亞胺培南作用下的大腸埃希菌膜滲透性改變的分子機(jī)制研究*

何建春，楊 雷，趙峻英，董 劍，王 丹，裴昌貞

(重慶市大足區(qū)人民醫(yī)院：1.檢驗(yàn)科；2.睡眠心身中心 402360)

大腸埃希菌是臨床最常見的條件致病菌，根據(jù)中國CHINET數(shù)據(jù)顯示，其分離率一直居所有監(jiān)測(cè)菌的首位。隨著抗生素的廣泛使用，產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(extended-spectrum β-lactamases,ESBLs)大腸埃希菌的分離率也越來越高[1-2]。碳青霉烯類抗生素一直被認(rèn)為是治療該類菌株引發(fā)感染最有效的抗生素。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道亞胺培南(imipenem,IPM)是碳青霉烯類抗生素中使用頻率最高且效果最好的抗生素之一[3-5]。而在臨床治療過程中，很多時(shí)候由于感染灶不明確、患者個(gè)體藥物吸收差異等原因使得IPM到達(dá)感染灶的劑量不足，導(dǎo)致臨床治療失敗。在IPM作用于大腸埃希菌時(shí)，大腸埃希菌為了生存，主要通過什么途徑來防御IPM的殺滅作用，膜孔蛋白和外排泵各自是否產(chǎn)生作用，到目前為止還不清楚，值得深入研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性收集大足區(qū)人民醫(yī)院2019年1—6月痰液、血液、尿液等標(biāo)本中首次分離的大腸埃希菌共16株，先分別選擇2株非產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶大腸埃希菌、2株產(chǎn)ESBLs酶大腸埃希菌、2株產(chǎn)AmpC酶大腸埃希菌、2株產(chǎn)ESBLs酶+AmpC酶的大腸埃希菌共8株，進(jìn)行膜孔蛋白和外排泵差異基因的篩選。再按照上述選菌方式再選擇8株大腸埃希菌進(jìn)行差異基因的驗(yàn)證。

1.2 方法

1.2.1菌株鑒定及最低抑菌濃度(MIC)值

根據(jù)第4版《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》進(jìn)行微生物樣本的培養(yǎng)和純化，然后通過Vitek 2 Compact系統(tǒng)進(jìn)行菌株鑒定及藥敏測(cè)定，并依據(jù)CLSI M100-S29進(jìn)行結(jié)果判讀。

1.2.2微量肉湯稀釋法

依據(jù)CLSI推薦的方法進(jìn)行MIC值測(cè)定，配制好相應(yīng)濃度的抗生素溶液和菌懸液，分別加入96孔板中，并設(shè)定陽性和陰性對(duì)照，孵育18～24 h后進(jìn)行結(jié)果判讀。

1.2.3ESBLs確證實(shí)驗(yàn)和ampC酶篩選實(shí)驗(yàn)

ESBLs確證實(shí)驗(yàn)[6]：選取Vitek 2 Compact初篩為產(chǎn)ESBLs的大腸埃希菌，然后選擇藥敏紙片頭孢他啶(30 μg)、頭孢他啶/克拉維酸(30/10 μg)、頭孢噻肟(30 μg)和頭孢噻肟/克拉維酸(30/10 μg)完成紙片擴(kuò)散法實(shí)驗(yàn)，若頭孢他啶/頭孢噻肟加克拉維酸與不加克拉維酸的抑菌圈直徑之差大于或等于5 mm，則為產(chǎn)ESBLs。

ampC酶篩選實(shí)驗(yàn)[7]：運(yùn)用K-B紙片擴(kuò)散法，貼上FOX藥敏紙片，若FOX抑菌圈直徑小于或等于18 mm則初步判定為產(chǎn)ampC酶。大腸埃希菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25922作為陰性對(duì)照。

1.2.4ESBLs基因和ampC基因的PCR擴(kuò)增

利用PCR法檢測(cè)ESBLs基因(blaCTX-M、blaTEM和blaSHV)和ampC基因(blaDHA、blaEBC、blaCIT、blaACC、blaMOX 和blaFOX)。反應(yīng)中所需引物序列和反應(yīng)條件參考文獻(xiàn)[7]。

1.2.5IPM進(jìn)行菌株誘導(dǎo)

菌株誘導(dǎo)參考孫坤玲[8]的研究：按照說明書配制新鮮無菌LB肉湯，并配置相應(yīng)濃度的IPM抗生素溶液加入上述LB肉湯中，得到含IPM的LB肉湯。再將本實(shí)驗(yàn)的8株新鮮菌分別用無菌LB肉湯進(jìn)行比濁，加入上述含有抗生素的LB肉湯中，最終使實(shí)驗(yàn)菌在3/4 MIC值(亞抑菌濃度)的含IPM的LB培養(yǎng)基中生長，37 ℃搖床中培養(yǎng)8 h。

1.2.6RT-qPCR方法

將實(shí)驗(yàn)的8株原始菌和誘導(dǎo)8 h后的菌分別進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)基因表達(dá)量，檢測(cè)的基因包括膜孔蛋白基因(ompF和ompC)、外排泵基因(acrA、acrB、tolC、macB和emrA)和外排泵調(diào)控基因(marA)。最后將上述差異基因在另外8株菌中進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)驗(yàn)證，驗(yàn)證差異基因是否在所有菌中具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。其反應(yīng)所需引物序列和反應(yīng)條件參考文獻(xiàn)[9-10]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 菌株的基本特征

8株大腸埃希菌從標(biāo)本來源看：2株來源于痰標(biāo)本，2株來源于血液標(biāo)本，3株來源于尿液標(biāo)本，1株來源于膿液標(biāo)本。從產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶來看：2株不產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶，2株產(chǎn)ESBLs 菌株分別攜帶blaTEM和blaCTX-M，2株產(chǎn)ampC酶，2株產(chǎn)ESBLs酶+ampC酶。從MIC值來看：其對(duì)IPM的MIC值為0.125～1.0 μg/mL，對(duì)美羅培南(MEM)的MIC值為0.125～0.5 μg/mL和對(duì)厄他培南(ETP)的MIC值為0.125～0.5 μg/mL均為敏感，見表1 。

2.2 治療后菌株的特征

對(duì)比分析8株菌在IPM治療前后MIC值變化情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：對(duì)IPM的MIC值無變化的有1株菌，增加2倍的有4株菌，增加4倍的有3株菌。而對(duì)MEM的MIC值無變化的有3株菌，增加2倍的有4株菌，增加4倍的有1株菌。而對(duì)ETP的MIC值增加2倍的有3株菌，增加4倍的有1株菌，增加8倍的有4株菌。誘導(dǎo)后引起IPM、MEM和ETP的MIC值發(fā)生改變的百分比達(dá)到83.3%(20/24)。而從4種類型β-內(nèi)酰胺酶菌株誘導(dǎo)前后MIC變化情況來看，不產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶菌株基本保持不變，而只產(chǎn)ESBLs酶/ampC酶菌株有一定變化，變化最大的為產(chǎn)ESBLs酶+ampC酶菌株，見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)菌株的基本特征

2.3 治療前后菌株膜孔蛋白表達(dá)情況

對(duì)比分析8株菌在IPM治療前后膜孔蛋白o(hù)mpF和ompC表達(dá)量的變化情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與8株原始菌相比，誘導(dǎo)后菌株的ompC基因表達(dá)雖然均有不同程度的下調(diào)，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而對(duì)ompF基因來說，誘導(dǎo)后菌株的ompF基因表達(dá)也均有不同程度的下調(diào)，且有5株菌表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

圖1 IPM誘導(dǎo)對(duì)大腸埃希菌膜孔蛋白基因表達(dá)的影響

2.4 治療前后菌株外排泵基因表達(dá)情況

對(duì)比分析8株菌在IPM治療前后外排泵表達(dá)量變化情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與8株原始菌相比，絕大部分誘導(dǎo)菌外排泵基因表達(dá)有不同程度的上調(diào)，對(duì)tolC和acrB基因來說，除第1株不產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的菌差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，其余7株菌差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；對(duì)acrA基因來說，所有菌株的表達(dá)量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；對(duì)macB基因來說，所有菌株表達(dá)量差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；對(duì)emrA基因來說，僅有2株菌表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其余菌表達(dá)量差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖2。

圖2 IPM誘導(dǎo)對(duì)大腸埃希菌外排泵及調(diào)控基因表達(dá)的影響

2.5 菌株治療前后外排泵調(diào)控因子表達(dá)情況

對(duì)比分析8株菌在IPM治療前后外排泵調(diào)控因子表達(dá)量的變化情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與8株原始菌相比，誘導(dǎo)菌的marA基因表達(dá)雖然均有不同程度的上調(diào)，但第2、6和7共3株菌表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其余株菌差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，見圖2。

2.6 acrA和ompF基因表達(dá)在更多臨床菌株中的驗(yàn)證

進(jìn)一步分析acrA和ompF基因在16株臨床菌經(jīng)過IPM治療前后的表達(dá)差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：原始菌組與誘導(dǎo)菌組acrA基因的表達(dá)分別為1.00±0.36、2.36 ±0.58，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；ompF基因的表達(dá)為1.00±0.09、0.72±0.11，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖3。

圖3 IPM誘導(dǎo)對(duì)大腸埃希菌acrA和ompF基因表達(dá)的影響

3 討 論

大腸埃希菌是臨床所有分離菌株中檢出率最高的細(xì)菌[2]，由于產(chǎn)ESBLs酶，甚至產(chǎn)ampC酶、乙酰轉(zhuǎn)移酶和/或氨基糖苷類鈍化酶等產(chǎn)酶大腸埃希菌的廣泛出現(xiàn)，使得臨床使用大部分常見抗生素進(jìn)行抗感染治療均達(dá)不到理想效果[11]。此時(shí)，碳青霉烯類抗生素常常被臨床使用，雖然耐碳青霉烯類大腸埃希菌已經(jīng)出現(xiàn)，甚至達(dá)到了2%的檢出率[2]，但仍然是治療產(chǎn) ESBLs等酶大腸埃希菌最有效藥物。其中亞胺培南是碳青霉烯類抗生素中臨床使用率最高一種抗生素，也是第一個(gè)批準(zhǔn)上市的碳青霉烯類藥物[3,5]。因此，本研究首次實(shí)驗(yàn)并分析了在IPM作用下，大腸埃希菌膜孔蛋白和外排泵所產(chǎn)生的作用，從而為細(xì)菌和抗生素的相互作用機(jī)制提供依據(jù)，甚至新藥的研發(fā)提供幫助，并進(jìn)行如下討論分析。

從所選菌株是否產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶來看，實(shí)驗(yàn)菌中分別為2株不產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶、2株只產(chǎn)ESBLs酶 、 2株只產(chǎn)AmpC酶和2株共產(chǎn)ESBLs酶+AmpC酶菌，使得實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蚨嘟嵌扔^察分析大腸埃希菌在IPM治療下的膜孔蛋白和外排泵的變化。從IPM治療前后菌株的MIC值變化來看，不產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶菌基本保持不變，產(chǎn)生這種現(xiàn)象的可能原因是僅靠膜孔蛋白基因下調(diào)或者外排泵基因上調(diào)可能不足以引起碳青霉烯類抗生素有明顯變化。而只產(chǎn)ESBLs酶/AmpC酶菌有一定變化，變化最大的為產(chǎn)ESBLs酶+AmpC酶菌；其中又以ETP的MIC值變化最大，甚至有些治療后的菌達(dá)到了耐藥水平。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是DELPHINE等[12]研究發(fā)現(xiàn)的CTX-M型基因的高表達(dá)合并膜孔蛋白下調(diào)能夠引起ETP敏感性下降相關(guān)，也可能是部分研究者[13-14]發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)ESBLs酶和/或AmpC酶合并膜孔蛋白缺失或外排泵的高表達(dá)引起碳青霉烯耐藥相關(guān)。由于以上原因，相關(guān)研究[15]還建議在臨床治療產(chǎn)ESBLs酶和/或AmpC酶大腸埃希菌時(shí)，盡可能少用ETP治療。本研究還發(fā)現(xiàn)，在產(chǎn)ESBLs酶和/或AmpC酶大腸埃希菌中，IPM和MEM的MIC值也發(fā)生了變化，說明在臨床使用IPM治療的過程中，對(duì)于產(chǎn)ESBLs酶和/或AmpC酶大腸埃希菌，也需要合理用藥，否則很容易導(dǎo)致臨床抗感染治療失敗，甚至導(dǎo)致耐藥菌的出現(xiàn)。

從IPM治療前后菌的膜孔蛋白表達(dá)結(jié)果來看，ompC基因表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而ompF基因表達(dá)明顯下調(diào)，且大部分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究[16-17]表明，ompF是膜孔蛋白中最主要最重要的孔蛋白，大部分抗生素包括IPM進(jìn)入細(xì)菌需通過ompF，且膜孔蛋白o(hù)mpF的缺失能引起抗生素MIC值增高。而本研究第一次探討了在IPM誘導(dǎo)下，大腸埃希菌最開始為了適應(yīng)和生存在IPM環(huán)境中，細(xì)菌作出的其中一個(gè)重要的防御反應(yīng)為膜孔蛋白o(hù)mpF表達(dá)下調(diào)。從外排泵基因表達(dá)結(jié)果來看，本研究也第一次探究分析發(fā)現(xiàn)在IPM治療下，macB和emrA基因表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而外排泵tolC、acrA和acrB基因表達(dá)明顯增加，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明IPM也能夠誘導(dǎo)外排泵基因表達(dá)的改變，是大腸埃希菌作出的另一個(gè)重要防御反應(yīng)。相關(guān)研究[10,18]表明外排泵也是控制抗生素進(jìn)入細(xì)菌的重要因素，其中acrAB-tolC系統(tǒng)是目前為止最主要的與抗生素耐藥相關(guān)的外排泵系統(tǒng)。

總之，在IPM治療下，產(chǎn)ESBLs酶和/或ampC酶的大腸埃希菌更能引起對(duì)碳青霉烯類抗生素MIC值的增高，主要是通過膜孔蛋白o(hù)mpF基因表達(dá)下調(diào)和外排泵acrAB-tolC基因表達(dá)上調(diào)引起的。進(jìn)而能夠適應(yīng)碳青霉烯類抗生素，導(dǎo)致臨床抗感染治療失敗。因此，臨床應(yīng)當(dāng)合理使用IPM，以減少耐碳青霉烯類大腸埃希菌的流行。這也有助于理解大腸埃希菌最開始為了適應(yīng)和生存在IPM環(huán)境中，細(xì)菌作出的重要防御反應(yīng)。