min，4 ℃ 2 min。β-actin基因反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，57.4 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，28個循環(huán);72 ℃ 10 min，4 ℃ 2 min。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，以凝膠成像系統(tǒng)掃描成像，采用Quantity One軟件進(jìn)行條帶密度分析，以目的基因條帶與內(nèi)參基因條帶的比值表示IL-17的mRNA表達(dá)水平。PCR引物序列及產(chǎn)物長度見表1。

2.6 肺組織中IL-17蛋白表達(dá)水平的檢測

采用Western blot進(jìn)行檢測。按凱基膜蛋白提取試劑盒說明書步驟提取大鼠肺組織蛋白，用BCA法進(jìn)行蛋白定量并繪制標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線;調(diào)整蛋白濃度后按體積比4 ∶ 1加入蛋白上樣緩沖液×5次，100 ℃煮沸5 min。使用DYY-Ⅲ-6B 型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀，每泳道加50 μg蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（8%分離膠，5%濃縮膠）;用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜上，以PBST配制的5%脫脂奶粉溶液室溫封閉1 h;加入IL-17一抗（稀釋度為1 ∶ 800）及內(nèi)參β-actin一抗（稀釋度為1 ∶ 3 000），4 ℃孵育過夜;PBST洗膜10 min×3次后加入二抗（稀釋度為1 ∶ 8 000）室溫孵育2 h;PBST洗膜10 min×3次后，采用ECL顯色。每組實驗至少重復(fù)3次。圖像掃描后用Quantity One軟件分析，以目的蛋白條帶與內(nèi)參蛋白條帶光密度比值表示IL-17的蛋白表達(dá)水平。

2.7 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料滿足正態(tài)分布則以x±s表示，多個樣本均數(shù)間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠mPAP、RVHI

本研究結(jié)果顯示，野百合堿組大鼠mPAP為（33.5±5.16）mmHg，正常對照組大鼠mPAP為（12.3±1.98）mmHg，野百合堿組大鼠mPAP升高10 mmHg以上，提示本實驗造模成功。黃芪多糖低劑量組和黃芪多糖高劑量組大鼠mPAP、RVHI較野百合堿組均顯著降低（P<0.01）;黃芪多糖高劑量組大鼠mPAP、RVHI較黃芪多糖低劑量組均顯著降低（P<0.01）。結(jié)果見表2。

3.2 各組大鼠肺動脈的病理形態(tài)

正常對照組大鼠肺組織HE染色后可見肺動脈光滑平整，無肌型動脈;野百合堿組大鼠肺動脈平滑肌細(xì)胞明顯增生;黃芪多糖低劑量組大鼠肺動脈平滑肌細(xì)胞增生肥大，程度較野百合堿組輕;黃芪多糖高劑量組大鼠肺動脈平滑肌細(xì)胞增生肥大，程度較黃芪多糖低劑量組輕。各組大鼠肺動脈病理形態(tài)顯微圖見圖1。

3.3 各組大鼠心肌組織的病理形態(tài)

正常對照組大鼠右心室組織HE染色可見心肌細(xì)胞排列整齊，無炎癥細(xì)胞浸潤，心肌纖維排列整齊;野百合堿組大鼠心肌細(xì)胞肥大，排列紊亂，部分細(xì)胞核增大，細(xì)胞周圍有較多炎性細(xì)胞浸潤，心肌纖維排列紊亂疏松;黃芪多糖高劑量組大鼠心肌細(xì)胞排列整齊，有少許炎性細(xì)胞浸潤，心肌纖維排列稍紊亂;黃芪多糖低劑量組大鼠的心肌組織改變介于野百合堿組和黃芪多糖高劑量組之間。各組大鼠心肌組織病理形態(tài)顯微圖見圖2。

3.4 各組大鼠肺組織中IL-17 mRNA表達(dá)水平

正常對照組、野百合堿組、黃芪多糖低劑量組、黃芪多糖高劑量組大鼠肺組織中IL-17 mRNA表達(dá)水平分別為0.09±0.01、0.33±0.03、0.23±0.03、0.13±0.02。其中黃芪多糖低劑量組、黃芪多糖高劑量組大鼠肺組織中IL-17 mRNA表達(dá)水平較野百合堿組均顯著降低（P<0.05）;黃芪多糖高劑量組大鼠肺組織中IL-17 mRNA表達(dá)水平較黃芪多糖低劑量組顯著降低（P<0.05）。各組大鼠肺組織中IL-17 mRNA表達(dá)電泳圖見圖3。

3.5 各組大鼠肺組織中IL-17 蛋白表達(dá)水平

正常對照組、野百合堿組、黃芪多糖低劑量組、黃芪多糖高劑量組大鼠肺組織中IL-17蛋白表達(dá)水平分別為0.36±0.04、0.93±0.08、0.76±0.06、0.52±0.06。其中黃芪多糖低劑量組、黃芪多糖高劑量組大鼠肺組織中IL-17蛋白表達(dá)水平較野百合堿組均顯著降低（P<0.05）;黃芪多糖高劑量組大鼠肺組織中IL-17蛋白表達(dá)水平較黃芪多糖低劑量組顯著降低（P<0.05）。各組大鼠肺組織中IL-17 蛋白表達(dá)電泳圖見圖4。

4 討論

本研究中，SD大鼠腹腔注射野百合堿后，其mPAP較正常對照組大鼠顯著升高10 mmHg以上，表明研究成功建立了大鼠肺動脈高壓模型。通過HE染色觀察大鼠肺動脈及心肌組織，發(fā)現(xiàn)肺動脈及心肌細(xì)胞有明顯的病理改變，進(jìn)一步證實大鼠造模成功，這也為本實驗開展其他方面的研究奠定了基礎(chǔ)。

本研究結(jié)果顯示，野百合堿誘導(dǎo)肺動脈高壓模型大鼠肺組織中IL-17 mRNA及蛋白表達(dá)水平均顯著升高，這可能與野百合堿的炎癥反應(yīng)誘導(dǎo)機(jī)制有關(guān)。研究表明，肺動脈高壓大鼠肺組織中CD4+T淋巴細(xì)胞表達(dá)升高，并可分泌一系列的炎癥因子，如IL-17、IL-6、IL-10等[12-14]。野百合堿主要通過炎癥反應(yīng)機(jī)制誘導(dǎo)大鼠肺動脈高壓的發(fā)生，初始CD4+T細(xì)胞接受抗原刺激后，在不同條件下可分化成不同亞型的T細(xì)胞，執(zhí)行不同的功能;其分化方向受抗原性質(zhì)、局部環(huán)境中的激素及細(xì)胞因子等多種因素的影響，其中細(xì)胞因子的種類和細(xì)胞因子之間的平衡對輔助性T細(xì)胞（Th細(xì)胞）的分化具有重要調(diào)節(jié)作用[15]。研究表明，野百合堿誘導(dǎo)的肺動脈高壓模型大鼠肺組織中IL-6、轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）水平明顯升高;CD4+T淋巴細(xì)胞在TGF-β和IL-6 的共同誘導(dǎo)下分化為Th17，后者分泌IL-6、IL-17參與炎癥反應(yīng)和自身免疫性疾病[16]。本研究結(jié)果顯示，野百合堿組大鼠肺組織中IL-17 mRNA及蛋白表達(dá)水平均顯著升高，推測可能與野百合堿通過炎癥反應(yīng)產(chǎn)生大量的炎癥因子如IL-6、TGF-β1等，誘導(dǎo)CD4+T淋巴細(xì)胞分化為Th17細(xì)胞，通過Th17細(xì)胞上調(diào)IL-17的表達(dá)有關(guān)。

本研究結(jié)果表明，黃芪多糖可改善肺動脈高壓模型大鼠的mPAP及其肺動脈、心肌細(xì)胞重塑，下調(diào)肺組織中IL-17 mRNA及蛋白的表達(dá)，進(jìn)而減緩大鼠肺動脈高壓的發(fā)生、發(fā)展。黃芪多糖具有增強(qiáng)免疫作用，對特異性及非特異性免疫皆有促進(jìn)作用。宋淑珍等[19]研究表明，黃芪多糖對體檢健康者淋巴細(xì)胞亞群有調(diào)節(jié)作用：體檢者服用黃芪多糖后T抑制淋巴細(xì)胞（CD3+、CD8+）水平降低，CD4+T淋巴細(xì)胞、CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞比值（CD4+/CD8+）較服藥前明顯升高，提示黃芪多糖通過降低T淋巴細(xì)胞抑制亞群水平及升高CD4+/CD8+來增加T細(xì)胞的殺傷作用。此外，動物實驗研究結(jié)果也表明，黃芪多糖可以明顯提升免疫功能低下小鼠的CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)，促進(jìn)Th1細(xì)胞因子IL-2、γ干擾素及 Th2細(xì)胞因子IL-4 的分泌，調(diào)控CD4+/CD8+[20]。此外，已有研究表明，黃芪多糖能降低IL-6、IL-10、TGF-β及IL-12等炎癥因子的表達(dá)[21-22]。因此，筆者推測黃芪多糖還可能通過降低炎癥因子的表達(dá)，抑制CD4+T淋巴細(xì)胞向Th17細(xì)胞轉(zhuǎn)化及促進(jìn)其向Th1、Th2細(xì)胞轉(zhuǎn)化，進(jìn)而降低IL-17的表達(dá)，發(fā)揮對大鼠肺動脈高壓的減緩作用，但這還需要進(jìn)一步的研究。

綜上所述，本研究通過野百合堿成功誘導(dǎo)建立了肺動脈高壓大鼠模型，進(jìn)一步通過腹腔注射黃芪多糖進(jìn)行研究，表明黃芪多糖能降低野百合堿誘導(dǎo)的大鼠肺動脈高壓、改善其肺動脈及心肌細(xì)胞的病理改變，推測其作用機(jī)制可能與下調(diào)肺動脈高壓大鼠肺組織中IL-17 mRNA及蛋白的表達(dá)有關(guān)。

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（收稿日期：2021-08-29 修回日期：2021-10-14）

（編輯：舒安琴）