MK2抑制劑PF-3644022對(duì)視網(wǎng)膜分支靜脈阻塞模型大鼠的治療作用△

孫 湛 齊 赟 李晶明 崔麗珺 陳 麗 謝安明 康前雁 劉 軒

視網(wǎng)膜靜脈阻塞是一種常見的眼科血管疾病，分為視網(wǎng)膜分支靜脈阻塞(BRVO)和視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞。BRVO患病率為0.3%～1.1%，是第二常見的視網(wǎng)膜血管疾病[1]。目前，BRVO的治療策略包括激光光凝、抗血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)藥物和地塞米松玻璃體內(nèi)注射以減輕視網(wǎng)膜水腫[2]。然而，激光光凝并不能明顯提高患者的預(yù)后視力[3]?？筕EGF治療對(duì)于需要持續(xù)治療以維持改善視力的患者來說，可能會(huì)導(dǎo)致身體疼痛[4]。地塞米松具有抗炎作用，并間接抑制新生血管[5]，然而，當(dāng)使用超過安全范圍時(shí)，可引起高眼壓、白內(nèi)障和非感染性眼內(nèi)炎等不良反應(yīng)[4]。絲裂原活化蛋白激酶激活的蛋白激酶2(MK2)是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族中的一員，由p38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)直接磷酸化激活[6-7]。已有研究證實(shí)，MK2在炎癥細(xì)胞因子的生物合成中起關(guān)鍵作用，如促炎癥細(xì)胞因子、趨化因子和黏附分子[8-9]。MK2的激活在各種疾病的炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵作用，包括腫瘤壞死、胰腺炎和術(shù)后腸梗阻[10-11]。局部應(yīng)用MK2抑制劑可通過抑制干眼的眼表面細(xì)胞凋亡和CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，有效地減輕眼表損傷[12]。MK2抑制劑可通過阻斷MK2的激活，選擇性地抑制堿燒傷所致的角膜炎癥[10]。然而，目前尚不清楚MK2抑制劑對(duì)BRVO的治療作用。因此，本研究通過建立BRVO大鼠模型，觀察MK2抑制劑PF-3644022對(duì)BRVO大鼠的治療效果及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑MK2抑制劑PF-3644022(上海MedChemExpress公司)；戊巴比妥鈉(美國Sigma公司)；速眠新Ⅱ(敦化市圣達(dá)動(dòng)物藥品有限公司)；孟加拉紅鈉鹽(成都艾科達(dá)試劑有限公司)；兔抗血管內(nèi)皮生長因子-α(VEGF-α)、MK2、p-MK2和GAPDH(英國Abcam公司)；Cy3標(biāo)記的羊抗兔IgG(H+L)熒光二抗和辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(武漢博士德生物工程有限公司)；BCA蛋白檢測試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)；PVDF膜(美國Millipore公司)；增強(qiáng)型ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物6～8周齡的SPF級(jí)健康成年雄性SD大鼠110只，體重180～220 g(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)。所有大鼠均在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室條件下飼養(yǎng)，室溫(23±3)℃，濕度40%～65%，光/暗周期12 h，不限制食物和水。

1.2 方法

1.2.1 BRVO模型大鼠的建立BRVO大鼠模型的建立參考文獻(xiàn)[13]。大鼠腹腔注射10 g·L-1戊巴比妥鈉3 mL·kg-1和50 μL速眠新Ⅱ進(jìn)行麻醉。將孟加拉紅鈉鹽(50 g·L-1)注入大鼠尾靜脈，大鼠右眼用托吡卡胺滴眼液散瞳，待孟加拉紅循環(huán)至視網(wǎng)膜靜脈后，對(duì)視網(wǎng)膜分支靜脈(距視神經(jīng)雙顳側(cè)3個(gè)視盤直徑)進(jìn)行激光光凝。能量：80 mW；持續(xù)時(shí)間：100 ms；光斑大?。?00 μm。可見血流向視盤處墜落，血管變黑，血流停滯。共光凝50個(gè)點(diǎn)。右眼為實(shí)驗(yàn)眼，左眼為正常對(duì)照眼。

1.2.2 動(dòng)物分組及給藥方法將BRVO模型大鼠隨機(jī)分為5組(n=12)：對(duì)照組、模型組、低劑量組、中劑量組和高劑量組。低、中和高劑量組大鼠分別按1 mg·kg-1、5 mg·kg-1、10 mg·kg-1給予2 mL的MK2抑制劑PF-3644022灌胃，模型組大鼠給予2 mL生理鹽水灌胃，對(duì)照組大鼠給予2 mL蒸餾水灌胃。在實(shí)驗(yàn)期間，沒有觀察到任何因MK2抑制劑PF-3644022引起的大鼠臨床毒性跡象。治療后1 d、7 d和14 d進(jìn)行大鼠眼功能和形態(tài)學(xué)檢查。

1.2.3 光學(xué)相干斷層掃描和熒光素眼底血管造影檢查各組大鼠眼底情況各組大鼠分別在治療后1 d、7 d和14 d進(jìn)行光學(xué)相干斷層掃描(OCT)，右眼用5 g·L-1托吡卡胺散瞳，以視盤和激光光凝點(diǎn)為中心進(jìn)行OCT檢查。使用Opto-RIS視網(wǎng)膜成像系統(tǒng)和44D-ISOCT眼科超顯微成像系統(tǒng)捕捉眼底和OCT圖像。另外，分別在治療1 d、7 d和14 d進(jìn)行熒光素眼底血管造影(FFA)。大鼠散瞳后按2 mL·kg-1腹腔注射100 g·L-1熒光素鈉注射液，通過眼底熒光造影儀以視盤和激光光凝點(diǎn)為中心對(duì)大鼠右眼行FFA檢查。

1.2.4 HE染色觀察各組大鼠視網(wǎng)膜組織治療后1 d和21 d，將各組大鼠(n=6)采用頸椎脫臼法處死，快速摘除大鼠眼球。用于組織學(xué)分析的眼球用40 g·L-1多聚甲醛在4 ℃下固定至少48 h，石蠟包埋，然后切成5 μm厚切片，進(jìn)行HE染色，使用奧林巴斯DP71光學(xué)顯微鏡拍攝圖像。

1.2.5 免疫熒光染色觀察各組大鼠視網(wǎng)膜組織取1.2.3部分大鼠眼球切片，然后脫蠟脫水，用體積分?jǐn)?shù)3% H2O2孵育10 min阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性。切片用PBS(pH 7.2)室溫洗滌3次。用體積分?jǐn)?shù)10%山羊血清孵育1 h，然后將切片與兔抗VEGF-A(1200)一抗在4 ℃孵育過夜。然后用PBS洗滌3次，與Cy3標(biāo)記的羊抗兔IgG(H+L)熒光二抗(1200)室溫孵育1 h。PBS洗滌3次后，用DAPI染色細(xì)胞核。奧林巴斯BX53熒光顯微鏡下觀察并獲取圖像。

1.2.6 Western blot檢測各組大鼠視網(wǎng)膜中不同基因蛋白表達(dá)治療后1 d和21 d，收集大鼠眼球視網(wǎng)膜組織，并在添加有蛋白酶/磷酸酶抑制劑的RIPA緩沖液中裂解，裂解產(chǎn)物在4 ℃下以12 000 r·min-1離心15 min，取上清液。采用BCA蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度。30 μg蛋白質(zhì)在120 g·L-1SDS-PAGE電泳分離。將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。將膜與50 g·L-1脫脂奶粉室溫孵育2 h后，分別與MK2(12000)、p-MK2(12000)、VEGF-α(11000)和GAPDH(11000)4 ℃孵育過夜。將膜與辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(12000)在室溫下孵育1 h，然后用增強(qiáng)型ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒進(jìn)行蛋白顯影。GAPDH作為內(nèi)參蛋白。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。所有數(shù)據(jù)先行正態(tài)分布檢驗(yàn)，然后進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)及LSD事后檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組BRVO大鼠眼底照相、FFA和OCT檢查結(jié)果眼底照相結(jié)果顯示，治療后1 d，模型組、低劑量組、中劑量組和高劑量組大鼠眼底水腫、視網(wǎng)膜變白、血管排列紊亂、收縮、視盤陷凹消失。隨著治療時(shí)間的延長，低劑量組、中劑量組和高劑量組大鼠眼底水腫逐漸減輕、視網(wǎng)膜蒼白減少、血管彎曲減輕、視盤陷凹恢復(fù)，且不同時(shí)期的恢復(fù)效果均好于模型組。FFA檢查結(jié)果顯示，治療后1 d，模型組、低劑量組、中劑量組和高劑量組大鼠眼底血管擴(kuò)張彎曲嚴(yán)重、部分血管不完整；治療后14 d，各組大鼠眼底血管彎曲現(xiàn)象均逐漸緩解，并且低劑量組、中劑量組和高劑量組大鼠眼底血管彎曲現(xiàn)象緩解程度明顯高于模型組。OCT檢查結(jié)果顯示，治療后1 d和14 d，與模型組相比，低劑量組、中劑量組和高劑量組大鼠眼底損傷處視網(wǎng)膜厚度以及損傷250 μm 處視網(wǎng)膜厚度均顯著降低，并呈劑量依賴性降低(均為P<0.05)(表1)。

表1 各組 BRVO大鼠治療后14 d視網(wǎng)膜厚度

2.2 MK2抑制劑對(duì)BRVO大鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)的影響治療后1 d，與對(duì)照組大鼠相比，模型組、低劑量組、中劑量組和高劑量組大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)核層和外核層厚度明顯增加，視網(wǎng)膜光凝部位在治療后1 d已經(jīng)完全紊亂。治療后21 d，與對(duì)照組大鼠相比，模型組、低劑量組、中劑量組和高劑量組大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)核層和外核層厚度明顯減小，視網(wǎng)膜光凝部位基本恢復(fù)正常(圖1)。

圖1 各組 BRVO大鼠視網(wǎng)膜HE染色結(jié)果

2.3 MK2抑制劑對(duì)各組BRVO大鼠視網(wǎng)膜組織中VEGF-α表達(dá)的影響治療后1 d，與模型組相比，低劑量組、中劑量組和高劑量組大鼠視網(wǎng)膜組織中VEGF-α的相對(duì)熒光強(qiáng)度和蛋白表達(dá)水平均顯著降低，并呈劑量依賴性降低(均為P<0.05)。治療后21 d，各組大鼠視網(wǎng)膜組織中VEGF-α的相對(duì)熒光強(qiáng)度和蛋白表達(dá)水平均無明顯差異(均為P>0.05)(圖2、表2和表3)。

圖2 BRVO大鼠視網(wǎng)膜組織中VEGF-α的免疫熒光染色 A：治療后1 d；B：治療后21 d

表2 各組BRVO大鼠視網(wǎng)膜組織中VEGF-α的相對(duì)熒光強(qiáng)度

表3 各組BRVO大鼠視網(wǎng)膜組織中VEGF-α蛋白相對(duì)表達(dá)水平

2.4 MK2抑制劑對(duì)各組BRVO大鼠視網(wǎng)膜組織中MK2活性的影響Western blot檢測結(jié)果顯示，治療后1 d、21 d，與模型組相比，低劑量組、中劑量組和高劑量組大鼠視網(wǎng)膜組織中MK2磷酸化水平均顯著降低，并呈劑量依賴性降低(均為P<0.05)(表4)。

3 討論

BRVO是一種常見的眼科疾病，嚴(yán)重?fù)p害患者視力，且患病率隨患者年齡增加而增大，給社會(huì)帶來了極大負(fù)擔(dān)。為了探討B(tài)RVO的進(jìn)展和視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)和功能的變化，迫切需要一種合適的BRVO動(dòng)物模型。建立BRVO動(dòng)物模型的方法有幾種，包括手術(shù)干預(yù)、凝血酶玻璃體內(nèi)注射和激光光凝[14-15]。早期的激光光凝方法沒有模擬視網(wǎng)膜水腫或視網(wǎng)膜無灌注區(qū)。本研究中使用了一種改良的激光光凝。首先，選擇了一條大小合適的靜脈作為靶點(diǎn)，以避免嚴(yán)重的損傷，并確保靜脈迅速再通；其次，選擇了功率80 mW、持續(xù)時(shí)間100 ms、光斑大小100 μm作為合適的參數(shù)，成功建立了BRVO模型大鼠。應(yīng)用MK2抑制劑PF-3644022治療BRVO大鼠21 d，HE染色、眼底照相、FFA和OCT檢查結(jié)果均證實(shí)，MK2抑制劑以劑量依賴性方式減輕了大鼠視網(wǎng)膜水腫、血管排列紊亂和收縮、視盤陷凹消失等病理現(xiàn)象，提示MK2抑制劑PF-3644022是一種潛在的治療BRVO藥物。

目前，抗VEGF-α治療是治療BRVO的有效手段。然而，VEGF治療的效果與阻塞部位、干預(yù)時(shí)間、間隔時(shí)間以及個(gè)體特異性有關(guān)[16]。VEGF-α在不同階段發(fā)揮不同的作用，在發(fā)病初期不利于新生血管的生長，在后期有利于自我愈合[17-18]。在本研究中，免疫熒光染色和Western blot檢測結(jié)果均顯示，治療后1 d，MK2抑制劑PF-3644022以劑量依賴性方式抑制BRVO大鼠視網(wǎng)膜組織中VEGF-α的表達(dá)；然而，治療后21 d，各組大鼠視網(wǎng)膜組織中VEGF-α的表達(dá)均無明顯差異(均為P>0.05)。以上結(jié)果提示，MK2抑制劑在BRVO早期階段(即阻塞后1 d)通過抑制VEGF-α的表達(dá)來改善血管生成，抑制血管紊亂。而在BRVO的晚期階段(即阻塞后21 d)，MK2抑制劑未影響VEGF-α的表達(dá)，從而有助于重建側(cè)支循環(huán)，使阻塞的視網(wǎng)膜血管再通。MK2抑制劑可能通過調(diào)節(jié)VEGF-α的表達(dá)來控制BRVO不同階段的血管生成和再通。值得注意的是，雖然抗VEGF是治療BRVO的重要手段，但并非唯一手段。本研究中MK2抑制劑調(diào)節(jié)了VEGF-α的表達(dá)并改善了BRVO，但MK2抑制劑是否還通過其他途徑治療BRVO尚未可知，有待于進(jìn)一步研究。

BRVO引起的缺血缺氧的微環(huán)境可導(dǎo)致膠質(zhì)細(xì)胞激活和細(xì)胞因子釋放，從而促進(jìn)黃斑水腫形成[19]。研究表明，炎癥在BRVO發(fā)病中具有重要作用[20]，抗炎治療在BRVO防治中具有非常重要的作用[21]。免疫細(xì)胞中p38激酶通路的激活導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)。MK2是p38激酶的直接下游底物，通過調(diào)節(jié)脂多糖刺激的TNF-α和IL-6的穩(wěn)定性和翻譯來調(diào)節(jié)這些mRNA的產(chǎn)生。還有學(xué)者報(bào)道，MK2抑制劑PF-3644022對(duì)TNF-α的產(chǎn)生具有類似的抑制作用，PF-3644022可阻斷脂多糖刺激的人全血中TNF-α和IL-6的產(chǎn)生[22]。本研究Western blot結(jié)果顯示，治療后1 d和21 d，MK2抑制劑以劑量依賴性方式抑制BRVO大鼠視網(wǎng)膜組織中MK2的磷酸化。這些結(jié)果提示，MK2抑制劑對(duì)BRVO的治療作用可能與其本身的抗炎功能有關(guān)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，MK2抑制劑PF-3644022通過減輕BRVO模型大鼠視網(wǎng)膜水腫、調(diào)節(jié)VEGF-α的表達(dá)、抑制MK2活性等作用對(duì)BRVO動(dòng)物模型發(fā)揮治療作用。MK2抑制劑PF-3644022可能是治療BRVO的具有較高應(yīng)用價(jià)值的藥物。