眼部成纖維細(xì)胞在眼科疾病中的研究進(jìn)展△

劉 江 文 杭 項(xiàng)敏泓

成纖維細(xì)胞也稱為纖維母細(xì)胞，是疏松結(jié)締組織中最常見(jiàn)的細(xì)胞，在機(jī)體內(nèi)廣泛分布。成纖維細(xì)胞可合成、分泌大量的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)，促進(jìn)傷口愈合，參與纖維化疾病的發(fā)生[1]。皮膚成纖維細(xì)胞參與受損皮膚的修復(fù)，促進(jìn)傷口愈合及瘢痕形成[2]；肺部成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的大量ECM沉積可引發(fā)特發(fā)性肺纖維化[3]；心肌成纖維細(xì)胞參與心肌細(xì)胞的重塑并導(dǎo)致不同程度的心功能衰竭[4]；肝臟成纖維細(xì)胞的增殖和活化會(huì)導(dǎo)致肝纖維化[5]等。同樣，眼部成纖維細(xì)胞在眼科的諸多疾病中起著重要的作用。本文就眼部成纖維細(xì)胞的生物學(xué)特征、體外培養(yǎng)的方法及其在眼科疾病中的研究進(jìn)展作一綜述，以期指導(dǎo)臨床。

1 成纖維細(xì)胞的生物學(xué)特征

成纖維細(xì)胞形態(tài)多樣，主要有梭形、鹿角形和星形，胞核呈橢圓形，核仁大而明顯；胞質(zhì)呈弱嗜堿性，含豐富且發(fā)達(dá)的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基復(fù)合體及游離核糖體，因此具有強(qiáng)大的合成和分泌蛋白質(zhì)的功能。此外，成纖維細(xì)胞還具備合成膠原纖維蛋白、粘連蛋白以及分泌膠原纖維、彈力纖維和網(wǎng)狀纖維的能力。當(dāng)成纖維細(xì)胞處于低活性狀態(tài)時(shí)，稱之為纖維細(xì)胞。纖維細(xì)胞的胞體較小，呈長(zhǎng)梭形，細(xì)胞質(zhì)少[6]。在外傷等因素刺激下，部分纖維細(xì)胞重新轉(zhuǎn)變?yōu)槌衫w維細(xì)胞，其合成和分泌蛋白質(zhì)的功能也隨之恢復(fù)。在轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)的誘導(dǎo)下成纖維細(xì)胞可進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，其可改變?cè)械慕M織張力，參與組織損傷后的修復(fù)[7]。

2 眼部成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)方法

2.1 結(jié)膜松弛癥成纖維細(xì)胞將結(jié)膜松弛癥患者手術(shù)中切除的松弛結(jié)膜組織放入無(wú)菌生理鹽水中漂洗去除血污，剪成 0.5 mm×1.0 mm×1.0 mm大小的組織塊，平鋪于六孔板并置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2的培養(yǎng)箱中，待組織塊接近干燥后再緩慢貼壁加入3 mL含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清和1 g·L-1青鏈霉素及成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)添加物的DMEM培養(yǎng)液，每3 d換液1次，2～5 d可見(jiàn)貼壁組織塊周圍有細(xì)胞溢出。經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察、免疫熒光染色及流式細(xì)胞術(shù)等方法鑒定后，傳至第3～5代的成纖維細(xì)胞可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)[8]。

2.2 翼狀胬肉成纖維細(xì)胞將翼狀胬肉患者手術(shù)中獲得的組織塊置于DMEM培養(yǎng)液中，使用含有500×103U·L-1青霉素和500 mg·L-1鏈霉素的磷酸鹽(PBS)緩沖液對(duì)組織塊進(jìn)行漂洗，再將組織塊剪成1.0 mm×1.0 mm×2.0 mm大小，接種在涂有胎牛血清的培養(yǎng)皿中，加入培養(yǎng)基，置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2的培養(yǎng)箱過(guò)夜。每3～4 d換液1次。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到70%～80%時(shí)將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中繼續(xù)孵育，取第3～10代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)[9]。劉琳琳等[10]使用斜口培養(yǎng)瓶對(duì)翼狀胬肉成纖維細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)。無(wú)菌條件下將取得的翼狀胬肉組織樣本置于冰上，用PBS緩沖液沖洗后將組織塊修剪為0.5 mm×0.5 mm×0.5 mm大小，加入含體積分?jǐn)?shù)12%胎牛血清的培養(yǎng)液，2～3 d后可見(jiàn)長(zhǎng)梭形細(xì)胞從組織塊邊緣爬出，1 周后可長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶，用胰蛋白酶消化后傳代。每2 d換液1次，4～6 d可傳代，取第3代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3 成纖維細(xì)胞在眼科疾病中的研究進(jìn)展

3.1 成纖維細(xì)胞與結(jié)膜松弛癥的相關(guān)研究結(jié)膜松弛癥是由于球結(jié)膜過(guò)度松弛和(或)下瞼緣張力過(guò)高造成松弛的球結(jié)膜堆積在眼球與下瞼緣、內(nèi)眥、外眥部之間形成皺褶，引起眼表淚液學(xué)微環(huán)境異常，并伴有眼部干澀、異物感、溢淚等不適癥狀的眼病[11]。結(jié)膜松弛癥的發(fā)病機(jī)制目前尚未完全明確，可能涉及不同的因素，如結(jié)膜老化、淚膜不穩(wěn)定、機(jī)械摩擦、淚液清除延遲等，其中結(jié)膜的膠原纖維溶解和彈力纖維變性是結(jié)膜松弛癥的致病因素之一[12]。李軼捷等[13]通過(guò)透射電鏡發(fā)現(xiàn)，結(jié)膜松弛癥患者球結(jié)膜固有層及筋膜組織中的膠原纖維減少、成纖維細(xì)胞發(fā)生變性。Xiang等[14]研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)膜松弛癥患者松弛結(jié)膜組織中基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-1和MMP-3表達(dá)上調(diào)。由于MMP可促進(jìn)ECM降解，其上調(diào)意味著膠原纖維溶解和彈力纖維降解的活性增加，導(dǎo)致結(jié)膜基質(zhì)和眼球筋膜過(guò)度降解，出現(xiàn)球結(jié)膜變薄，松弛結(jié)膜組織堆積并形成結(jié)膜松弛癥。韓竹梅等[15]利用ELISA法檢測(cè)到結(jié)膜松弛癥患者成纖維細(xì)胞上清液中穿透素-3及腫瘤壞死因子-α刺激基因6的表達(dá)上調(diào)，證實(shí)炎癥反應(yīng)相關(guān)蛋白穿透素-3、腫瘤壞死因子-α刺激基因6參與結(jié)膜松弛癥的發(fā)生發(fā)展。

嚴(yán)重的結(jié)膜松弛癥患者需要手術(shù)治療，但手術(shù)存在風(fēng)險(xiǎn)，且有一定適應(yīng)證，因此更為安全的治療手段顯得尤為重要。研究發(fā)現(xiàn)，中藥杞精明目湯可下調(diào)結(jié)膜松弛癥患者成纖維細(xì)胞中 MMP-1、MMP-3的表達(dá)[16]。賈元玲等[17]采用杞精明目湯顆粒劑對(duì)體外培養(yǎng)的結(jié)膜松弛癥患者結(jié)膜成纖維細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，檢測(cè)其絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路相關(guān)蛋白及mRNA的表達(dá)，證實(shí)杞精明目湯可下調(diào)該通路的表達(dá)，從而起到治療結(jié)膜松弛癥的作用。

3.2 成纖維細(xì)胞與翼狀胬肉的相關(guān)研究眼部成纖維細(xì)胞參與翼狀胬肉的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，包括細(xì)胞的增殖、遷移、纖維化、炎癥浸潤(rùn)、血管生成和ECM的分解[18]。α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)在肌成纖維細(xì)胞中高表達(dá)，是成纖維細(xì)胞收縮的主要標(biāo)志，可推動(dòng)上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變[19]。TGF-β1是纖維化的主要誘導(dǎo)劑，促進(jìn)肌成纖維細(xì)胞分化，并誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化[20]。研究發(fā)現(xiàn)，與正常結(jié)膜組織相比，翼狀胬肉組織中TGF-β1、α-SMA表達(dá)增強(qiáng)，提示眼部成纖維細(xì)胞的纖維化參與翼狀胬肉的發(fā)生發(fā)展[21]。在倒置顯微鏡下可見(jiàn)原代培養(yǎng)的正常人結(jié)膜成纖維細(xì)胞為典型樹(shù)突狀，而翼狀胬肉患者成纖維細(xì)胞則失去原始形態(tài)，表現(xiàn)為更加扁平的細(xì)胞，且伴有α-SMA和TGF-β1表達(dá)顯著升高[22]。彭娟等[23]發(fā)現(xiàn)，鼻、顳側(cè)均有翼狀胬肉的患者，其結(jié)膜成纖維細(xì)胞的增生、移行能力大于僅有單側(cè)翼狀胬肉和正常人的結(jié)膜成纖維細(xì)胞，且α-SMA的表達(dá)更強(qiáng)。

目前翼狀胬肉的治療以手術(shù)為主，傳統(tǒng)的抗代謝藥物如絲裂霉素C和5-氟尿嘧啶等可抑制結(jié)膜下組織纖維化，減少疾病復(fù)發(fā)[24]，但可導(dǎo)致鞏膜溶解、眼內(nèi)炎、黃斑病變、低眼壓等不良反應(yīng)[25]，因此臨床需要新的抗纖維化藥物。Koga等[26]將翼狀胬肉患者成纖維細(xì)胞用丁酸酯或苯丁酸酯處理48 h，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)α-SMA、I型膠原蛋白、III型膠原蛋白和MMP-1的表達(dá)，證實(shí)丁酸酯或苯丁酸具有抗纖維化的作用。Chen等[27]研究發(fā)現(xiàn)，迷迭香酸可下調(diào)I型膠原蛋白和TGF-β1/Smad的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而抑制纖維化。Tao等[28]將體外培養(yǎng)的翼狀胬肉患者成纖維細(xì)胞經(jīng)200 g·L-1吡非尼酮處理后發(fā)現(xiàn)，其可有效抑制成纖維細(xì)胞的增殖、遷移和膠原蛋白的收縮，提示吡非尼酮可預(yù)防術(shù)后翼狀胬肉的復(fù)發(fā)。

3.3 成纖維細(xì)胞與角膜疾病的相關(guān)研究眼部的感染、手術(shù)和創(chuàng)傷，都可能會(huì)觸發(fā)原本透明的角膜組織中成纖維細(xì)胞的形成和進(jìn)一步纖維化，從而使角膜失去透明性，甚至導(dǎo)致永久性的視力障礙。如堿燒傷可破壞角膜的完整性，誘導(dǎo)靜止細(xì)胞分化為成纖維細(xì)胞或肌成纖維細(xì)胞并表達(dá)α-SMA，參與組織修復(fù)與瘢痕形成[29]。一項(xiàng)對(duì)持續(xù)性角膜上皮細(xì)胞缺損的研究表明，角膜瘢痕的形成是肌成纖維細(xì)胞介導(dǎo)的纖維化過(guò)程[30]。LASIK術(shù)后，患者角膜瓣邊緣的窄帶出現(xiàn)肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化[31]，角膜基質(zhì)層的纖維化總出現(xiàn)在LASIK患者的角膜瓣緣，這種纖維化有助于預(yù)防外傷所致的角膜瓣移位[32]。Luft等[33]對(duì)SMILE和飛秒激光輔助的LASIK(FS-LASIK)術(shù)后患者角膜基質(zhì)層進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)S-LASIK 術(shù)后患者激光損傷部位纖維連接蛋白的表達(dá)較SMILE強(qiáng)。由于纖維連接蛋白是由角膜基質(zhì)層中活化的成纖維細(xì)胞所產(chǎn)生，提示成纖維細(xì)胞參與FS-LASIK術(shù)后角膜基質(zhì)的纖維化反應(yīng)。

3.4 成纖維細(xì)胞與青光眼濾過(guò)手術(shù)后的瘢痕化青光眼是目前主要的致盲性眼病之一，降低眼壓是其主要的治療手段[34]。青光眼濾過(guò)性手術(shù)可有效降低眼壓，但術(shù)后患者可能出現(xiàn)濾過(guò)道的瘢痕化，成纖維細(xì)胞的增生和ECM的過(guò)度合成是濾過(guò)泡瘢痕形成的主要原因[35]。濾過(guò)性手術(shù)可激活Tenon囊的成纖維細(xì)胞(HTFs)，HTFs的激活導(dǎo)致纖維化蛋白的產(chǎn)生和過(guò)度增生，進(jìn)一步引起濾過(guò)泡中過(guò)多的瘢痕形成[36]。研究發(fā)現(xiàn)，青光眼患者的房水中存在較高生物活性的TGF-β1，使青光眼患者小梁網(wǎng)中ECM沉積和纖維化加重[37]。青光眼術(shù)后濾過(guò)道的瘢痕中還存在細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)化，表現(xiàn)為HTFs轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞[38]。晏維玲等[39]發(fā)現(xiàn)，在HTFs轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞的過(guò)程中，P53表達(dá)顯著升高，miR-29b表達(dá)明顯降低，推測(cè)P53與miR-29b之間的相互作用可調(diào)控瘢痕纖維化過(guò)程。邰雪等[40]研究發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素可抑制兔抗青光眼術(shù)后濾過(guò)區(qū)組織的過(guò)度增生，保留功能性濾過(guò)泡，并誘導(dǎo)兔眼結(jié)膜成纖維細(xì)胞的凋亡，抑制青光眼患眼術(shù)后成纖維細(xì)胞的過(guò)度增生，預(yù)防瘢痕化的發(fā)生。

3.5 成纖維細(xì)胞與視網(wǎng)膜疾病的相關(guān)研究在諸多視網(wǎng)膜疾病中可見(jiàn)成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，例如增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變(PVR)和年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)患者視網(wǎng)膜下發(fā)生纖維化[41]。

PVR是一種纖維化改變的病理過(guò)程，視網(wǎng)膜下膜或視網(wǎng)膜前膜的形成是PVR的主要特征。成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞被認(rèn)為是視網(wǎng)膜前膜的主要細(xì)胞表型，其一旦收縮將會(huì)對(duì)視網(wǎng)膜形成廣泛的牽拉作用，導(dǎo)致視網(wǎng)膜皺縮和牽拉性視網(wǎng)膜脫離[42]。Shu等[43]認(rèn)為這與肌成纖維細(xì)胞中α-SMA的表達(dá)增加有關(guān)，其可促使視網(wǎng)膜前膜中的肌成纖維細(xì)胞具有更持久的收縮特性，分泌更多的ECM和促纖維化因子，從而促使PVR膜收縮，最終導(dǎo)致不可逆的視力喪失。

新生血管向黃斑部的生長(zhǎng)是AMD的標(biāo)志性病理改變[44]，黃斑纖維化是AMD自然病程的終末期[45]。研究發(fā)現(xiàn)，AMD患者的脈絡(luò)膜新生血管膜中存在多種細(xì)胞，包括成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞，且在脈絡(luò)膜新生血管膜中檢測(cè)到α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞，它是肌成纖維細(xì)胞的特征性標(biāo)志。肌成纖維細(xì)胞產(chǎn)生大量的ECM參與黃斑的纖維化，是驅(qū)動(dòng)病原性纖維化的關(guān)鍵細(xì)胞[46]。

3.6 成纖維細(xì)胞與眼瞼基底細(xì)胞癌的相關(guān)研究在倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，與正常成纖維細(xì)胞相比，眼瞼基底細(xì)胞癌患者成纖維細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，細(xì)胞質(zhì)突起減少，增生快速，排列不規(guī)則，可重疊生長(zhǎng)，喪失了接觸抑制現(xiàn)象，且成纖維細(xì)胞特異性表達(dá)α-SMA、活化蛋白、波形蛋白等[47]。成纖維細(xì)胞活化蛋白是成纖維細(xì)胞活化后特異性表達(dá)的標(biāo)志物，其在眼瞼基底細(xì)胞癌患者成纖維細(xì)胞中過(guò)表達(dá)，并通過(guò)調(diào)節(jié) PTEN/PI3K/Akt 信號(hào)通路促進(jìn)癌相關(guān)成纖維細(xì)胞的增殖，提示基底細(xì)胞癌患者成纖維細(xì)胞的遷移、侵襲與眼瞼基底細(xì)胞癌的發(fā)生密切相關(guān)[48]。

3.7 成纖維細(xì)胞與Graves眼病的相關(guān)研究Graves眼病是一種以炎癥、組織重塑、擴(kuò)張和纖維化為特征的自身免疫性疾病[49]。研究證實(shí)，Graves眼病眼眶成纖維細(xì)胞中結(jié)締組織生長(zhǎng)因子表達(dá)升高，其可直接或充當(dāng)TGF-β1的下游介質(zhì)來(lái)促進(jìn)Graves眼病患者眼眶成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞并產(chǎn)生ECM[50]。活化的眼眶成纖維細(xì)胞產(chǎn)生炎癥介質(zhì)，這些炎癥介質(zhì)又可促進(jìn)肌成纖維細(xì)胞的分化，并刺激富含透明質(zhì)酸的基質(zhì)積聚，加劇眼眶組織的水腫和纖維化[51]。Graves眼病晚期，患者眼眶組織的纖維化會(huì)導(dǎo)致眼球運(yùn)動(dòng)受限、眼球突出，出現(xiàn)暴露性角膜炎和甲亢相關(guān)的視神經(jīng)病變等[52]。

4 展望

由于成纖維細(xì)胞的增生、活化以及纖維化相關(guān)細(xì)胞因子在眼科疾病的發(fā)生發(fā)展起著重要的作用，因此需對(duì)成纖維細(xì)胞進(jìn)行更為深入的研究。這將為眼部疾病發(fā)病機(jī)制的研究和治療領(lǐng)域的拓展提供更多新的思路。