固相萃取LC-MS/MS法分析海洛因及其代謝產(chǎn)物在過量注射致死家兔體內(nèi)的分布

張 松，徐 翩，王麗麗

（重慶市公安局a.物證鑒定中心，重慶400147；b.九龍坡區(qū)分局，重慶400039）

目前，藥物濫用已成為全球性公害，其中麻醉藥品成癮特別是海洛因成癮是一個世界性難題，吸毒者以青少年居多，男性遠(yuǎn)高于女性。毒品的猖獗蔓延，使很多誤入歧途的染毒者陷入痛苦的深淵不能自拔，吸毒者精神變態(tài)，意志削弱，對性病、艾滋病的易感染率明顯升高，使其健康遭到毀滅性的損害，壽命縮短（平均壽命小于40歲）。阿片類藥物的依賴性具有耐受性、精神依賴性和身體依賴性三方面的明顯特征。其戒斷后的痛苦體驗(yàn)是一種負(fù)性強(qiáng)化作用，是產(chǎn)生強(qiáng)迫用藥行為的內(nèi)在驅(qū)動力。產(chǎn)生依賴性后，一旦中斷用藥會出現(xiàn)嚴(yán)重的戒斷癥狀。戒斷癥狀一般在最后一次服藥后幾小時內(nèi)（約6小時）出現(xiàn)，表現(xiàn)為焦慮不安、打哈欠、流涕、惡心嘔吐、寒戰(zhàn)、全身痛覺過敏、肌肉抽搐、起雞皮疙瘩、失眠、病人完全不能入睡，服用安眠藥無效。病人在停藥后均出現(xiàn)程度不同的短暫意識障礙，表現(xiàn)為嗜睡，重者出現(xiàn)短暫譫妄狀態(tài)，一般在停藥24～26小時較為突出，歷時2～3天后便顯著減輕，危害性極大。海洛因的常見吸食途徑有：鼻吸、抽吸，皮下注射和靜脈注射等。吸食海洛因不僅會造成慢性中毒（成癮），而且吸食過量還會引起急性中毒甚至死亡。近年來隨著有關(guān)海洛因中毒死亡案例的增多[1]，逐漸引起了廣大檢驗(yàn)鑒定工作者的重視。

本實(shí)驗(yàn)的目的是建立靜脈過量注射致死家兔模型，研究海洛因及其代謝產(chǎn)物在過量注射致死家兔體內(nèi)的分布，為靜脈過量注射海洛因死亡案例的檢材提取、毒理學(xué)檢驗(yàn)提供依據(jù)。

1 材料

1.1 試劑和材料

海洛因（純度為99.9%）、鹽酸海洛因標(biāo)準(zhǔn)品、鹽酸嗎啡（Mor）標(biāo)準(zhǔn)品、單乙酰嗎啡（Acm）標(biāo)準(zhǔn)品、葡萄糖醛酸嗎啡（M3G）、氘代葡萄糖醛酸嗎啡（M3G-D3）標(biāo)準(zhǔn)品均由公安部物證鑒定中心提供；Clean Screen DAU混合陽離子交換柱（CSDAUL柱）由北京捷安捷公司提供。

1.2 儀器與分析條件

美國ABI API2000LC/MS/MS（液相色譜–串級四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀），ESI離子源。島津LC-20A高效液相色譜儀。Caliper Rapid Trace固相萃取儀。

數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)：Analyst 1.4.1分析軟件。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物

家兔6只，均為雄性，體重2.5 kg±0.2 kg（第三軍醫(yī)大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供），實(shí)驗(yàn)前隔夜禁食。

2 方法

2.1 動物模型建立

家兔6只（其中1只為空白對照），將家兔仰臥位捆綁固定于解剖臺上，經(jīng)耳緣靜脈注射純度為99.9%的海洛因100 mg（用5 mL生理鹽水溶解，三分鐘注射完畢），觀察家兔中毒癥狀。家兔死亡后立即解剖取心、肝、脾、肺、腎、腦、肌肉、心血、尿液、玻璃體液。樣品立即用所建立的固相萃取方法進(jìn)行提取、液質(zhì)聯(lián)用儀檢驗(yàn)?？瞻讓φ占彝媒?jīng)耳緣靜脈注射5 mL生理鹽水。

2.2 樣品的提取

取血、尿、玻璃體液等液體檢材各0.5 mL，加含100 ng/mL M3G-D3的水溶液1.5 mL稀釋，離心，取上清液待過柱；取心、肝、脾、肺、腎、腦、肌肉等固體勻漿檢材各0.5 g，加含100 ng/mL M3G-D3的水溶液1.5 mL稀釋，離心，取上清液待過柱。

取CSDAUL混合陽離子交換柱，加1 mL甲醇，1 mL水活化，上清液過柱，1 mL水清洗，2 mL甲醇洗脫，揮干，用0.5 mL初始流動相溶解，待檢。

2.3 統(tǒng)計方法

采用Excel統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，結(jié)果以均數(shù)表示。

3 結(jié)果與討論

3.1 工作曲線

分別取空白家兔血（代表液體檢材）、肝臟勻漿（代表固體檢材）添加M3G和Mor的標(biāo)準(zhǔn)品配制成含M3G和Mor各0.01、0.05、0.10、0.50、2.00、10.00、100.00μg/mL的系列樣品，取空白家兔血（代表液體檢材）、肝臟勻漿（代表固體檢材）添加Acm標(biāo)準(zhǔn)品，配制成含Acm各0.01、0.05、0.10、0.50、2.00、10.00、100.00μg/mL的系列樣品，按照2.2方法進(jìn)行樣品制備，按所建儀器方法進(jìn)行檢測，以Mor、Acm和M3G的濃度為橫坐標(biāo)（X），以其峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積的比為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸。測定結(jié)果見表1。

表1 血液和肝臟中各組分的工作曲線

3.2海洛因及其代謝產(chǎn)物在過量注射致死家兔體內(nèi)的分布（見表2，圖1）

表2 組織臟器中各組分含量

圖1 海洛因代謝產(chǎn)物在家兔體內(nèi)分布圖

3.3 討論

（1）注射大劑量海洛因后5只家兔均在5分鐘內(nèi)死亡，中毒癥狀表現(xiàn)為：由心跳加速、呼吸急促、四肢痙攣、瞳孔縮小，變?yōu)樾奶粑徛?、四肢松軟最后死亡，這種癥狀與吸毒人員過量注射海洛因致死案例癥狀相同[2]。

（2）由表2、圖1結(jié)果可見，致死家兔體內(nèi)海洛因代謝產(chǎn)物呈一定規(guī)律分布，心血和肺組織中嗎啡含量較高，結(jié)合態(tài)嗎啡含量很少，這是因?yàn)楹Ｂ逡蜃⑸渲滤赖脑驗(yàn)楹粑种?，缺血缺氧、二氧化碳潴留使血液和肺組織呈弱酸性，致使嗎啡大部分保持在游離狀態(tài)[3-7]。肝組織和腎組織中含結(jié)合態(tài)嗎啡較多，是因?yàn)閮烧呤撬幬镛D(zhuǎn)化和排泄的主要器官[8-9]，腎組織中含結(jié)合態(tài)嗎啡較多證明了嗎啡主要是以葡萄糖醛酸結(jié)合態(tài)形式排泄的。以上結(jié)果提示，在實(shí)際案件中心血、肝組織、腎組織、肺組織都是很好的檢材。

腦組織中檢出嗎啡2.96μg/g以及少量海洛因，未檢出葡萄糖醛酸結(jié)合態(tài)嗎啡，可能是由于血腦屏障的保護(hù)作用和腦內(nèi)的酸性環(huán)境使嗎啡呈游離狀態(tài)。

（3）其他組織中均檢出海洛因及其代謝產(chǎn)物，但是嗎啡和葡萄糖醛酸結(jié)合態(tài)嗎啡含量均較少，可能是由于注射劑量過大，藥物來不及分布完全就發(fā)生死亡。

本實(shí)驗(yàn)建立了靜脈過量注射致死家兔模型，研究了急性中毒死亡當(dāng)時海洛因及其代謝物的分布情況，為靜脈過量注射海洛因死亡案例的檢材提取、毒理學(xué)檢驗(yàn)提供了依據(jù)。同時，為以后研究尸體中出現(xiàn)的死后再分布[11]（Postmortem Redistribution，PMR）打下了基礎(chǔ)。