從某核衣殼抑制劑臨床試驗(yàn)結(jié)果看慢性乙肝抗病毒治療評(píng)價(jià)指標(biāo)選擇的重要性

李桂馨， 劉 慧， 姜倩倩， 陳紅松， 魯鳳民

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)是慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)的主要致病因素。目前，全球慢性HBV感染者高達(dá)2.96億。若不及時(shí)進(jìn)行有效的抗病毒治療，有15%～40%的CHB患者可進(jìn)展至肝硬化、肝細(xì)胞癌等終末期肝病[1-2]。目前，臨床用于治療慢性HBV感染的藥物包括核苷(酸)類(lèi)似物[nucleos(t)ide analogues，NAs]與長(zhǎng)效干擾素，這兩種藥物均可顯著減緩疾病進(jìn)展，有效減少終末期肝病的發(fā)生。其中，NAs強(qiáng)效抑制HBV復(fù)制，可快速降低患者體內(nèi)HBV DNA水平，且口服方便，在臨床上被廣泛使用。但由于停藥后易出現(xiàn)病毒反彈及疾病復(fù)發(fā)，接受NAs治療的患者往往需要長(zhǎng)期甚至終生服藥；而長(zhǎng)效干擾素類(lèi)藥物，盡管抑制病毒復(fù)制的能力相對(duì)較弱，但在一些病毒載量特別是血清表面抗原(hepatitis B surface antigen，HBsAg)較低的優(yōu)勢(shì)人群，可顯著提高臨床治愈[3]。但由于存在引發(fā)患者出現(xiàn)不同程度副作用的風(fēng)險(xiǎn)，臨床上對(duì)長(zhǎng)效干擾素的使用往往采取有限療程的策略。更為重要的是，二者均無(wú)法清除或持續(xù)靜默HBV轉(zhuǎn)錄模板共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(covalently closed circular DNA，cccDNA)[4]。因此，針對(duì)HBV復(fù)制不同環(huán)節(jié)的抗病毒新藥的研發(fā)顯得尤為重要。

1 HBV生命周期概述

在HBV Dane顆粒感染肝細(xì)胞的過(guò)程中，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的核衣殼脫去包膜并被轉(zhuǎn)運(yùn)到核孔復(fù)合體附近，核衣殼因主動(dòng)或被動(dòng)變構(gòu)被打開(kāi)，所含的基因組松弛環(huán)狀DNA(relaxed circular DNA，rcDNA)隨即被遞送進(jìn)細(xì)胞核內(nèi)，經(jīng)宿主DNA修復(fù)系統(tǒng)形成cccDNA，建立感染。作為復(fù)制模板的cccDNA可轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生包括前基因組RNA(pregenomic RNA，pgRNA)在內(nèi)的病毒RNA，其中pgRNA作為典型的雙順?lè)醋咏Y(jié)構(gòu)，是翻譯產(chǎn)生核心蛋白(HBV core，HBc)和病毒聚合酶(polymerase，P)蛋白的信使RNA(mRNA)。翻譯產(chǎn)生的P蛋白隨即與其轉(zhuǎn)錄模板pgRNA結(jié)合形成復(fù)合物[5]，并招募二聚體化的核心蛋白通過(guò)相鄰二聚體界面疏水相互作用最終組裝成正二十面體的核衣殼。在核衣殼內(nèi)部，pgRNA被P蛋白逆轉(zhuǎn)錄為rcDNA，含rcDNA的核衣殼即成為成熟的核衣殼，后者或獲得包膜形成Dane顆粒釋放至細(xì)胞外，開(kāi)始下一個(gè)循環(huán)，或重新被運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞核內(nèi)以回補(bǔ)cccDNA池[6](見(jiàn)圖1)。由此可見(jiàn)，無(wú)論是在從頭感染過(guò)程中，還是新合成的攜帶rcDNA的核衣殼，其在特定的空間位置被有序地打開(kāi)以釋放rcDNA入核，或精細(xì)地組裝成包裹P蛋白/pgRNA復(fù)合物的核衣殼，對(duì)于有效建立感染和病毒的持續(xù)復(fù)制都是至關(guān)重要的。

圖1 乙型肝炎病毒生命周期示意圖[7]

2 核衣殼抑制劑作用機(jī)制

如前所述，核衣殼在病毒基因組包裝、提供逆轉(zhuǎn)錄場(chǎng)所、胞內(nèi)運(yùn)輸及維持cccDNA池穩(wěn)定等病毒生命周期的多個(gè)環(huán)節(jié)均有重要作用[8]。鑒于核衣殼在HBV復(fù)制中的多重作用，研發(fā)人員已將其作為重要的直接抗病毒靶點(diǎn)，并相應(yīng)研發(fā)出一類(lèi)代表性藥物核心蛋白變構(gòu)調(diào)節(jié)劑(core protein allosteric modulators，CpAMs)。CpAMs可干擾正常核衣殼形成從而抑制pgRNA包裝及隨后的HBV DNA復(fù)制；也可作用于已包裝的成熟核衣殼，誘導(dǎo)其變構(gòu)或錯(cuò)誤解聚，導(dǎo)致rcDNA無(wú)法被精準(zhǔn)遞送至細(xì)胞核，最終抑制cccDNA合成[9-10]。另外，少量文獻(xiàn)也已發(fā)現(xiàn)CpAMs還具有直接降低HBV e抗原(HBV e antigen,HBeAg)的作用[11-12]。目前，已有多種不同結(jié)構(gòu)類(lèi)型的CpAMs處于臨床研發(fā)階段(見(jiàn)表1)。

表1 CpAMs臨床試驗(yàn)總結(jié)

表1中的ABI-H0731由Assembly Biosciences公司開(kāi)發(fā)[13]，其展示的作用機(jī)制主要包括：(1)干擾核衣殼有效包裹pgRNA/P蛋白復(fù)合物，進(jìn)而導(dǎo)致rcDNA無(wú)法被合成，最終抑制Dane顆粒合成及釋放。但須注意的是，該作用同樣也顯著抑制了HBV RNA病毒樣顆粒的釋放。(2)抑制從頭感染后肝細(xì)胞內(nèi)脫去包膜的成熟核衣殼的正確解聚，干擾rcDNA的遞送入核及后續(xù)cccDNA形成，直接導(dǎo)致感染無(wú)法建立。(3)對(duì)于已建立感染的肝細(xì)胞，其對(duì)子代新合成rcDNA的抑制將使cccDNA貯存池的補(bǔ)充難以為繼，長(zhǎng)期用藥可能使cccDNA耗竭(見(jiàn)圖2)。CpAMs的這些作用使其成為備受關(guān)注的在研直接抗乙肝病毒藥物，并被人們寄予極大的希望。

圖2 核衣殼抑制劑ABI-H0731作用機(jī)制圖[引自EASL 2021(PO-482)][13]

3 NAs治療下HBV RNA可反映cccDNA轉(zhuǎn)錄活性并作為安全停藥評(píng)價(jià)指標(biāo)

2017年，Lok等[14]歐美專(zhuān)家在共識(shí)中提出了“部分治愈”(partial cure)的概念。這一概念隨后于英國(guó)倫敦召開(kāi)的“2019歐洲肝病研究協(xié)會(huì)-美國(guó)肝病研究協(xié)會(huì)HBV治療終點(diǎn)會(huì)議”上被再次強(qiáng)調(diào)。所謂部分治愈，是指接受NAs治療的患者雖仍能檢測(cè)到HBsAg，但其HBV DNA水平低于靈敏試劑檢測(cè)下限并在停藥后仍能維持HBV DNA不反彈、ALT水平正常。但由于需要停藥觀察才能知道哪部分CHB患者達(dá)到了“部分治愈”。為減少停藥后疾病復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)，各大主流指南均推薦在患者血清HBV DNA低于檢測(cè)下限12～36個(gè)月甚至更長(zhǎng)時(shí)間的鞏固治療后才停藥，以提高停藥的安全性[15-17]。然而，即便嚴(yán)格遵循指南的指導(dǎo)意見(jiàn)，仍有相當(dāng)比例的患者在停藥后出現(xiàn)病毒學(xué)反彈，甚至發(fā)生暴發(fā)性肝炎。其原因在于NAs作用于核衣殼內(nèi)以pgRNA為模板的逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程，通過(guò)與細(xì)胞內(nèi)的脫氧核糖核苷酸競(jìng)爭(zhēng)性摻入并不可逆地阻斷rcDNA負(fù)鏈合成[18]，從而使得患者的血清HBV DNA很快低于檢測(cè)下限。但此時(shí)cccDNA仍可有活躍轉(zhuǎn)錄，因此，臨床上以血清HBV DNA“消失”作為NAs安全停藥的指標(biāo)并不恰當(dāng)。近年來(lái)一些研究也已證實(shí)，HBV復(fù)制過(guò)程中，部分被核衣殼包裹但未經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄的HBV pgRNA也可獲得包膜，進(jìn)而形成RNA病毒樣顆粒并被釋放至血清中[19-20]。并且，當(dāng)NAs阻斷以pgRNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成rcDNA時(shí)，核衣殼包裹的處于NAs作用下的殘余HBV pgRNA將以HBV RNA病毒樣顆粒的形式釋放入血循環(huán)[19]。因此，升高的血清HBV RNA水平可反映宿主肝細(xì)胞內(nèi)cccDNA的轉(zhuǎn)錄活躍狀態(tài)。對(duì)比而言，此時(shí)患者血清HBV DNA的“消失”僅僅代表NAs阻斷HBV DNA復(fù)制的有效性，并不代表cccDNA的耗竭或轉(zhuǎn)錄靜默，而決定停藥后病毒學(xué)反彈和臨床復(fù)發(fā)的原因是感染肝細(xì)胞核內(nèi)有轉(zhuǎn)錄活性的cccDNA的存在。因此，在后續(xù)的研究中以HBV DNA和RNA雙檢測(cè)陰性作為鞏固治療后NAs停藥的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)[21]，使得NAs的安全停藥得到了保證。血清HBV RNA作為反映cccDNA活躍轉(zhuǎn)錄的血清學(xué)指標(biāo)也被寫(xiě)入歐美國(guó)家及我國(guó)的新版指南中[15-17]。

4 核衣殼抑制劑臨床試驗(yàn)結(jié)果解讀及藥物評(píng)價(jià)指標(biāo)選擇的重要性

截至目前，ABI-H0731是臨床試驗(yàn)進(jìn)展最快的核衣殼抑制劑之一，已經(jīng)完成臨床 Ⅱ 期研究，其公布的201研究共招募了47例HBeAg(+)及26例HBeAg(-)的NAs經(jīng)治CHB患者，分別進(jìn)行NAs聯(lián)合ABI-H0731或NAs聯(lián)合安慰劑治療。該項(xiàng)研究結(jié)果顯示，相較于聯(lián)合安慰劑治療，NAs聯(lián)合ABI-H0731治療24周后，更多的經(jīng)治患者達(dá)到病毒學(xué)應(yīng)答[HBeAg(-)：94% vs 70%；HBeAg(+)：83% vs 29%]。其公布的202研究招募了25例HBeAg(+)的初治CHB患者，研究結(jié)果顯示，相較于聯(lián)合安慰劑治療，恩替卡韋(entecavir，ETV)聯(lián)合ABI-H0731治療24周后患者的HBV DNA、HBV pgRNA水平明顯降低、ALT復(fù)常率明顯升高。這些結(jié)果說(shuō)明聯(lián)合ABI-H0731可在單用NAs基礎(chǔ)上進(jìn)一步抑制病毒復(fù)制，發(fā)揮抗病毒作用。在后續(xù)的研究中，為進(jìn)一步評(píng)價(jià)NAs聯(lián)用ABI-H0731是否可實(shí)現(xiàn)持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答，上述201及202研究所有患者均開(kāi)放標(biāo)簽進(jìn)行NAs聯(lián)合ABI-H0731至少治療24周，之后每4周對(duì)患者進(jìn)行評(píng)估，如果HBV DNA+pgRNA低于檢測(cè)下限并且HBeAg轉(zhuǎn)陰或≤5 IU/ml，即停止治療，否則，繼續(xù)治療。在202研究中，患者在入組后持續(xù)治療72周時(shí)間內(nèi)，雖然HBV DNA及pgRNA水平持續(xù)下降，但均未低于檢測(cè)下限。201研究中，最終共23例基線(xiàn)HBeAg(-)患者及18例基線(xiàn)HBeAg(+)患者達(dá)到停止治療標(biāo)準(zhǔn)停藥，并進(jìn)行了持續(xù)隨訪(fǎng)。然而隨后的數(shù)據(jù)表明，基線(xiàn)HBeAg(-)患者在停止治療后16周內(nèi)全部復(fù)發(fā)，基線(xiàn)HBeAg(+)患者在隨訪(fǎng)12周內(nèi)全部復(fù)發(fā)，Assembly Biosciences公司也因此于2021年9月份因該藥的Ⅱ期臨床研究未達(dá)到其預(yù)期的停藥終點(diǎn)而遺憾地宣告終止。另外兩種在研核衣殼抑制劑NVR3-778、JNJ56136379被報(bào)道可明顯降低HBV DNA及RNA水平，且下降具有相似的動(dòng)力學(xué)，但以血清中HBV DNA、HBV RNA作為患者病毒學(xué)應(yīng)答的評(píng)價(jià)指標(biāo)并停藥后，部分患者血清HBV DNA及RNA水平均出現(xiàn)反彈，甚至達(dá)到了基線(xiàn)水平[22-23]。CpAMs可干擾衣殼蛋白對(duì)pgRNA的包裝環(huán)節(jié)。因此，理論上ABI-H0731等CpAMs不僅可直接抑制上清中HBV DNA的水平，由于CpAMs同樣抑制了pgRNA包裹入核衣殼，從而也抑制了血清中HBV RNA的水平，這意味著在CpAMs治療下血清HBV DNA和(或)pgRNA水平均不能再反映患者cccDNA的轉(zhuǎn)錄活性，這可能也是本研究中ABI-H0731以HBV DNA+pgRNA聯(lián)合作為患者停藥標(biāo)準(zhǔn)卻導(dǎo)致所有患者停藥后病毒學(xué)反彈的主要原因。

5 核衣殼抑制劑臨床試驗(yàn)及藥物評(píng)價(jià)指標(biāo)新建議

這些臨床試驗(yàn)的結(jié)果，使我們注意到CpAMs在臨床試驗(yàn)中如何選擇合適的病毒學(xué)指標(biāo)作為其合理停藥標(biāo)準(zhǔn)這一現(xiàn)實(shí)問(wèn)題。目前，僅有肝活檢可準(zhǔn)確監(jiān)測(cè)肝內(nèi)cccDNA水平，但其有創(chuàng)性及操作后可能出現(xiàn)的并發(fā)癥限制了在常規(guī)臨床實(shí)踐中的應(yīng)用。除HBV DNA和HBV RNA外，來(lái)源于cccDNA的其他病毒產(chǎn)物，還包括HBsAg及乙型肝炎核心相關(guān)抗原(hepatitis B core-related antigen，HBcrAg)。但由于HBsAg可來(lái)源于HBV基因組整合，此時(shí)HBsAg水平與cccDNA的相關(guān)性較差，因此并不能準(zhǔn)確反映cccDNA的轉(zhuǎn)錄活性[24]。HBcrAg包括HBV核心抗原(HBV core antigen，HBcAg)、HBeAg及22 kDa的前核心蛋白(22 kDa precore protein，P22cr)，在CHB患者中，HBcrAg與cccDNA轉(zhuǎn)錄活性密切相關(guān)[25-26]。從作用機(jī)制上，CpAMs可分為誘導(dǎo)異常組裝的衣殼的形成(Ⅰ類(lèi)，雜芳基二氫吡啶類(lèi))或正常組裝的空衣殼形成(Ⅱ類(lèi)，苯丙酰胺類(lèi)及氨磺酰類(lèi))。前者通常在細(xì)胞內(nèi)降解，后者雖可釋放，但由于沒(méi)有病毒核酸，不具備感染性[9，27-28]。因此，我們推測(cè)，對(duì)于Ⅱ類(lèi)CpAMs，血清HBcrAg消失或許能較好反映cccDNA轉(zhuǎn)錄靜默。據(jù)報(bào)道，通過(guò)熒光的生化衣殼組裝實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ABI-H0731干預(yù)后快速產(chǎn)生了空衣殼結(jié)構(gòu)，且未出現(xiàn)HBc降解，屬于Ⅱ類(lèi)CpAMs[29]。因此，基于其藥物作用機(jī)制，我們建議在臨床試驗(yàn)中，血清HBV DNA及HBV RNA聯(lián)用血清HBcrAg陰性作為停藥指標(biāo)，以提高停藥的安全性，但仍需要高質(zhì)量臨床研究進(jìn)一步驗(yàn)證。而對(duì)于Ⅰ類(lèi)CpAMs，由于其會(huì)組裝成異常衣殼并在胞內(nèi)降解，此情況下血清HBcrAg是否還能準(zhǔn)確地反映cccDNA轉(zhuǎn)錄活性存疑，未來(lái)應(yīng)考慮與其他血清學(xué)指標(biāo)聯(lián)用來(lái)進(jìn)一步降低停藥后病毒學(xué)反彈的風(fēng)險(xiǎn)。

6 結(jié)語(yǔ)

目前，乙肝新藥的研發(fā)如火如荼，上述臨床研究案例提示我們，在不同機(jī)制的抗病毒藥物治療下，如何選用合適的指標(biāo)還需謹(jǐn)慎全面地進(jìn)一步總結(jié)。