ARTP誘變鈍頂螺旋藻突變體比較組學(xué)研究

蘇楠，吳亦楠，陳韻億，金麗華，張翀，Shimpei Aikawa，Tomohisa Hasunuma，Akihiko Kondo，邢新會(huì)，4，5

（1清華大學(xué)化學(xué)工程系生物化工研究所，工業(yè)生物催化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合成與系統(tǒng)生物學(xué)中心，北京 100084；2北京電子科技職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物技術(shù)系，北京 100029；3神戶大學(xué)工程研究生院，化學(xué)科學(xué)與工程系，日本 神戶 657-8501；4清華大學(xué)深圳國(guó)際研究生院生物醫(yī)藥與健康工程研究院，廣東 深圳 518055；5深圳灣實(shí)驗(yàn)室醫(yī)藥健康技術(shù)與工程研究所，廣東 深圳 518055）

引 言

微藻是一類(lèi)體積小、單細(xì)胞/群體生長(zhǎng)、可通過(guò)光合作用固定CO2的水生低等生物的總稱(chēng)，在全球碳循環(huán)中扮演著重要的角色。研究表明，微藻光合作用所固定CO2的量可達(dá)全球總固定量的40%[1]。隨著溫室效應(yīng)引起的全球氣候問(wèn)題的日益嚴(yán)峻，微藻因其高光合效率、高碳水化合物含量和高油脂含量等特點(diǎn)，被視為新一代生物柴油、生物乙醇、生物產(chǎn)氫的重要光合細(xì)胞工廠[2-3]。此外，微藻還能夠利用太陽(yáng)能直接合成眾多高附加值化合物，其大規(guī)模培養(yǎng)和應(yīng)用有助于“碳達(dá)峰”和“碳中和”的實(shí)現(xiàn)，具有重要的社會(huì)及經(jīng)濟(jì)效益[4]。因此，微藻育種及后續(xù)生物質(zhì)發(fā)酵、應(yīng)用成為新的研究熱點(diǎn)之一。

鈍頂螺旋藻（Spirulina platensis）是一種多細(xì)胞纖維狀微藻，常被發(fā)現(xiàn)于堿性湖泊中。因具有倍增速度快、蛋白含量極高（干重的65%～71%）、維生素、礦物質(zhì)及色素含量豐富等特點(diǎn)，一直被大規(guī)模培養(yǎng)并應(yīng)用于食品[5]、保健品[6-7]、藥品[8-9]、化妝品[10-11]和飼料添加劑[4]的工業(yè)生產(chǎn)。近年來(lái)，因規(guī)?；囵B(yǎng)技術(shù)成熟、碳水化合物含量高（干重的15%）且易水解等優(yōu)點(diǎn)，鈍頂螺旋藻亦被視為第三代生物乙醇發(fā)酵生產(chǎn)的理想原料之一[12]。為了進(jìn)一步推進(jìn)鈍頂螺旋藻在發(fā)酵領(lǐng)域的應(yīng)用，改造和獲得具有生長(zhǎng)速度快、碳水化合物含量豐富、抗逆性強(qiáng)、易絮凝收集等優(yōu)勢(shì)表型的微藻細(xì)胞工廠具有重要的研究和應(yīng)用價(jià)值。

盡管鈍頂螺旋藻培育歷史悠久且在電轉(zhuǎn)化方面取得較大進(jìn)展[13-15]，但由于胞內(nèi)大量限制酶、修飾酶、插入元件、Ⅱ型內(nèi)含子及成簇的間隔短回文重復(fù)序列（CRISPR）的存在，目前鈍頂螺旋藻的分子改造仍受限于可用分子元件的缺失[16]。相較于其他微藻，其改造主要依賴(lài)于誘變育種策略。殷春濤等[17]利用亞硝基胍（NTG）作用于鈍頂螺旋藻，篩選得到耐低溫突變株；李建宏等[18]利用紫外突變，獲得了富含藻藍(lán)蛋白且菌體增長(zhǎng)的突變株；Fang等[19]利用自主研發(fā)的常壓室溫等離子體（atmospheric room temperature plasma,ARTP）成功誘變鈍頂螺旋藻，獲得生長(zhǎng)速率增強(qiáng)、碳水化合物含量增加或絮凝度增加的代表性菌株；Shirnalli等[20]利用NTG處理鈍頂螺旋藻，得到蛋白含量或類(lèi)胡蘿卜素含量增加的突變株；Cheng等[21]利用60Co-γ射線誘變鈍頂螺旋藻，得到生長(zhǎng)速率和CO2固定速率增加的菌株；Zhu等[22]利用60Co-γ射線誘變鈍頂螺旋藻，得到苯酚耐受性增強(qiáng)、可以利用煙道氣中CO2的突變株。此外，An等[23]還結(jié)合ARTP誘變與β-紫羅酮篩選，成功誘變得到蝦青素產(chǎn)量增加的菌株。不同的表型具有不同的工業(yè)價(jià)值，如抗低溫有利于拓寬生產(chǎn)地域；生長(zhǎng)速率增強(qiáng)有利于提高固碳效率；菌株目標(biāo)代謝產(chǎn)物含量和絮凝度增加有利于提高生產(chǎn)效率和降低收集成本等。

優(yōu)勢(shì)突變體的產(chǎn)生不僅能夠?yàn)楣I(yè)生產(chǎn)提供理想菌株，同時(shí)也為胞內(nèi)代謝網(wǎng)絡(luò)及其調(diào)控機(jī)理的深入研究提供了比較素材。隨著組學(xué)技術(shù)（全基因組測(cè)序、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)等）與生物信息學(xué)技術(shù)的發(fā)展，近年來(lái)，在分子水平解析優(yōu)勢(shì)表型產(chǎn)生的機(jī)理得以實(shí)現(xiàn)，并在大腸桿菌、釀酒酵母等底盤(pán)微生物育種中起到重要的作用。然而，盡管已經(jīng)獲得了完整的鈍頂螺旋藻基因組[24]，鈍頂螺旋藻突變體基因型-表型的關(guān)聯(lián)分析仍然鮮有報(bào)道。除了Cheng等[25]利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序解析60Co-γ射線誘變鈍頂螺旋藻突變體生長(zhǎng)速率增強(qiáng)的原因外，大部分研究主要基于蛋白質(zhì)組學(xué)或轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究鈍頂螺旋藻瞬時(shí)抗逆響應(yīng)（抗鹽、抗高溫、抗低溫、抗離子等）產(chǎn)生的代謝網(wǎng)絡(luò)擾動(dòng)[26-29]。因此，更多突變表型的組學(xué)分析亟待進(jìn)一步挖掘。

本團(tuán)隊(duì)前期利用ARTP誘變得到了三株突變株[19,30]。為模擬鈍頂螺旋藻室外培養(yǎng)條件，避免光飽和及光抑制過(guò)程，采用“12小時(shí)光照+12小時(shí)避光”的交替培養(yǎng)方法進(jìn)行研究。本研究則采用“連續(xù)光照+短期培養(yǎng)（7天）”的方式進(jìn)行培養(yǎng)，在獲得實(shí)驗(yàn)室可控條件下的最大固碳、生長(zhǎng)效率的基礎(chǔ)上，研究突變體的表型變化及其產(chǎn)生的可能的分子機(jī)制。表型表征表明，三株突變株在強(qiáng)化培養(yǎng)的條件下，具有高絮凝表型及不同的胞內(nèi)重要化合物含量。隨后，通過(guò)代謝組學(xué)與比較基因組學(xué)結(jié)合的方法對(duì)所觀察到表型的分子機(jī)制進(jìn)行初步闡釋?zhuān)云跒槲磥?lái)鈍頂螺旋藻表型理性改造提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

鈍頂螺旋藻原始菌株FACHB-904購(gòu)自武漢中科院水生生物研究所淡水藻種庫(kù)，突變株3-A10，3-B2，4-B3為本實(shí)驗(yàn)室前期利用ARTP誘變育種儀（http://www.tmaxtree.com/）誘變篩選獲得[19]。在12小時(shí)光照+12小時(shí)避光的培養(yǎng)條件下，突變體在絮凝度、碳水化合物含量、生長(zhǎng)速度或葉綠素含量方面與野生型有顯著差異。

1.2 培養(yǎng)基

本研究中的野生型鈍頂螺旋藻及ARTP突變菌株，均使用Zarrouk培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)[19]。

1.3 主要試劑

所有培養(yǎng)基的成分均為分析純等級(jí)，硫酸為化學(xué)純等級(jí)。碳酸氫鈉、硫酸鉀、七水合硫酸鎂、七水合硫酸鐵、乙二胺四乙酸、硼酸、氫氧化鈉、二硝基水楊酸、甲醇和氯仿購(gòu)自于Sigma公司以及Takara公司。碳酸鈉、磷酸氫二鉀、硝酸鈉、氯化鈉、二水合氯化鈣、一水合硫酸錳、二水合鉬酸鈉、五水合硫酸銅、六水合氯化鈷、氯化銅、氯化鋅、硫酸購(gòu)自北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司。

螺旋藻基因組提取純化試劑盒DNeasy Plant Mini kit購(gòu)自Qiagen公司。玻璃珠（acid-washed,150～212μm）購(gòu)自Sigma公司。

1.4 儀器與設(shè)備

水 平 搖 床，NC350-HC plant chamber，日 本Nippon Medical and Chemical Instruments；光強(qiáng)測(cè)量?jī)x，Testo540，美國(guó)Testo；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，UV757CRT，上海精科；毛細(xì)管電泳質(zhì)譜（CE/MS）系統(tǒng)，Agilent G7100CE/Agilent G6224AA LC/MSD time-of-flight system，美 國(guó)Agilent；HPLC/QqQ-MS系統(tǒng)，Agilent1200LC/Agilent6460QqQ-MS，美國(guó)Agilent；LC/酶標(biāo)儀，TECAN infinite M200pro，瑞士TECAN；水浴鍋；微量玻璃比色皿；研缽/勻漿器。

1.5 培養(yǎng)條件

在200ml三角瓶中加入100ml Zarrouk培養(yǎng)基，高壓蒸汽滅菌（115℃，30min）。螺旋藻種子液在（30±2）℃，光強(qiáng)50μmol/(m2·s)，100r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)5～6d。達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，按照細(xì)胞干重比為0.0 3g/L的比例接種至新的Zarrouk培養(yǎng)基中，相同條件下，連續(xù)光照培養(yǎng)7d。每24h進(jìn)行取樣，檢測(cè)藻株培養(yǎng)相關(guān)指標(biāo)。

由于螺旋藻胞內(nèi)代謝產(chǎn)物受環(huán)境、培養(yǎng)條件影響顯著，為保證數(shù)據(jù)準(zhǔn)確，本研究將WT、3-A10、3-B2、4-B3置于燈箱內(nèi)水平搖床上培養(yǎng)（附錄圖A1）。每批次培養(yǎng)均保持三個(gè)生物學(xué)平行，并嚴(yán)格控制放置位置，保證各瓶所接受光照強(qiáng)度一致（采用光強(qiáng)測(cè)量?jī)x進(jìn)行光強(qiáng)檢測(cè)）；同時(shí)，為避免環(huán)境光的干擾，燈箱用黑布作遮光處理。

1.6 檢測(cè)方法

1.6.1 細(xì)胞濃度（細(xì)胞干重）及比生長(zhǎng)速率的測(cè)定 使用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)鈍頂螺旋藻在560nm處的光密度（OD560）[19,31]，根據(jù)所測(cè)定的OD560（y）和細(xì)胞干重（dry cell weight,DCW）（x）標(biāo)準(zhǔn)曲線[式(1)，附錄圖A2]計(jì)算鈍頂螺旋藻的細(xì)胞干重(g/L)。

比生長(zhǎng)速率[μ，g/（L·d）]由式(2)計(jì)算。

其中，x1和x2分別為t1和t2時(shí)刻的細(xì)胞干重。

1.6.2 碳水化合物含量測(cè)定 螺旋藻碳水化合物提取及含量測(cè)定采用Fang等[19]的方法：取5ml藻株培養(yǎng)液，13000g離心10min，用0.9% NaCl溶液清洗3次，棄掉上清液。在沉淀細(xì)胞中添加3ml HCl（6mol/L），煮騰15min。冷卻后，添加相同體積的NaOH(6mol/L)進(jìn)行中和并采用DNS方法檢測(cè)樣品處理后所得還原糖濃度（DNS溶液：NaOH16g，二硝基水楊酸1g，酒石酸鈉鉀300g，蒸餾水定容至1L）。用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品在波長(zhǎng)560nm的吸光度(Abs560)，根據(jù)測(cè)定的Abs560（y）和碳水化合物濃度（x）標(biāo)準(zhǔn)曲線[式(3)，附錄圖A3]計(jì)算待測(cè)樣品的碳水化合物濃度（μg）。

1.6.3 葡萄糖含量測(cè)定 采用Solarbio葡萄糖含量測(cè)定試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。取0.1g組織（干重），加入1ml蒸餾水研磨成勻漿，置沸水浴中煮沸10min。冷卻后，8000g離心10min。取20μl蒸餾水、標(biāo)準(zhǔn)品、離心所得樣品上清液分別與180μl試劑盒測(cè)定混合試劑混合，并在96孔內(nèi)于37℃孵育15min。之后，利用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)505nm處的吸光度A1、A2和A3，根據(jù)式(4)計(jì)算葡萄糖含量（y，μmol/mg）。

1.6.4 葉綠素含量測(cè)定 螺旋藻葉綠素提取及含量測(cè)定采用Fang等[19]的方法：取5ml藻株培養(yǎng)液，13000g條件下離心10min，用0.9% NaCl溶液清洗3次，棄掉上清液，在回收的沉淀細(xì)胞中添加5ml濃度為90%的甲醇，超聲破碎（超聲1s，間隔2s，100個(gè)循環(huán)）后萃取葉綠素。用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)樣品在665nm和650nm處的吸光度，由式(5)計(jì)算待測(cè)樣品的葉綠素含量（y，mg/L）。

1.6.5 絮凝度測(cè)定 將分別培養(yǎng)1、3、5、7d的藻株，于三角瓶中靜置24h，后吸取上清液，利用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)澄清液在560nm的吸光度(As)及混勻后的樣品的吸光度(Am)。由式(6)計(jì)算得到藻株絮凝度（F）。

生長(zhǎng)早期絮凝度檢測(cè)，則選取培養(yǎng)24h后的藻株進(jìn)行靜置，分別在2、4、6、8、10、12、14和24h節(jié)點(diǎn)吸取上清部分，用上述方法進(jìn)行吸光度檢測(cè)及絮凝度計(jì)算。

1.6.6 胞內(nèi)代謝產(chǎn)物分析樣品處理 量取干重約5～10mg的藻株細(xì)胞培養(yǎng)液，使用10μm濾膜(Millipore)過(guò)濾，隨后用4℃預(yù)冷的NaH2CO3（260nmol/L）清洗1次，離心后的藻株細(xì)胞立刻加入2ml在-30℃預(yù)冷的甲醇溶液（含有PIPES溶液）。振蕩重懸。隨后，取1ml藻株細(xì)胞，加入100μl4℃預(yù)冷的超純水和300μl氯仿（含有濃度為15μmol/L反-β-阿樸-8′-胡蘿卜烯醛）。在避光、4℃、1200r/min條件下混勻30min，隨后4℃、14000g離心5min。取980μl上清液與440μl超純水混合，水相與有機(jī)相分層后，4℃、14000g離心5min，平行移取兩份水相溶液（450μl/份）至潔凈的樣品管。隨后用5kDa的濾膜移除可溶蛋白組分，將水相層提取物進(jìn)行凍干，-80℃存放備用，或用超純水溶解后直接進(jìn)行CE/MS和LC/QqQ-MS分析。

1.6.7 CE/MS代謝物分析 將凍干的胞內(nèi)代謝產(chǎn)物提取物溶于20μl超純水后利用CE/MS系統(tǒng)進(jìn)行CE/MS分析。CE分離系統(tǒng)介質(zhì)為融合二氧化硅的毛細(xì)管(1m×50μm i.d.)，裝填1mol/L甲酸（pH=1.8）或50mmol/L醋酸銨（pH=9）作為電解液進(jìn)行陽(yáng)離子或陰離子代謝物分析。CE電極以電解液輸入端為陽(yáng)極，離子化輸出端作為陰極。樣品注入CE系統(tǒng)時(shí)，選用50mbar(1bar=105Pa)、10s的條件分析陽(yáng)離子或陰離子代謝物。CE系統(tǒng)電壓設(shè)置為30kV，斜坡時(shí)間0.3min。對(duì)于陰離子代謝產(chǎn)物分析，使用空氣泵將電解液注入毛細(xì)管，壓力先設(shè)置為10mbar（進(jìn)樣時(shí)間為0.4 ～30min）再設(shè)置為100mbar（進(jìn)樣時(shí)間為30.1 ～49.5min）。鞘流液的流速設(shè)置為8μl/min。ESI-MA分析可以在陽(yáng)離子或者陰離子模式進(jìn)行，對(duì)應(yīng)的毛細(xì)管壓力設(shè)定為-3.5 kV或者3.5 kV。TOF-MS劃分器、分離器以及八極性分離電壓分別設(shè)定為100V、65V和750V。1.6.8 LC/QqQ-MS代謝物分析 凍干的胞內(nèi)代謝產(chǎn)物提取物使用50μl超純水溶解后利用LC/QqQ-MS系統(tǒng)配合MassHunter Workstation Data Acquisition v.B.04.01 軟件進(jìn)行代謝物分析。本實(shí)驗(yàn)使用質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。

1.6.9 螺旋藻基因組提取及測(cè)序 取50ml培養(yǎng)10d的螺旋藻菌液，利用縮水濾紙減壓過(guò)濾。分離出來(lái)的藻體用0.9%NaCl洗滌三次后，移到1.5ml管。加入1ml重懸溶液（0.1mol/L EDTA，0.1 5mol/L NaCl）并重懸。接著，先利用液氮快速冷凍重懸菌液30s，后放入37℃培養(yǎng)箱孵化至溶解。重復(fù)速凍與融化3次。離心去掉上清液，利用植物基因組提取試劑盒進(jìn)行基因組提取。提取的基因組先用微量紫外分光光度計(jì)進(jìn)行濃度檢測(cè)。將符合測(cè)序標(biāo)準(zhǔn)的基因組樣品交由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行測(cè)序和后續(xù)的突變分析。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 藻株培養(yǎng)及表型分析

連續(xù)光照培養(yǎng)有助于強(qiáng)化藻株的光合作用，實(shí)現(xiàn)更加高效的固碳。為了探究強(qiáng)化光照培養(yǎng)下藻株的表型，本實(shí)驗(yàn)在實(shí)驗(yàn)室可控的連續(xù)光照培養(yǎng)下，對(duì)原始菌株及突變株的生長(zhǎng)及重要化合物含量進(jìn)行了表征。

2.1.1 比生長(zhǎng)速率測(cè)定 在間歇光照培養(yǎng)（12h+12h）情況下，3-A10、3-B2、4-B3和野生型（WT）的比生長(zhǎng)速率分別為(0.0583 ±0.016 )、(0.0786 ±0.016 )、(0.0930 ±0.025 )和(0.0842 ±0.018 )g/(L·d)[19]。3-A10遠(yuǎn)低于WT，3-B2接近于WT，4-B3則較WT有所提升。在強(qiáng)化光照條件下，3-A10、3-B2、4-B3和WT的比生 長(zhǎng) 速 率 可 達(dá)(0.4349 ±0.0059 )、(0.4350 ±0.0016 )、(0.4521 ±0.0063 )以及(0.4531 ±0.0064 )g/(L·d)，分別提高了6.5 倍、4.5 倍、3.9 倍和4.4 倍（圖1）。強(qiáng)化的光照條件促進(jìn)了藻株的生長(zhǎng)，但同時(shí)弱化了各藻株之間的生長(zhǎng)差異。

圖1 野生和三株突變?cè)逯暝谶B續(xù)光照培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curves of wild-type S.platensis and the three mutants under the continuous light irradiation culture

2.1.2 絮凝度分析 在絮凝方面，間歇光照培養(yǎng)（12h+12h）情況下，僅3-B2相較于WT具有更好的絮凝表型[19]。然而，在本實(shí)驗(yàn)的強(qiáng)化光照培養(yǎng)條件下，相較于WT，盡管生長(zhǎng)速度相似，3-A10、3-B2、4-B3均表現(xiàn)出了易絮凝表型[圖2（a）、（b）]。在生長(zhǎng)早期，細(xì)胞密度較低時(shí)，3-A10、3-B2、4-B3就具有較高的絮凝度，并于第3天均達(dá)到了最大值。從培養(yǎng)1d后的絮凝度來(lái)看，3株突變體間也有所差異，3-B2＞4-B3＞3-A10[圖2（b）、（c）]?？梢酝茰y(cè)，絮凝度表型的差異來(lái)源于各突變體基因型的不同以及環(huán)境變化所引起的代謝網(wǎng)絡(luò)的改變。

圖2 突變體藻株在生長(zhǎng)過(guò)程中的絮凝度變化:(a)各藻株搖床培養(yǎng)24h后，靜置5min時(shí)的照片;(b)各藻株搖床7d培養(yǎng)過(guò)程中的絮凝度變化;(c)經(jīng)24h搖床培養(yǎng)的藻株，靜置培養(yǎng)不同時(shí)間后的絮凝度Fig.2 Change of flocculation over culture time.(a)Pictures of S.platensis strain cultures after24h incubation in the shaker;(b)The change of flocculation of strain cultures during7d of incubation in the shaker;(c)The change of flocculation of strain cultures(harvested after24h of incubation in the shaker)after stationary sedimentation in tubes for different time periods

2.2 藻株重要組分分析

除了上述表觀的生長(zhǎng)、絮凝度的表征，對(duì)不同藻株的重要基本組分（葉綠素含量、總碳水化合物含量、葡萄糖含量）也進(jìn)行了分析。

2.2.1 葉綠素含量測(cè)定 各藻株在第1天的葉綠素含量均為最高水平且WT＞3-A10＞3-B2＞4-B3（圖3）。隨著光照培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，有所下降。WT的葉綠素含量則持續(xù)降低，3-A10與3-B2的葉綠素含量在培養(yǎng)過(guò)程中先降低后又部分恢復(fù)，并在第7天高于WT。突變株4-B3葉綠素含量整體變化最小，始終維持在較低水平。

圖3 各藻株在生長(zhǎng)過(guò)程中的葉綠素含量測(cè)定Fig.3 Change of chlorophyll concentrations over time

2.2.2 碳水化合物含量測(cè)定 藻株內(nèi)的碳水化合物是生產(chǎn)生物燃料的重要原料，因此，總碳水化合物含量也是微藻的一個(gè)重要生理指標(biāo)。第1天各藻株的總碳水化合物含量都相對(duì)比較高，隨著培養(yǎng)過(guò)程的進(jìn)行，各藻株都有不同程度的下降，至第7天時(shí)各藻株總碳水化合物含量基本維持在相似水平（圖4）。該結(jié)果表明在該段培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，糖合成途徑總體上得到了增強(qiáng)。突變株3-A10和4-B3與野生型的差異不明顯，但3-B2在培養(yǎng)周期的前3天都表現(xiàn)出明顯的高總碳水化合物含量。結(jié)合3-B2在培養(yǎng)前期絮凝度最高的表型，該突變株高碳水化合物有可能參與形成胞外多糖（EPS），使得細(xì)胞之間產(chǎn)生更為緊密的相互作用。

圖4 各藻株在生長(zhǎng)過(guò)程中的總碳水化合物含量測(cè)定Fig.4 Change of total carbohydrate concentrations over time

2.2.3 葡萄糖含量測(cè)定 作為原核生物中糖原合成的前體，螺旋藻在生長(zhǎng)過(guò)程中葡萄糖含量直接決定了其糖原的合成量，本研究也對(duì)幾個(gè)藻株碳水化合物中的葡萄糖的含量進(jìn)行了測(cè)定（圖5）。

圖5 各藻株在生長(zhǎng)過(guò)程中的葡萄糖含量測(cè)定Fig.5 Change of glucose concentrations over culture time

野生型的葡萄糖含量水平基本保持穩(wěn)定，沒(méi)有顯著差異，相比之下，突變體的葡萄糖含量則有比較明顯的變化。在生長(zhǎng)的起始階段，突變體的胞內(nèi)葡萄糖含量為野生型的175%～225%，而突變體之間的胞內(nèi)葡萄糖含量則沒(méi)有特別明顯的差異，這可能為后期突變體絮凝度增加所需的糖原合成奠定了基礎(chǔ)。在第3天，突變體的胞內(nèi)葡萄糖含量迅速降為和野生型基本一致的水平，而此時(shí)三個(gè)突變體的絮凝度則顯著上升，可能表明細(xì)胞表面的糖蛋白合成消耗了大量的葡萄糖。在第4～7天，突變體3-A10和3-B2的葡萄糖含量保持穩(wěn)定狀態(tài)，對(duì)應(yīng)其絮凝度也達(dá)到了平臺(tái)期。突變體4-B3在這個(gè)時(shí)期內(nèi)，雖然絮凝度未再有顯著的提升，但其胞內(nèi)葡萄糖的含量卻有了大幅度的增加，表明該突變株在該時(shí)期內(nèi)的葡萄糖合成途徑得到了迅速的加強(qiáng)，其上游的中間代謝產(chǎn)物有可能也會(huì)有比較明顯的含量變化。

2.3 藻株重要代謝中間物含量與表型關(guān)聯(lián)分析

相較于WT，三株螺旋藻突變體具有明顯的高絮凝表型，同時(shí)，在生長(zhǎng)特定階段，在葉綠素含量、碳水化合物含量以及葡萄糖含量方面也與WT具有差異。為了深入解析三個(gè)突變體在表型上的顯著特點(diǎn)，在不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)對(duì)連續(xù)光照培養(yǎng)過(guò)程中各藻株的16種重要胞內(nèi)代謝產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)定（圖6）。這16種代謝物分布在與螺旋藻生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)的糖酵解途徑、三羧酸循環(huán)途徑（TCA cycle）、糖代謝途徑以及固碳/氮途徑中，包括磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）、D-3-磷酸甘油酸（3PGA）、甘油醛-3-磷酸（GAP）、D-果糖-6-磷酸（F6P）、D-葡萄糖-1-磷酸(G1P)、D-葡萄糖-6-磷酸(G6P)、UDP-D-葡萄糖(UDP-GLC)、ADP-D-葡 萄 糖(ADP-GLC)、檸 檬 酸(CA)、α-酮 戊 二 酸(αKG)、琥 珀 酸(SUCC)、蘋(píng) 果 酸(MAA)、D-景天庚酮-7-磷酸(S7P)、D-2-磷酸甘油酸(2-PGA)、乳 酸(LAC)、GDP-D-葡 萄 糖（GDPGLC）（圖7）。

圖6 各藻株胞內(nèi)主要代謝產(chǎn)物含量測(cè)定Fig.6 Change of the concentrations of import metabolites over time

圖7 測(cè)定中間代謝產(chǎn)物在各代謝途徑中的分布Fig.7 Location of detected important metabolites in strain metabolic networks

上述16種主要代謝產(chǎn)物的測(cè)定中，在持續(xù)光照培養(yǎng)條件下，三種突變體大部分胞內(nèi)代謝產(chǎn)物含量隨時(shí)間變化趨勢(shì)與WT差異不大。但可以看到，隨著生長(zhǎng)過(guò)程的進(jìn)行，突變體在上述途徑中處于核心位置的代謝中間產(chǎn)物的含量均存在明顯的變化。

在糖原合成/糖酵解平衡途徑中，上游處于核心位置的PEP、3PGA以及GAP，在生長(zhǎng)初期突變體含量顯著比野生型高，隨著培養(yǎng)時(shí)間的進(jìn)行，逐漸與野生型一致，在生長(zhǎng)后期又出現(xiàn)高于野生型的現(xiàn)象（圖6）；F6P在培養(yǎng)前期的含量高于野生型，在培養(yǎng)中后期基本與野生型保持在同一水平，并未有突變體含量再次升高的現(xiàn)象。在F6P向G6P和G1P轉(zhuǎn)化過(guò)程中，G6P和G1P含量變化趨勢(shì)與PEP、3PGA、GAP含量變化趨勢(shì)有比較明顯的相反的表現(xiàn)，即突變體在早期（如培養(yǎng)1d）PEP、3PGA、GAP含量高于野生型時(shí)，G6P和G1P含量與野生型差別不大；在3～5d突變體PEP、3PGA、GAP含量接近野生型時(shí)，G6P和G1P含量則出現(xiàn)明顯高于野生型的表現(xiàn)，隨后再逐步趨于與野生型相似水平。這個(gè)趨勢(shì)顯著表明代謝流在向著糖原合成的方向進(jìn)行，并且這個(gè)趨勢(shì)有周期性變化的特征（即有可能隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)連續(xù)、順次出現(xiàn)）。在進(jìn)入糖代謝循環(huán)后，突變體ADP-GLC和UDP-GLC的含量與野生型差異不明顯（只有突變體3-A10的ADP-GLC在培養(yǎng)末期有顯著升高的趨勢(shì)），說(shuō)明糖原合成途徑處于比較高效的狀態(tài)，終產(chǎn)物糖原與葡聚糖的合成量均得到提高（本研究中總碳水化合物含量測(cè)定也證實(shí)該推論）。螺旋藻合成的糖原/葡聚糖除了供給本身的生長(zhǎng)需求外，還能夠以胞外多糖（ESP）的形式存在于細(xì)胞壁表面。推測(cè)細(xì)胞間ESP含量增加造成相互之間的互作力增強(qiáng)，從而可以使得螺旋藻絮凝度和沉降度都得到增強(qiáng)。

三羧酸循環(huán)中，突變體CA和α-KG的含量在整個(gè)培養(yǎng)周期內(nèi)都顯著高于野生型，而MAA和SUCC的含量與野生型保持一致，說(shuō)明在代謝流從PEP向OAA傳遞后，琥珀酸合成途徑并沒(méi)有變化，主要是α-KG途徑得到了顯著加強(qiáng)。α-KG作為三羧酸循環(huán)中重要的代謝中間產(chǎn)物，是生物體內(nèi)L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-脯氨酸、L-精氨酸等多種氨基酸、維生素和有機(jī)酸的生物合成前體。α-KG又可在α-酮戊二酸脫氫酶的作用下進(jìn)一步代謝成琥珀酰-CoA，進(jìn)入碳代謝節(jié)點(diǎn)，在這一過(guò)程中伴隨著電子傳遞和能量產(chǎn)生，該過(guò)程能夠?yàn)槁菪宓纳L(zhǎng)繁殖提供大量碳源物質(zhì)和能量；此外，α-KG還可通過(guò)轉(zhuǎn)氨基作用形成L-谷氨酸，進(jìn)入氮代謝。因此，突變體中α-KG含量的增加，表明藻株的碳代謝和氮代謝都同時(shí)得到了加強(qiáng)（突變體處于N代謝途徑中心位置的S7P含量在生長(zhǎng)早期顯著高于野生型）。

2.4 藻株比較基因組分析

進(jìn)一步，對(duì)野生型和突變體藻株的基因組進(jìn)行了提取和重測(cè)序，以期在基因組層面上探討ARTP突變體產(chǎn)生表型差異的可能原因。利用已有的Arthrospira platensisNIES-39基因組，對(duì)基因序列進(jìn)行Clusters of Orthologous Groups of proteins（COG）注釋?zhuān)A(yù)測(cè)得到編碼蛋白量約3900個(gè)。與WT相比，三株突變體3-A10、3-B2和4-B3的基因組上分別存在1591、1059和1823個(gè)錯(cuò)譯單堿基突變以及82、56和81個(gè)錯(cuò)譯插入/缺失突變。通過(guò)Gene Ontology（GO）注釋分析，對(duì)上述突變基因編碼蛋白的功能進(jìn)行聚類(lèi)分析（表1，附錄圖A4～A6）。突變體分布在三大類(lèi)突變基因的數(shù)量差異較大（附錄表A1），與生物途徑和分子功能相關(guān)基因改變的數(shù)量較多，分別達(dá)到900和660個(gè)以上，是突變體產(chǎn)生多種表型差異的主要原因；但相對(duì)地，發(fā)生在細(xì)胞主要組件相關(guān)基因上的突變只有100個(gè)左右，表明突變體在與生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的關(guān)鍵途徑/網(wǎng)絡(luò)的變化相對(duì)較小，這與之前表征所得，突變體生長(zhǎng)速度與野生型相近的結(jié)果相吻合。

表1 突變體突變基因GO聚類(lèi)分析Table1 Gene Ontology clustering analysis of mutated strains

使用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.kegg.jp/）中代謝網(wǎng)絡(luò)分析功能，對(duì)突變體相對(duì)野生型有顯著差異（差異性大于0.1%）的基因進(jìn)行所屬代謝網(wǎng)絡(luò)的歸類(lèi)（附錄表A2）?？梢钥吹剑@著突變基因涉及的代謝途徑多達(dá)68條，表明ARTP誘變可以在系統(tǒng)層面上造成螺旋藻基因組的大規(guī)模突變。相比于WT，突變體在嘌呤代謝、氨基酸生物合成、葉綠素代謝、光合作用/固碳、氮元素代謝途徑、糖類(lèi)合成/代謝相關(guān)的途徑出現(xiàn)了較多的突變基因。這些突變可能對(duì)突變株表型的改變起到了重要的作用。由于缺乏有效的基因改造工具，目前，對(duì)這些基因突變的功能暫時(shí)無(wú)法進(jìn)行回補(bǔ)驗(yàn)證。隨著新的微藻分子生物學(xué)工具的開(kāi)發(fā)，這些潛在的作用位點(diǎn)將有助于微藻基因型-表型關(guān)聯(lián)的進(jìn)一步深入研究。

3 結(jié) 論

螺旋藻的誘變育種及表型解析具有重要的工業(yè)價(jià)值。本研究對(duì)本團(tuán)隊(duì)前期研究獲得的三株螺旋藻突變株的表型，在強(qiáng)化培養(yǎng)的條件下進(jìn)行了詳細(xì)表征。結(jié)果表明，強(qiáng)化培養(yǎng)下，突變株與野生型菌株的生長(zhǎng)差異較小，但均具有高絮凝表型。此外，在特定的生長(zhǎng)階段，突變株胞內(nèi)的重要化合物含量（葉綠素、碳水化合物總量、葡萄糖）與野生型具有明顯差異。進(jìn)一步，通過(guò)代謝組學(xué)，測(cè)定了藻體內(nèi)16種重要代謝物的含量變化情況，對(duì)突變株的表型進(jìn)行了初步解析。結(jié)果表明，突變株的高絮凝表型根源于生長(zhǎng)早期糖合成過(guò)程的強(qiáng)化。最后，通過(guò)全基因組測(cè)序和比較基因組學(xué)分析，得到三株突變體3-A10、3-B2和4-B3基因組上1591、1059和1823個(gè)錯(cuò)譯單堿基突變以及82、56和81個(gè)錯(cuò)譯插入/缺失突變。初步的功能聚類(lèi)分析表明，顯著突變基因涉及的代謝途徑多達(dá)68條，涉及嘌呤代謝、氨基酸生物合成、葉綠素代謝、光合作用/固碳、氮元素代謝途徑、糖類(lèi)合成/代謝等眾多重要的生理過(guò)程。隨著未來(lái)螺旋藻分子工具的增加，驗(yàn)證和解析這些突變的具體功能將成為可能。