熊果酸抗肝纖維化作用與Ang Ⅱ/AT1R 信號(hào)通路的相關(guān)性

陳 濤 劉 聰 萬(wàn)思哲 朱 萱▲

1.江西省撫州市第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科，江西撫州 344099；2.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，江西南昌 330006

肝纖維化是各種病因（如病毒、血吸蟲、酒精、非酒精性脂肪性肝炎、膽汁淤積、自身免疫性肝病等）引起肝損傷后細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）彌漫性過(guò)度沉積與瘢痕形成的病理過(guò)程，是肝臟對(duì)慢性損傷的病理修復(fù)反應(yīng)[1-2]。肝纖維化的持續(xù)發(fā)展最終可導(dǎo)致肝硬化甚至肝癌，嚴(yán)重危害人類健康[3-4]。Marcellin 等[5-6]研究發(fā)現(xiàn)，早期對(duì)肝纖維化進(jìn)行藥物干預(yù)可逆轉(zhuǎn)肝纖維化，從而降低死亡率。 在肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中，Ang Ⅱ被認(rèn)為是重要的促纖維化因子之一，Sahara 等[7]研究發(fā)現(xiàn)Ang Ⅱ可以通過(guò)作用于 AT1R，誘導(dǎo)I 型膠原的合成，從而促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。

中藥單體熊果酸（ursolic acid，UA）是一種五環(huán)三萜羧基酸類化合物，具有保護(hù)肝臟功能、抗菌、抗癌、抗氧化和抗炎等藥理活性[8-11]。 本課題組前期研究成果表明，UA 可能通過(guò)抑制NOX4/ROS 和RhoA/ROCK1信號(hào)通路，減少C57BL/6 野生型小鼠的肝臟內(nèi)膠原沉積[12]。因此，本研究將進(jìn)一步探討UA 減少肝臟內(nèi)膠原沉積是否與其抑制肝臟Ang Ⅱ/AT1R 信號(hào)通路有關(guān)，闡明UA 的抗肝纖維化分子機(jī)制，為其應(yīng)用于肝纖維化治療提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 UA（Sigma-Aldrich 公司）；培哚普利（MedChemExpress 公司）；血清谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、總膽紅素（total bilirubin，TBil）檢測(cè)試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技有限公司）；BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒（碧云天生物科技公司）；天狼星紅染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；4%的多聚甲醛固定液（北京索萊寶科技有限公司）；mRNA 引物（生工生物工程上海股份有限公司）；總RNA 提取試劑盒、cDNA 第一鏈合成試劑盒、熒光定量PCR 試劑盒(北京天根生化科技公司)；兔抗鼠Ang Ⅱ多克隆抗體（英國(guó)Abcam 公司）；兔抗鼠AT1R 多克隆抗體（英國(guó)Abcam 公司）、兔抗鼠Ⅰ型膠原蛋白（Collagen-Ⅰ）多克隆抗體（英國(guó)Abcam 公司）、兔抗鼠α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）多克隆抗體（英國(guó)Abcam 公司）；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（北京中杉金橋有限公司）；橄欖油（上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司）；脫脂奶粉（北京索萊寶科技有限公司）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 所有的SPF 級(jí)雄性純系8 周齡SD大鼠40 只均從南昌大學(xué)動(dòng)物科學(xué)部購(gòu)入，體重（200±10）g，將大鼠置于光照/暗循環(huán) 12 h/12 h，室溫（22±2）℃，濕度（55±5）%的環(huán)境中飼養(yǎng)，自由飲食和飲水。動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK（贛）2015-0001。 本實(shí)驗(yàn)符合國(guó)家及南昌大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心規(guī)定的倫理學(xué)要求。

1.2 方法

1.2.1 大鼠分組及處理 將40 只SD 大鼠隨機(jī)分為為對(duì)照組、模型組、培哚普利組、UA 干預(yù)組，每組10 只。對(duì)照組：橄欖油（2 ml/kg）灌胃 8 周，每周 2 次。 模型組：20%的四氯化碳（carbon tetrachloride，CCl4）溶液溶解于橄欖油中 2 ml/kg，灌胃 8 周，每周 2 次。 UA 干預(yù)組：CCl4溶液灌胃8 周，并在最后4 周同時(shí)給予UA，40 mg/（kg·d）灌胃。 培哚普利組：CCl4溶液灌胃 8 周，并在最后 6 周同時(shí)給予培哚普利，8 mg/（kg·d）灌胃。各組藥物處理結(jié)束72 h 后，每組大鼠在乙醚麻醉下，使用一次性真空采血管留取門脈血待用， 取下肝臟，留取部分新鮮肝臟組織待用， 將其余組織固定于4%多聚甲醛固定液中，常規(guī)脫水包埋。 本實(shí)驗(yàn)所有程序均按照美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院的《護(hù)理和使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物指南》[13]執(zhí)行。

1.2.2 HE 染色及天狼星紅染色 新鮮的大鼠肝臟組織用4%的多聚甲醛固定，進(jìn)行脫水和石蠟包埋處理，將控制切片厚度為6 μm，常規(guī)脫蠟。對(duì)切片使用蘇木精和伊紅染色， 中性樹膠封片， 顯微鏡下觀察， 采用METAVIR 評(píng)分系統(tǒng)[14]對(duì)切片進(jìn)行評(píng)分，共分為4 個(gè)纖維化等級(jí)，F(xiàn)0：無(wú)纖維化；F1：門脈區(qū)纖維面積增大，未見隔膜形成；F2：門脈區(qū)纖維面積增大，少數(shù)隔膜形成；F3：多發(fā)隔膜形成，無(wú)肝硬化；F4：肝硬化。天狼星紅染色液滴染1 h，Mayer 蘇木精染色液染細(xì)胞核8 min，流水沖洗10 min。常規(guī)脫水透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察肝臟內(nèi)膠原沉積。

1.2.3 大鼠 AST、ALT、TBil 測(cè)定 在酶標(biāo)板中加入100 μl 標(biāo)準(zhǔn)品或者待測(cè)樣品，37℃孵育 90 min； 棄掉板內(nèi)液體后，每孔加入100 μl 生物素抗體工作液，37℃孵育 60 min；洗滌 3 次后，每孔加入 100 μl HRP 酶結(jié)合物工作液，37℃孵育30 min；棄掉板內(nèi)液體，洗板5次，每孔加入 90 μl 底物溶液，37℃孵育 15 min；每孔加入50 μl 終止液終止反應(yīng)，隨后在450 nm 波長(zhǎng)下測(cè)量各孔的光密度（optical density，OD）值并處理數(shù)據(jù)。

1.2.4 Ang Ⅱ、AT1R、Collagen Ⅰ及 α-SMA mRNA表達(dá)的檢測(cè) 分別從四組大鼠中獲取約100 mg 肝組織，將組織在液氮中磨碎，并使用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理，4℃，12 000 r/min，5 min，轉(zhuǎn)移上清至一個(gè)新的無(wú)核酶的離心管中，加入200 μl 氯仿，劇烈振蕩15 s，經(jīng)4℃，12 000 r/min 離心 10 min，樣品分為 3 層，將水相中的RNA 轉(zhuǎn)移至一個(gè)新的無(wú)核酶的離心管中， 將無(wú)水乙醇、500 μl 去蛋白液 RD、500 μl 漂洗液 RW 分批分次加入吸附柱CR3 中，加入50 μl 無(wú)核酶水后，經(jīng)4℃，12 000 r/min 離心 2 min，獲得 RNA。瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA 完整性，NanoDrop One 型號(hào)核酸微量檢測(cè)儀（Thermo）測(cè)定 RNA 濃度。 使用 cDNA 第一鏈合成試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。隨后以cDNA 為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative realtime polymerase chain reaction, qRT-PCR）， 每個(gè)樣本設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，記錄每個(gè)組織樣本各指標(biāo)的循環(huán)數(shù)計(jì)為Ct 值，以 2-ΔΔCt值計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。 引物序列見表 1。

表1 RT-qPCR 引物序列

1.2.5 Ang Ⅱ、AT1R、Collagen Ⅰ及 α-SMA 蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blot 檢測(cè)，通過(guò)總蛋白提取試劑盒提取肝臟總蛋白，BCA 法測(cè)定蛋白濃度。 配置10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，實(shí)驗(yàn)條件為80 V、1 h，分離膠120 V、2 h。電泳分離蛋白后，將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜（NC 膜）上，用5%脫脂奶粉于室溫中封閉 1.5 h。 將 NC 膜分別與抗 Ang Ⅱ（1:1000）、抗AT1R（1:1000）、抗 α-SMA（1:1000）、抗 Collagen Ⅰ（1:1000）稀釋液和抗GAPDH（1:1000）稀釋液放置于搖床，4℃孵育過(guò)夜。 次日取出后，用TBST 洗膜3 次，每次5 min。洗膜結(jié)束后與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG 稀釋液（1:5000）4℃孵育5 h，滴加化學(xué)發(fā)光顯色液，iB-rightTMFL1500 凝膠成像儀（Thermo）曝光、顯像，采用Image Lab 軟件（BioRad）分析條帶灰度值，以目的條帶與內(nèi)參GAPDH 條帶灰度值的比值作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 25.0 軟件， 使用 GraphPad Prism 7.0 軟件進(jìn)行圖像制作和輸出。 每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次確保結(jié)果可信度。 多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 四組大鼠肝臟結(jié)構(gòu)的比較

模型組比對(duì)照組出現(xiàn)更嚴(yán)重的肝臟肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝索排列紊亂，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，膠原沉積明顯，提示肝纖維化動(dòng)物模型構(gòu)建成功。 培哚普利組和UA 干預(yù)組的肝小葉結(jié)構(gòu)， 肝細(xì)胞壞死程度低于模型組（圖 1，封三）。

圖1 肝臟 HE 染色（100×）及天兒狼星紅染色（100×）

2.2 四組大鼠肝臟肝纖維化METAVIR 評(píng)分的比較

模型組的METAVIR 評(píng)分高于對(duì)照組、培哚普利組和 UA 干預(yù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖 2）。

圖2 各組大鼠肝臟肝纖維化METAVIR 評(píng)分

2.3 四組大鼠血清 AST、ALT、TBil 水平的比較

模型組的AST、ALT、TBil 水平高于對(duì)照組、培哚普利組和 UA 干預(yù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖3）。

圖3 四組大鼠血清AST、ALT、TBil 表達(dá)的比較

2.4 四組大鼠肝組織 Ang Ⅱ、AT1R、Collagen Ⅰ及α-SMA 蛋白 mRNA 表達(dá)的比較

模型組的 Ang Ⅱ、AT1R、Collagen Ⅰ及 α-SMA蛋白mRNA 表達(dá)高于對(duì)照組、培哚普利組和UA 干預(yù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖 4、5）。

圖4 各組大鼠肝組織 Ang Ⅱ、AT1R、Collagen Ⅰ及 α-SMA 蛋白表達(dá)的比較

3 討論

UA 作為具有潛力的抗纖維化藥物， 已被證實(shí)可以通過(guò)阻斷氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過(guò)氧化，進(jìn)而抑制星狀細(xì)胞活化，逆轉(zhuǎn)肝纖維化[15]，但涉及其中的具體分子機(jī)制尚未完全闡明。 本課題組長(zhǎng)期致力于UA 抗纖維化的機(jī)制研究， 前期大量研究成果表明UA 能顯著抑制瘦素、Ang Ⅱ、血小板衍生生長(zhǎng)因子（platelet derived growth factor，PDGF）誘導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞 NADPH 氧化酶及其亞基表達(dá)，減少活性氧簇生成[16]；并且阻斷促肝纖維化因子誘導(dǎo)的 PI3K/Akt、P38MAPK、ERK1/2信號(hào)通路活化[17]，抑制肝星狀細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡，減少 I 型膠原的生成[18]。Collagen Ⅰ及 α-SMA 是反映肝臟纖維化的經(jīng)典指標(biāo)，二者與肝纖維化嚴(yán)重程度成正比，在本研究中，模型組的Collagen Ⅰ及α-SMA 表達(dá)高于對(duì)照組， 表明大鼠肝纖維化模型造模成功；另外， 培哚普利組和 UA 干預(yù)組的 Collagen Ⅰ及 α-SMA 表達(dá)均低于模型組，與課題組之前的研究結(jié)果一致，表明UA 具有抗肝纖維化作用。

圖5 各組大鼠肝組織Ang Ⅱ、AT1R、Collagen Ⅰ及α-SMA mRNA表達(dá)的比較

Ang Ⅱ是腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（Reninangiotensin-aldosterone system，RASS） 的主要活性成分。 Ang Ⅱ由血管緊張素原將腎素分解生成Ang Ⅰ后，再經(jīng)過(guò)血管緊張素轉(zhuǎn)換酶轉(zhuǎn)化生成，最終Ang Ⅱ作用于AT1R，發(fā)揮收縮血管、促進(jìn)細(xì)胞增殖和炎癥反應(yīng)等生物學(xué)功能[19]。 Bataller 等[20]研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠體內(nèi)輸注Ang Ⅱ后，會(huì)加重肝臟炎癥、氧化應(yīng)激和血管損傷等嚴(yán)重程度，進(jìn)而導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。 進(jìn)一步研究表明，Ang Ⅱ是通過(guò)與AT1R 結(jié)合， 誘導(dǎo)高水平的促炎和促纖維化細(xì)胞因子的分泌，從而使肝星性狀細(xì)胞活化，加重肝臟損傷[21-22]。 本研究表明，在CCl4 誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠肝內(nèi)，Ang Ⅱ和AT1R 表達(dá)顯著上升，然而在對(duì)肝纖維化大鼠進(jìn)行了培哚普利處理后，伴隨著Ang Ⅱ和AT1R 的下降，肝纖維化也出現(xiàn)了緩解， 結(jié)果再次證實(shí)了Ang Ⅱ在肝纖維化進(jìn)展中的重要作用。

UA 是否通過(guò)靶向Ang Ⅱ發(fā)揮抗纖維化作用尚未被證實(shí)。為此，對(duì)CCl4 誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠給予UA灌胃處理后，Ang Ⅱ和AT1R 的表達(dá)都出現(xiàn)了明顯下降， 并且肝纖維化得到緩解。 上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明UA可能通過(guò)抑制Ang Ⅱ/ AT1R 信號(hào)通路， 進(jìn)而改善肝纖維化。

本實(shí)驗(yàn)以SD 大鼠為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停M(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證UA 的抗纖維化機(jī)制。 然而，肝臟中具有肝細(xì)胞、庫(kù)普弗細(xì)胞、肝竇內(nèi)皮細(xì)胞、肝導(dǎo)管上皮細(xì)胞、肝臟間質(zhì)細(xì)胞等多種細(xì)胞，UA 具體是通過(guò)其中的一種還是多種細(xì)胞發(fā)揮抗纖維化作用將值得深入研究。 另外，通過(guò)CRISPR/Cas9 技術(shù)構(gòu)建基因敲除老鼠已十分成熟，在敲除Ang Ⅱ基因老鼠進(jìn)行肝纖維化造模并給予UA干預(yù)，探討其抗纖維化機(jī)制將是下一步的研究重點(diǎn)。

綜上所述，UA 具有抗肝纖維化作用，顯著緩解肝纖維化的進(jìn)展， 其可能與Ang Ⅱ/AT1R 信號(hào)通路有關(guān)。 UA 有望成為未來(lái)針對(duì)靶向Ang Ⅱ/AT1R 信號(hào)通路發(fā)揮抗肝纖維化的候選藥物。