基于matK 序列的24 個(gè)茶樹品種親緣關(guān)系

卓雄標(biāo)，陳美霞，彭成彬，王澤榕，張?jiān)氯A，沈小蓮，劉 偉*

（1.寧德師范學(xué)院 資產(chǎn)后勤管理處，福建 寧德 352100；2.寧德師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，福建 寧德 352100；3.福建省科技廳產(chǎn)學(xué)研合作示范基地，福建 寧德 352100）

茶（Camellia sinensis(L.) O.Kuntze）屬山茶科山茶屬的雙子葉植物.福建福安的產(chǎn)茶歷史悠久，素有“中國(guó)茶葉之鄉(xiāng)”之稱.隨著人們生活水平的提高，對(duì)茶的需求量也在增加，茶葉的產(chǎn)量與銷量成為限制當(dāng)?shù)剞r(nóng)民經(jīng)濟(jì)來源的主要因素之一.由于茶樹的雜交育種現(xiàn)象越來越多，與母系越來越難區(qū)分，種間同名異物或同物異名的現(xiàn)象時(shí)常發(fā)生，阻礙了茶樹資源的保護(hù)、保存和綜合利用，單從形態(tài)學(xué)特征已經(jīng)難以區(qū)分，亟需在分子水平進(jìn)行更準(zhǔn)確地鑒定.

2003年，Hebert 等［1-2］首次提出了“DNA 條形碼”，DNA 條形碼是通過一段或幾段通用的標(biāo)準(zhǔn)DNA 序列對(duì)物種進(jìn)行識(shí)別和鑒定的技術(shù)，已成為物種鑒定及發(fā)現(xiàn)新的或隱性物種的有用工具.2009 年國(guó)際條形碼聯(lián)盟將matK基因推薦為陸地植物核心條碼候選片段之一［3］，因?yàn)樵摶驅(qū)儆谌~綠體基因組上的賴氨酸t(yī)rnK基因內(nèi)含子的一部分，參與RNA 轉(zhuǎn)錄體中II 型內(nèi)含子剪切，是進(jìn)化速率最快的單編碼基因之一.Kondo 等［4］采用rbcL基因和Fushimi 等［5］采用18SrRNA基因?qū)Υㄜ汉腿毡敬ㄜ哼M(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)序列完全相同，劉玉萍等［6］利用matK基因和ITS基因進(jìn)行再次分析，發(fā)現(xiàn)川芎與日本川芎間matK基因、ITS基因均有1 個(gè)變異位點(diǎn)，結(jié)合之前的研究結(jié)果，作者認(rèn)為中日所產(chǎn)川芎基原一致，日本川芎學(xué)名應(yīng)改為L(zhǎng)igusticum chuanxiongHort.，這也充分說明該標(biāo)記的有效性.需注意的是matK基因應(yīng)用在不同物種擴(kuò)增時(shí)，體系、反應(yīng)程序、結(jié)果不是完全一致，因此，首先要對(duì)引物進(jìn)行篩選.楊俊波等［7］通過matR基因序列分析表明傳統(tǒng)山茶亞科和厚皮香亞科不構(gòu)成姐妹群關(guān)系.宋艷波等［8］對(duì)22 個(gè)核桃品種進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)有17個(gè)SNP 位點(diǎn)，可以準(zhǔn)確區(qū)分早、晚實(shí)核桃類群，在不同種間關(guān)系研究只能劃分遺傳差異較大者，可為品種篩選提供初步信息.

雖然已有很多matK基因的研究報(bào)道，但卻鮮見其在茶樹物種方面的研究.本實(shí)驗(yàn)通過matK基因?qū)?4個(gè)茶樹品種進(jìn)行分析，探索該技術(shù)在茶樹品種鑒定中的適用性，為茶樹DNA 條形碼的開發(fā)提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 供試材料

2019 年，在福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所采集24 個(gè)茶樹品種的鮮葉，選無病害的一芽一葉或二葉，采樣時(shí)間為上午8:00—10:00.樣品基本信息見表1.

表1 供試材料基本信息

1.2 DNA 提取及檢測(cè)

參照天根生化科技(北京）有限公司的植物基因組DNA 提取試劑盒說明書，提取樣本總基因組DNA.用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 純度，用超微量紫外可見分光光度儀檢測(cè)DNA 濃度.

1.3 PCR 擴(kuò)增及序列測(cè)定

通用引物 matK 基因序列為 CGTACAGTACTTTTGTGTTTACGAG 和 ACCCAGTCCATCTGGAAATCTTGGTTC，PTC-100 PCR 儀進(jìn)行擴(kuò)增.反應(yīng)體系：DNA 模板2.0 μL，正反向引物（10 μmol·L-1）各1.0 μL，2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，ddH2O 補(bǔ)齊至25 μL.擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性1 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸50s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min.產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，合格PCR 產(chǎn)物委托福州博尚（尚辰）生物技術(shù)公司進(jìn)行雙向測(cè)序及序列拼接.

1.4 茶樹matK 基因片段的序列分析及鑒定

采用MEGA 7.0 軟件對(duì)所得基因片段進(jìn)行比對(duì)分析，統(tǒng)計(jì)片段長(zhǎng)度、變異位點(diǎn)，構(gòu)建鄰接(Neighbor joining，NJ)系統(tǒng)發(fā)育樹和最簡(jiǎn)約(Maximum parsimony,MP)系統(tǒng)發(fā)育樹.采用DNA star 軟件計(jì)算不同樣本之間的遺傳距離.

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA 提取及檢測(cè)

本研究利用植物基因組DNA 提取試劑盒提取24 份茶樹基因組DNA，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，由圖1 可以看出，點(diǎn)樣孔附近干凈無雜帶，說明沒有蛋白質(zhì)污染.

圖1 部分茶樹基因組DNA 電泳圖

因茶樹富含多種物質(zhì)，基因組DNA 經(jīng)檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)部分樣品D（260）/D（280）比值超過2.0，推測(cè)在提取過程中出現(xiàn)了核酸降解，或者DNA 不純，有RNA 存在.為了獲得純度較好的基因組DNA，再次純化，由表2 可以看出，參試樣本的D（260）/D（280）值集中在1.8～2.0 之間，符合下一步實(shí)驗(yàn)要求.24 份參試樣品的總濃度多在80 ng·μL-1以上，僅有樣品編號(hào)FA1 和FA24 兩份樣品濃度低于80 ng·μL-1,分別是65 和63 ng·μL-1，這說明提取的總DNA 濃度較高，該試劑盒適合用于茶樹基因組DNA 提取.為了保證樣品的純度，可增加一次氯仿、異戊醇的去蛋白純化過程.

表2 DNA 質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果

2.2 PCR 擴(kuò)增與測(cè)序

不同樣本matK 基因的PCR 擴(kuò)增結(jié)果如圖2 所示，產(chǎn)物片段為750～1 000 bp 之間的特異條帶，條帶單一、清晰、明亮，說明PCR 擴(kuò)增成功，可直接測(cè)序.

圖2 茶樹matK 基因片段的PCR 結(jié)果

2.3 matK 基因變異分析

對(duì)測(cè)序的24 個(gè)樣本的基因序列進(jìn)行分析，長(zhǎng)度介于720～900 bp 之間，存在21 個(gè)變異位點(diǎn)（表3），分別發(fā)生在第126、130、151、161 bp 處的T-A 的顛換，第127、291 bp 處的A-G 的轉(zhuǎn)換，第128 bp 處的T-C 的轉(zhuǎn)換，第136 bp 處的C-G 的顛換，第137、142、143、162 bp 處的G-T 的顛換，第138、139、146 bp處的A-T 的顛換，第145、270 bp 處的C-T 的轉(zhuǎn)換，第156、292 bp 處的G-A 的轉(zhuǎn)換，第163 bp 處的AC 的顛換，第160 bp 處的C-A 顛換和C-T 轉(zhuǎn)換,第160 bp 處的C-A 顛換頻率為22.2%，C-T 轉(zhuǎn)換頻率為77.8%.從表3 也可以得出，F(xiàn)A14（早春毫）的變異位點(diǎn)最多，有18 個(gè)；FA3（黃觀音）、FA7（黃玫瑰）、FA8（朝陽）、FA24（未命名）各有2 個(gè)變異位點(diǎn)；FA4（悅銘香）、FA10（九龍袍）、FA19（紅芽佛手）、FA21（白芽奇蘭）、FA22（霞浦元宵綠）各有1 個(gè)變異位點(diǎn).

表3 24 個(gè)茶樹品種matK 序列變異位點(diǎn)

2.4 遺傳距離分析

24 個(gè)茶樹品種的matK 序列多重比較并生成遺傳距離示意圖（圖3），可看出參試樣本種間遺傳距離分化系數(shù)在0～4.3 之間，百分比為97.2%～100%.FA14（早春毫）與其它品種的分化系數(shù)相比，其分化系數(shù)最大，平均為2.54，百分比最小為97.3%.

圖3 24 個(gè)茶樹物種的遺傳距離示意圖

2.5 構(gòu)建進(jìn)化樹

24 個(gè)茶樹品種matK 序列的NJ 系統(tǒng)發(fā)育樹如圖4 所示，F(xiàn)A14 單獨(dú)聚為一支，與其他品種差異明顯；FA4、FA10、FA19、FA21、FA22 聚為一支；FA7、FA24、FA3 聚為一支，其中FA7 和FA24 親緣關(guān)系較FA3 近；其余15 個(gè)樣本聚為一支.構(gòu)建的MP 系統(tǒng)發(fā)育樹如圖5 所示，F(xiàn)A14 單獨(dú)聚為一支，F(xiàn)A7、FA24、FA3 聚為一支，與NJ 系統(tǒng)發(fā)育樹一致；其余20 個(gè)樣本聚為一支，其中NJ 系統(tǒng)發(fā)育樹單獨(dú)聚為一支的FA4、FA10、FA19、FA21、FA22，在MP 系統(tǒng)發(fā)育樹仍然聚在一起，兩種構(gòu)建方法得到的結(jié)果基本一致.

圖4 基于matK 序列構(gòu)建的NJ 系統(tǒng)樹

圖5 基于matK 序列構(gòu)建的MP 系統(tǒng)樹

3 討論與結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)matK 序列進(jìn)行變異位點(diǎn)分析，總變異位點(diǎn)21 個(gè)，其中早春毫的變異位點(diǎn)有18 個(gè)，該品種是福建農(nóng)科院茶葉研究所從迎春的自然雜交后代中采用單株選種法育成的，這可能也是早春毫與其他山茶屬之間親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的原因.

在不同品種之間的鑒定，很難找到一種單一的DNA 條形碼來區(qū)分所有樣品，NJ 法和MP 法兩種建樹方法，24 個(gè)樣本僅可以分為4 大類，且只有早春毫可以明顯的被區(qū)分，其余樣本之間差異不夠明顯，說明matK 基因在分析種間的親緣關(guān)系還是比較困難.不同學(xué)者針對(duì)不同物種提出了多種序列組合分析的方案，今后擬考慮擴(kuò)大序列組合，增加葉綠體基因組非編碼基因片段trnH-psbA 序列和核基因組內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔序列ITS，提高不同品種之間鑒定率.

本實(shí)驗(yàn)研究了24 個(gè)茶樹品種的matK 基因，近3＇ 端比較保守區(qū)域，差異相對(duì)較小，序列長(zhǎng)度在720～900 bp 之間，已報(bào)道完整的不同物種matK 基因全長(zhǎng)約1 500～2 000 bp，接下來在現(xiàn)有序列基礎(chǔ)上重新設(shè)計(jì)引物對(duì)全長(zhǎng)進(jìn)行克隆，預(yù)測(cè)氨基酸組成，引入外類群對(duì)山茶屬不同物種的親緣關(guān)系進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定.