基于提高乙醇產(chǎn)率的常壓室溫等離子體微藻誘變育種

孫 哲,孫 昕,李鵬飛,劉明文,李 盟,張清宇 (西安建筑科技大學(xué)環(huán)境與市政工程學(xué)院,陜西 西安 710055)

傳統(tǒng)化石能源的持續(xù)消耗引發(fā)了能源危機(jī),帶來了溫室效應(yīng)、霧霾等問題,開發(fā)可再生的替代能源迫在眉睫[1].乙醇作為一種辛烷值高達(dá)115且可再生的綠色清潔燃料受到廣泛關(guān)注[2].微藻作為第三代生物質(zhì)能源,分布廣泛、生長速度快、不占用耕地,細(xì)胞中含有較多的可溶性多糖,藻類所含的纖維素相對陸生植物而言氫鍵更弱,更易于預(yù)處理,是制備生物乙醇的良好原料[3].

利用微藻制備乙醇主要依靠藻細(xì)胞內(nèi)碳水化合物,獲取高含碳水化合物的藻株對制備生物乙醇具有重要意義.由于藻細(xì)胞內(nèi)碳水化合物是最直接的供能物質(zhì),而碳水化合物的積累通常發(fā)生在對細(xì)胞生長不利的環(huán)境下,這一定程度上限制了微藻生物量的積累,對選育優(yōu)勢藻株帶來了阻礙[4].目前常用的是對藻類進(jìn)行氮、磷脅迫使藻細(xì)胞內(nèi)淀粉含量增加[5],但會以減少生物量作為代價[6].

常壓室溫等離子體(ARTP)是一種安全高效的新型誘變裝置,通過改變細(xì)胞理化特性引起組織損傷,迫使細(xì)胞啟動SOS修復(fù)機(jī)制,進(jìn)而改變生物細(xì)胞內(nèi)遺傳物質(zhì)[7-8].相比于紫外線、射線、激光等誘變方法,ARTP輻射均勻,突變率高并具有多樣性[9],同時該方法操作簡單,工作溫度低(＜40℃),安全系數(shù)高,不涉及有毒有害物質(zhì),比化學(xué)誘變更加環(huán)保[10].

誘變育種目前在微藻領(lǐng)域已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用,包括提高藻細(xì)胞生長速率[11]、油脂含量[12-13]、光和活性[14]以及氨基酸產(chǎn)量[15]等,特別是在提高細(xì)胞油脂含量方面的應(yīng)用較多,然而有關(guān)利用誘變提高藻細(xì)胞碳水化合物的報道較少[16].相關(guān)研究已經(jīng)證實ARTP在提高藻細(xì)胞多糖以及胞外聚合物(EPS)方面取得了一定的效果.Liu等[17]利用 ARTP誘變寇氏隱甲藻葡萄糖含量提高了 57.17%,但最終含量僅達(dá)到9.4%.Fang等[18]最先利用ARTP誘變鈍頂螺旋藻,獲得碳水化合物占比 33.1%的藻株,但未驗證藻株實際發(fā)酵性能,并且發(fā)現(xiàn) ARTP更適用于單細(xì)胞微生物,然而鈍頂螺旋藻是一種多細(xì)胞微生物,且難以實現(xiàn)單細(xì)胞的分離.

小球藻屬于綠藻,具有高質(zhì)子效率,能夠合成大量碳水化合物并將其轉(zhuǎn)化為生物乙醇[19].本研究以普通小球藻為研究對象,在不同功率條件下利用ARTP對小球藻進(jìn)行輻射,篩選出碳水化合物含量高、生長速率快的優(yōu)勢藻株,并進(jìn)行生物乙醇制備實驗,旨在為制備生物乙醇提供優(yōu)勢原材料.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗藻株 實驗藻株為普通小球藻,購于中國科學(xué)院武漢水生生物研究所,編號為FACHB-25.

1.1.2 實驗試劑 無水乙醇、甘油、三氯甲烷、濃硫酸、苯酚、甲醇、丙酮、BG11培養(yǎng)基配制試劑等,以上試劑均為分析純.

1.2 實驗方法

1.2.1 等離子體誘變 將小球藻培養(yǎng)至對數(shù)生長期備用.ARTP裝置預(yù)熱 30min,誘變平臺距輻射口5mm,進(jìn)氣量為300L/h,電流為1.0A,時間為40s,功率依次為0,20,40,60,80,100,120,140,160W,其中0W為對照.

每次取 0.1mL藻液進(jìn)行輻射處理,然后轉(zhuǎn)移到10mL含有 5%甘油的培養(yǎng)基中避光放置數(shù)小時,以防止光修復(fù)[20-21].稀釋100倍后取0.1mL置于瓊脂固體培養(yǎng)基進(jìn)行平板涂布.根據(jù)固體培養(yǎng)基上長出的藻落個數(shù)計算不同功率條件下的致死率[4].致死率計算公式如下:

式中:B為誘變后在固體培養(yǎng)基上長出的藻株數(shù); C為對照組長出的藻株數(shù).

1.2.2 誘變后小球藻的篩選 在固體培養(yǎng)基上進(jìn)行初次篩選時,選取藻落大(生長快)、相對獨立(純度高)的藻株,用接種環(huán)取出后進(jìn)行孔板擴(kuò)培,同時以未處理的藻落作為對照.培養(yǎng) 2周左右,測定各藻株的OD680和多糖產(chǎn)量,選出生長速率或多糖產(chǎn)量高于原始藻株 20%以上的藻株,將篩選后的藻株多次傳代培養(yǎng),以保證藻株的遺傳穩(wěn)定性.

1.2.3 生長曲線與生物量測定 將各藻株在波長680nm處以相同吸光度接種于 250mL錐形瓶中擴(kuò)培,每天在同一時刻測量各藻株的 OD 值,繪制生長曲線.生物量測定方法采用差重法[22],利用下式計算生物量.

式中:B為生物量,g/L;M1為濾膜烘干后質(zhì)量,g;M2為藻液烘干后濾膜質(zhì)量,g;V 為藻液體積,L.

1.2.4 藻細(xì)胞組分測定 總糖測量方法采用苯酚-硫酸法[23],在 490nm 吸光度下檢測波長,帶入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計算總糖產(chǎn)量以及產(chǎn)率(單位時間、單位體積的藻液中總糖增加的質(zhì)量).淀粉含量的測定采用Solarbio淀粉含量檢測試劑盒.脂肪含量采用氯仿-甲醇法測定[24].蛋白質(zhì)含量采用Bradford法測定[25].

1.2.5 葉綠素?zé)晒饧叭~綠素含量測定 利用調(diào)制葉綠素成像系統(tǒng)評價微藻光合性能.在藻細(xì)胞對數(shù)生長期設(shè)定相關(guān)參數(shù),Meas.Light為3, Act.Light為4,Ext.Ligh為3,Sat.Pluse為5,Gain為1.葉綠素的提取采用 De Souza[4]的方法,在 653nm、666nm、750nm處測量上清液吸光度,帶入下式計算葉綠素含量.

1.2.6 藻細(xì)胞干重中元素占比測定 利用穩(wěn)定同位素比質(zhì)譜儀測定不同藻株干重細(xì)胞中 C、N、P元素占細(xì)胞干重百分比[26].

1.2.7 微藻發(fā)酵方法 在培養(yǎng)末期,通過離心、冷凍干燥將藻液制成藻粉,分別取10g藻粉,根據(jù)Chai等[18]的方法,利用5%(V/V)硫酸進(jìn)行預(yù)處理,利用α-淀粉酶和淀粉葡萄糖苷酶進(jìn)行糖化.

采用同步糖化發(fā)酵(SSF)工藝,發(fā)酵參數(shù)參考Dahnum 等[27],料液比為 1:10,發(fā)酵過程在水浴鍋中進(jìn)行,恒溫 30℃,持續(xù) 84h.發(fā)酵罐中按 1:20(g/mL)加入酵母細(xì)胞和釀酒酵母,同時添加酵母菌生存所需要的營養(yǎng)物質(zhì),包括酵母提取物、KH2PO4和NH4Cl等[19].

1.2.8 乙醇得率計算方法 乙醇濃度測定采用氣相色譜法[19],乙醇得率和單位體積藻液可獲得乙醇產(chǎn)量根據(jù)下式計算:

式中:Y為乙醇產(chǎn)量,g/10gDW;CEtOH為測得的乙醇濃度,×10-6;ρEtOH為乙醇密度,0.789g/cm3;V為發(fā)酵液體積,mL.

式中:YL為單位體積藻液可獲得乙醇產(chǎn)量,g/L; Y為乙醇產(chǎn)量,g/10gDW;DW 為單位體積微藻生物量,mg/L.

2 結(jié)果與分析

2.1 誘變功率條件確定

根據(jù)1.2.1誘變方法,在不同功率下進(jìn)行輻射并計算致死率.圖1表明,致死率隨功率的增加而提高,當(dāng)功率升至 100,120,140,160W 時,致死率分別達(dá)到92.13%,96.52%,99.34%,100%.根據(jù)現(xiàn)代育種理論,致死率在 95%以上獲得正向突變株(高產(chǎn)多糖藻株)幾率最大[10],同時為了保證誘變藻株的生存能力,最終確定功率條件為100W和120W.

圖1 不同功率下小球藻致死率對比Fig.1 Comparison of the lethality rate of Chlorella under different power

2.2 不同藻株生長曲線與多糖對比

不同藻株生長曲線對比如圖 2所示.其中S120-9藻株在對數(shù)生長期內(nèi)生長迅速,在 25d時生物量達(dá)到820mg/L,相對于原始藻株的700mg/L提高了17.14%;S100-7藻株前期OD值高于原始藻株,隨后速率變緩,25d時OD值已經(jīng)低于原始藻株,生物量僅有 600mg/L.而 S120-4藻細(xì)胞在增殖分裂方面受到了抑制,生長曲線增長緩慢,末期生物量僅500mg/L,這很可能是細(xì)胞以生物量為代價應(yīng)對外界環(huán)境的一種保護(hù)機(jī)制,從而更好地抵抗逆境.

圖2 不同藻株生長曲線對比Fig.2 Comparison of growth curves of different algae strains

圖3為不同藻株多糖產(chǎn)量對比.前期各藻株多糖產(chǎn)量相近,一方面該階段各藻株的生物量差異不明顯,另一方面是進(jìn)入對數(shù)生長期,細(xì)胞增殖分裂比較旺盛,消耗細(xì)胞內(nèi)較多營養(yǎng)物質(zhì),多糖得不到有效積累.隨著藻株不斷生長，25d時,各藻株多糖產(chǎn)量達(dá)到峰值,其中S120-9藻株多糖產(chǎn)量達(dá)到237.98mg/L,是原始藻株多糖產(chǎn)量的1.34倍.

圖3 不同藻株多糖產(chǎn)量對比Fig.3 Comparison of polysaccharide yield of different algae strains

不同藻株多糖含量及多糖產(chǎn)率對比如圖 4所示.S100-7、S120-4藻株多糖含量分別達(dá)到34.64%、37.55%,相對于原始藻株分別提高了 32.37%、43.48%.S120-9藻株產(chǎn)率最高為10.09mg/(L·d),其次是 S100-7藻株的 9.18mg/(L·d),較原始藻株的 7.44 mg/(L·d)均有所提高.

圖4 不同藻株多糖含量及產(chǎn)率對比Fig.4 Comparison of polysaccharide content and yield of different algae strains

2.3 不同藻株光合性能比較

葉綠素對于藻類的光合作用進(jìn)程起到至關(guān)重要的作用[28],微藻吸收的光能除了光化學(xué)反應(yīng)外,部分光能也會以熒光形式釋放,利用葉綠素?zé)晒夂饬坎煌逯陮饽艿奈绽们闆r[29].

通過圖5(a)可以發(fā)現(xiàn)S120-9藻株的Y(Ⅱ)值較高,開放的 PSⅡ反應(yīng)中心捕獲光能并用于光化學(xué)反應(yīng)[20],較高的光合作用效率有助于藻細(xì)胞生長代謝,為生物量獲取打下基礎(chǔ),同時也加快了碳水化合物的合成.而S120-4藻株實際光合作用效率較弱,這也使得該藻株生物量有所減少.

圖5 不同藻株光合參數(shù)對比Fig.5 Comparison of photosynthetic parameters of different algae strains

圖 5(b)中 S100-7、S120-9兩株藻的表觀電子傳遞速率(ETR)較原始藻株得到提高,由此經(jīng)過光反應(yīng)得到更多的 ATP和 NADPH,后者驅(qū)動 Calvin—Benson—basham 循環(huán)在暗相產(chǎn)生碳水化合物[30].Gupta等[31]發(fā)現(xiàn)微藻細(xì)胞通過氧化磷酸化進(jìn)一步分解細(xì)胞內(nèi)葡萄糖,生成ATP用于細(xì)胞分裂,這也解釋了藻株進(jìn)入對數(shù)生長期后多糖含量增加不明顯但生物量快速增加的原因.圖 5(c)為不同藻株的葉綠素含量對比,S100-7、S120-9藻株的葉綠素a、葉綠素 b含量較原始藻株有所提高,這有利于加強(qiáng)光能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能,從而加快葡萄糖、淀粉等碳水化合物合成.

2.4 不同藻株細(xì)胞組分含量分析

藻細(xì)胞代謝過程中,淀粉和脂類的合成過程中有相同的 C3前體[32],首先積累淀粉顆粒,然后積累含有三酰甘油酯的脂質(zhì)體,其代謝過程高度相關(guān)[33].圖 6為各藻株細(xì)胞組分含量對比情況,篩選藻株的淀粉含量均有所增加,特別是S120-4藻株淀粉含量達(dá)到24.04%,比原始藻株提高了41.66%.同時發(fā)現(xiàn)篩選藻株的油脂含量有所降低,這表明細(xì)胞在吸收利用的碳源更多的流向合成淀粉的方向.蛋白質(zhì)的含量與細(xì)胞分裂有密切聯(lián)系[34],各藻株的蛋白質(zhì)含量差異不大,但S120-4藻株略有減少,這也一定程度上導(dǎo)致該藻株生物量較少.

圖6 不同藻細(xì)胞組分含量對比Fig.6 Comparison of the content of different algae cell components

C的吸收利用與細(xì)胞內(nèi)淀粉、油脂等儲能物質(zhì)的合成息息相關(guān);N有助于微藻生物量生產(chǎn)和能量傳輸,是藻細(xì)胞中蛋白質(zhì)、酶以及葉綠素在內(nèi)重要元素[35];P參與ATP的合成,在藻細(xì)胞能量循環(huán)中充當(dāng)重要角色[36].各藻細(xì)胞干重中元素占比情況如圖 7所示.S120-4藻株中C增加最為明顯,高達(dá)47.57%,這與其較高碳水化合物含量相一致.N含量對比中,S120-4藻株最少僅有 3.75%,因此該藻細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)以及葉綠素較少.S100-7、S120-9藻株P(guān)比例分別為 0.51%、0.56%,較原始藻株的 0.49%有所提高,這也解釋了這兩株藻對數(shù)期生長較快的原因.

圖7 不同藻細(xì)胞干重中C、N、P元素占比Fig.7 The proportion of C, N, P in the dry weight of different algae cells

2.5 不同藻株形態(tài)差異對比

從表 1可以看出原始藻株 90%的細(xì)胞粒徑在7nm 以下,3～11nm 范圍內(nèi)包含了 99.36%的藻細(xì)胞,普通小球藻細(xì)胞粒徑一般在 3～8nm范圍內(nèi).S100-7藻株粒徑則整體偏大,7nm以下的在細(xì)胞僅占52.28%,11nm 以下的藻細(xì)胞也只占到 73.23%,這表明 ARTP誘變對細(xì)胞形態(tài)產(chǎn)生了較大影響,一方面可能是影響細(xì)胞的分裂增殖,改善了細(xì)胞增殖分裂能力,另一方面就是改變了單個細(xì)胞的形態(tài)大小.S120-4與 S120-9細(xì)胞粒徑分布比例較為相近,7nm 以下比例分別為 55.65%和 65.37%,粒徑在15nm以下的藻細(xì)胞分別占比為 94.75%和 96.34%,藻細(xì)胞粒徑整體要大于原始藻株.通過圖 8的電鏡圖片可以對比藻細(xì)胞形態(tài)變化,相比于原始藻株(a),S100-7(b)藻細(xì)胞更加飽滿,S120-4(c)和 S120-9(d)表面則相對粗糙一些,這部分可能是藻細(xì)胞產(chǎn)生的胞外聚合物.

表1 不同藻株粒徑分布Table 1 Particle size distribution of different algae strains

圖8 掃描電鏡下各藻株形態(tài)對比Fig.8 Morphological comparison of different algae under scanning electron microscope

2.6 不同藻株乙醇產(chǎn)量分析

圖9為各藻株制備乙醇情況對比.經(jīng)過84h的發(fā)酵過程,原始藻株、S100-7、S120-4、S120-9四株藻每10g藻粉得到生物乙醇產(chǎn)量分別為1.12、1.41、1.58、1.26g,多糖含量最高的S120-4藻株乙醇制備量最高,是原始藻株的1.41倍.

圖9 不同藻株乙醇產(chǎn)量以及生物量對比Fig.9 Comparisons of ethanol production and biomass of different algae strains

由于 S120-4藻株在培養(yǎng)周期內(nèi)生物量積累受限,因此結(jié)合各藻株培養(yǎng)階段生物量積累情況,最終推算出原始藻株、S100-7、S120-4、S120-9單位體積藻液乙醇產(chǎn)量分別為 0.0784、0.0846、0.079、0.1033g/L.綜合比較而言,S120-9藻株在制備乙醇方面具有顯著的優(yōu)勢,是經(jīng)過 ARTP誘變篩選后取得的優(yōu)勢藻株.

3 結(jié)論

3.1 利用ARTP在功率100W和120W條件下輻射小球藻 FACHB-25,篩選出了較為理想的誘變藻株,其中S120-4藻株碳水化合物含量達(dá)到37.55%,提高了 43.48%; S120-9藻株生物量達(dá)到 820mg/L,多糖產(chǎn)量是原始藻株 1.34倍.目前各藻株相關(guān)數(shù)據(jù)均在實驗室內(nèi)完成,需要后續(xù)在大規(guī)模微藻培養(yǎng)過程中得到各藻株性能的進(jìn)一步驗證.

3.2 藻株的篩選必須在生物量和碳水化合物含量之間做好權(quán)衡.S120-4藻株在相同干重下,乙醇產(chǎn)量是原始藻株的 1.41倍,就提高藻細(xì)胞碳水化合物含量而言,S120-4藻株是篩選出的優(yōu)勢藻株.但藻細(xì)胞內(nèi)碳水化合物積累越多,生物量限制越明顯.結(jié)合各藻株生物量,推算出理論上乙醇產(chǎn)量最多的是S120-9藻株,為0.1033g/L,具有較好的應(yīng)用前景.