超高壓液相色譜法測(cè)定水果和蔬菜中蟲螨腈及其代謝物以及在甘藍(lán)中的殘留評(píng)價(jià)應(yīng)用

王 坦1，孫 強(qiáng)1，沈沁怡1，陳珊珊1，溫廣月1，趙 莉2，董茂鋒1*，王偉民1*

（1.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)藥安全評(píng)價(jià)研究中心，上海 201106；2.上海市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心，上海 201103）

蟲螨腈又名溴蟲腈，屬于新型吡咯類殺蟲殺螨劑，具有殺蟲譜廣、防效高及持效長的特點(diǎn)，在我國廣泛用于大白菜、小白菜、柑橘、蘋果等多種蔬菜和水果作物。但由于其持效長，在農(nóng)產(chǎn)品中的半衰期較長，易造成殘留，進(jìn)而危害農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全，因此存在一定的膳食安全風(fēng)險(xiǎn)［1］。

雖然我國《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量》（GB 2763－2019）［2］中蟲螨腈的殘留定義為蟲螨腈，但聯(lián)合國糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織農(nóng)藥殘留聯(lián)席會(huì)議（JMPR）報(bào)告分別對(duì)其殘留和膳食風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估規(guī)定了不同的檢測(cè)要求，殘留定義為蟲螨腈，膳食風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估定義為蟲螨腈及其代謝物溴代吡咯腈，以蟲螨腈與溴代吡咯腈10 倍之和計(jì)［3］。溴代吡咯腈是生產(chǎn)蟲螨腈的重要中間體［4］。目前，國內(nèi)外針對(duì)蟲螨腈的檢測(cè)方法較多，主要有液相色譜法［5－6］、氣相色譜法［7］或氣相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法（GC－MS/MS）［8］，而關(guān)于其代謝物溴代吡咯腈的相關(guān)報(bào)道較少，主要采用液相色譜［4］或液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法（LC－MS/MS）［9］進(jìn)行檢測(cè)。我國食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB 2763－2019 的推薦方法雖然滿足蟲螨腈的日常檢測(cè)需求，但無法滿足JMPR 關(guān)于蟲螨腈膳食風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估定義的要求。孫豐收等［10］將甘藍(lán)樣品采用乙腈提取，分散固相萃取凈化后，利用GC－MS/MS檢測(cè)蟲螨腈，LC－MS/MS檢測(cè)溴代吡咯腈，但由于采用兩種檢測(cè)技術(shù)，且前處理步驟繁瑣，為日常檢測(cè)增加了工作量。

本文建立了固相萃取凈化結(jié)合超高壓液相色譜同時(shí)測(cè)定水果和蔬菜中蟲螨腈及其代謝物溴代吡咯腈的分析方法。該方法靈敏度高、選擇性好，能夠滿足水果和蔬菜中蟲螨腈及溴代吡咯腈殘留的定量分析和膳食安全評(píng)價(jià)要求。為進(jìn)一步驗(yàn)證所建方法的適用性，將該方法應(yīng)用于360 g·L－1蟲螨腈懸浮劑在甘藍(lán)上的動(dòng)態(tài)消解、最終殘留測(cè)定和膳食風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，從而為蟲螨腈的安全使用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

UPLC－30AD 超高壓液相色譜儀配備二極管陣列檢測(cè)器（SPD－M20A）、InertSustain C18色譜柱（2.1 mm × 150 mm，3.0 μm）均購于日本Shimadzu 公司；HR2101 食品粉碎機(jī)（荷蘭Philips 公司）；MS 105DU 電子天平（感量：0.1 mg，最大量程：120 g，瑞士梅特勒公司）；數(shù)顯多管渦旋混合器（美國Talboys 公司）；Hypersep C18固相萃取柱（500 mg/6 mL）、Thermo－Fisher ST16 離心機(jī)（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；arium?mini 實(shí)驗(yàn)室超純水系統(tǒng)（德國Sartorius 公司）；乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）、CNWBOND GCB/NH2固相萃取柱（500 mg/6 mL）、CNWBOND Florisil 固相萃取柱（500 mg/3mL）、CNWBOND NH2固相萃取柱（500 mg/6 mL）、CNWBOND PSA 固相萃取柱（500 mg/6 mL）、CNWPoly－SeryHLB固相萃取柱（150 mg/6 mL，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）。

乙腈（色譜純，德國Merck公司）；乙腈、氯化鈉、甲苯、無水硫酸鎂（分析純，中國國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；多壁碳納米管（南京先豐納米材料科技有限公司）；有機(jī)相尼龍針式濾器（0.22 μm，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）。

蟲螨腈標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 000 mg/L，溶劑：乙腈）和溴代吡咯腈標(biāo)準(zhǔn)品（純度98.6%）均購于北京振翔科技有限公司。蔬菜和水果樣品（甘藍(lán)、茄子、小白菜、韭菜、蘋果、柑橘）均為市場(chǎng)購買。

1.2 分析方法

1.2.1 前處理方法分別取1 kg 左右樣品，切碎后用食品粉碎機(jī)勻漿制備，放入樣品罐中，于(－20±2）℃冰柜中保存。

稱?。?.0 ± 0.05）g 粉碎均勻的樣品于50 mL 塑料離心管中，加入10 mL 乙腈，渦旋提取20 min，再加入5 g NaCl，渦旋30 s，5 000 r/min 離心5 min。吸取4 mL 上清液于50 mL 燒杯中，在50 ℃下氮吹近干。

分別用5 mL乙腈－甲苯（3∶1，體積比，下同）預(yù)淋洗NH2固相萃取柱。用5 mL乙腈－甲苯（3∶1）溶解燒杯中的殘?jiān)D(zhuǎn)入柱中，再用5 mL乙腈－甲苯（3∶1）洗脫并收集，于50 ℃下氮吹近干，用1 mL乙腈定容，經(jīng)0.22μm微膜過濾，待測(cè)。

1.2.2 液相色譜條件色譜柱：島津Inert Sustain C18（2.1 mm×150 mm，3.0μm）；柱溫：40 ℃；流速：0.5 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；檢測(cè)波長：262 nm（蟲螨腈），284 nm（溴代吡咯腈）；流動(dòng)相：水（A）和甲醇（B）。洗脫條件：0～1 min，30%B；1～5 min，30%～80%B；5～9 min，80%B；9～10 min，80%～30%B；10～14 min，30%B。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線、準(zhǔn)確度與精密度

稱取適量溴代吡咯腈標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈配制為1 002μg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。再與1 000μg·mL-1蟲螨腈標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋配制成質(zhì)量濃度分別為25、100、500、1 000、5 000 ng·mL-1的系列溶劑標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。按照預(yù)定的儀器條件測(cè)定，以各組分的峰面積響應(yīng)值（Y）為縱坐標(biāo)，其質(zhì)量濃度（X，ng·mL-1）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

選擇代表性的4種蔬菜（甘藍(lán)、茄子、小白菜、韭菜）和2種水果（蘋果、柑橘）為考察基質(zhì)，分別進(jìn)行0.05、1、2 mg·kg-13個(gè)不同水平的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)水平重復(fù)測(cè)定5次，以回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別評(píng)價(jià)方法的準(zhǔn)確度和精密度。

1.4 田間試驗(yàn)

2020年，按照《農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則》（NY/T 788－2018）［11］要求，分別在上海市、山西省、河北省、湖南省、遼寧省、河南省、山東省、安徽省、江西省、廣西壯族自治區(qū)、貴州省、海南省十二地開展殘留田間試驗(yàn)（其中上海市、山西省、河北省、湖南省同時(shí)開展動(dòng)態(tài)消解試驗(yàn)）。每個(gè)試驗(yàn)設(shè)立2個(gè)試驗(yàn)小區(qū)（100 m2），分別為處理小區(qū)和空白對(duì)照小區(qū)。處理小區(qū)按照20 mL/畝（125.28 g a.i./ha），設(shè)1 次施藥。施藥后2 h、7、14、21、28 d 分別隨機(jī)采集2 個(gè)甘藍(lán)樣品用于消解殘留試驗(yàn)，其中14、21 d的樣品作為最終殘留試驗(yàn)樣品。每次在試驗(yàn)小區(qū)內(nèi)隨機(jī)采集至少12個(gè)（不少于2 kg）生長正常、無病害的甘藍(lán)，裝入容器中包扎妥當(dāng)，粘好標(biāo)簽。小區(qū)邊行和每行距離兩端0.5 m 內(nèi)不采樣。田間樣品在采集后，8 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，并立即制備成實(shí)驗(yàn)室樣品冷凍保存。

甘藍(lán)樣品預(yù)制備：將甘藍(lán)田間樣品切成1 cm 大小的碎塊，在不銹鋼盆中充分混勻，用四分法縮分樣品，于（－20±2）℃冰柜中保存。分析前，用食品粉碎機(jī)將甘藍(lán)勻漿。

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器條件的優(yōu)化

蟲螨腈可通過液相色譜、氣相色譜和氣相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行測(cè)定［5－8］，而溴代吡咯腈可通過液相色譜、液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行測(cè)定［4，9］。為簡(jiǎn)化步驟、提高檢測(cè)效率，參考現(xiàn)有分析方法報(bào)道，通過儀器條件優(yōu)化，本文采用配有二極管陣列檢測(cè)器的液相色譜儀實(shí)現(xiàn)蟲螨腈和溴代吡咯腈的同時(shí)檢測(cè)。

首先，分別用甲醇配制10μg·mL－1的蟲螨腈和溴代吡咯腈標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在210～400 nm 紫外吸收波長范圍進(jìn)行掃描。結(jié)果顯示，蟲螨腈和溴代吡咯腈分別在262、284 nm 處有較大且穩(wěn)定的紫外吸收，因此確定蟲螨腈和溴代吡咯腈的紫外檢測(cè)波長分別為262、284 nm。

同時(shí)，實(shí)驗(yàn)考察了水相流動(dòng)相固定為水，有機(jī)相流動(dòng)相分別為乙腈或甲醇時(shí)的分離效果。結(jié)果表明，在“1.2.2”的梯度條件下，當(dāng)有機(jī)相為乙腈時(shí)，蟲螨腈和溴代吡咯腈的色譜峰分離效果較差，且溴代吡咯腈的峰形較寬，不夠尖銳。而以甲醇作為有機(jī)相時(shí)，2 個(gè)化合物的色譜峰分離效果好，且峰形對(duì)稱尖銳，基線平穩(wěn)，因此選擇甲醇作為有機(jī)相。

實(shí)驗(yàn)以甲醇為有機(jī)相流動(dòng)相，考察了水相流動(dòng)相分別為水或0.1%甲酸水時(shí)目標(biāo)化合物的分離效果。結(jié)果顯示，當(dāng)水相流動(dòng)相為水時(shí)，目標(biāo)化合物的儀器響應(yīng)值較高，峰形對(duì)稱性好，因此確定流動(dòng)相為水和甲醇體系。通過調(diào)整流動(dòng)相比例和流速，在“1.2.2”最佳色譜條件下，實(shí)現(xiàn)了蟲螨腈和溴代吡咯腈的良好分離，其保留時(shí)間分別為8.48 min和7.58 min（圖1）。

圖1 蟲螨腈和溴代吡咯腈標(biāo)準(zhǔn)溶液（1μg·mL-1）的色譜圖Fig.1 Chromatograms of chlorfenapyr and tralopyril standard solutions（1μg·mL-1）

2.2 前處理方法的優(yōu)化

作為農(nóng)藥殘留分析應(yīng)用最為廣泛的前處理凈化方式，固相萃取和分散固相萃取方法對(duì)于多種農(nóng)作物基質(zhì)具有良好的凈化效果［12－13］。選取我國現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)分析方法［14－18］和文獻(xiàn)報(bào)道方法［10，19－23］的前處理方式，本文通過配備二極管陣列檢測(cè)器的超高壓液相色譜儀測(cè)定甘藍(lán)中蟲螨腈及溴代吡咯腈，并通過測(cè)定方法回收率和精密度驗(yàn)證前處理方法的適用性。

如表1 所示，除了GB/T 20769－2008 方法［18］和本方法外，其他前處理方法的回收率和RSD 均不能滿足同時(shí)分析蟲螨腈及溴代吡咯腈的要求。采用已有報(bào)道中的前處理方法［10］雖能夠?qū)崿F(xiàn)蟲螨腈的分析測(cè)定（圖2A），但對(duì)于溴代吡咯腈的定量分析存在嚴(yán)重干擾（圖2C），說明采用文獻(xiàn)中QuEChERS方法結(jié)合質(zhì)譜檢測(cè)［10］雖能夠?qū)崿F(xiàn)蟲螨腈和溴代吡咯腈的分析要求，但無法滿足液相色譜配二極管陣列檢測(cè)器的檢測(cè)要求。表明QuEChERS 方法凈化效果略差，與文獻(xiàn)［24］結(jié)論相符?？紤]到GB/T 20769－2008 的前處理方法適用于多殘留，溶劑用量較大，因此，在保證準(zhǔn)確度和精密度的前提下，對(duì)萃取溶劑和洗脫溶劑的用量進(jìn)行了優(yōu)化。選擇3 次5 mL 乙腈－甲苯（3∶1）用于提取和洗脫目標(biāo)化合物，前處理方法見“1.2.1”，得到蟲螨腈和溴代吡咯腈的回收率為84.6%～95.1%，RSD為3.2%～9.1%，且凈化效果明顯優(yōu)于QuEChERS方法，完全可以滿足殘留分析要求（圖2B、2D）。

圖2 QuEChERS方法（A、C）與氨基固相萃取柱（B、D）的凈化效果色譜圖Fig.2 Chromatograms of purification effect with QuEChERS（A，C）and NH2 SPE column（B，D）

表1 不同前處理方式下甘藍(lán)中蟲螨腈及溴代吡咯腈的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（1 mg·kg－1，n=5）Table 1 Recoveries and RSDs of chlorfenapyr and tralopyril in cabbage with different pretreatment methods（1 mg·kg－1，n=5）

2.3 線性關(guān)系與定量下限

按照“1.3”方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明，蟲螨腈和溴代吡咯腈在25～5 000 ng·mL－1質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（r2）分別為0.997和1.000。參照文獻(xiàn)［10］，以最低加標(biāo)水平（0.05 mg·kg－1）為本方法的定量下限。依據(jù)我國食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB 2763－2019 制定的蟲螨腈在7 種水果和蔬菜中的最大殘留限量（MRL）0.1～10 mg·kg－1［2］，本方法的定量下限（0.05 mg·kg－1）能夠滿足水果和蔬菜中的檢測(cè)要求。

2.4 準(zhǔn)確度與精密度

按照“1.3”方法以6 種蔬菜和水果為基質(zhì)進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示在0.05、1、2 mg·kg－13 個(gè)加標(biāo)水平下，蟲螨腈和溴代吡咯腈的回收率為84.6%～111%，RSD 為1.6%～14%（見表2）。表明該方法的準(zhǔn)確度和精密度符合我國《農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則》（NY/T 788－2018）要求［11］。

2.5 方法應(yīng)用

依據(jù)我國《農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則》（NY/T 788－2018）［11］要求，2020年開展了甘藍(lán)上360 g·L－1蟲螨腈懸浮劑12地田間殘留試驗(yàn)，以所構(gòu)建的方法對(duì)甘藍(lán)中蟲螨腈及溴代吡咯腈的殘留量進(jìn)行檢測(cè)。在上海市、山西省、河北省、湖南省4地的殘留消解試驗(yàn)結(jié)果顯示，甘藍(lán)中目標(biāo)化合物的殘留量隨著采樣時(shí)間呈明顯下降趨勢(shì)，符合一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程Ct=C0e－kt［25］。式中，k為降解速率常數(shù)；C0為農(nóng)藥的初始含量（mg·kg－1）；Ct為t時(shí)刻農(nóng)藥的含量（mg·kg－1）。蟲螨腈在甘藍(lán)中的殘留量為小于0.05～0.735 mg·kg－1，所有樣品中溴代吡咯腈的殘留量均低于定量下限（0.05 mg·kg－1）。蟲螨腈在山西省、河北省、湖南省甘藍(lán)上的消解半衰期分別為11.0、4.1、5.3 d，上海市甘藍(lán)中蟲螨腈的殘留數(shù)據(jù)無法擬合曲線（見表3）。對(duì)比相關(guān)文獻(xiàn)，蟲螨腈在甘藍(lán)上的半衰期（2.2～16.5 d）［26-27］與本文所得的半衰期（4.1～11.0 d）較一致，而由于氣候、作物、土壤中微生物菌群等因素，不同產(chǎn)地甘藍(lán)中蟲螨腈的半衰期差別較大。

表3 蟲螨腈在甘藍(lán)中的動(dòng)態(tài)消解Table 3 Dissipation dynamic of chlorfenapyr in lettuce

表4 數(shù)據(jù)顯示，當(dāng)采樣間隔期為14 d 時(shí)，甘藍(lán)上蟲螨腈的殘留量為小于0.05～0.488 mg·kg－1；殘留中值（STMR）為0.05 mg·kg－1，殘留最大值（HR）為0.488 mg·kg－1；溴代吡咯腈的殘留量均低于定量下限（0.05 mg·kg－1）；根據(jù)JMPR報(bào)告［3］中蟲螨腈的膳食風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估定義，甘藍(lán)中蟲螨腈（膳食風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估定義）的殘留量為小于0.55～0.988 mg·kg－1，殘留中值為0.55 mg·kg－1，殘留最大值為0.988 mg·kg－1。根據(jù)我國食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB 2763－2019［2］設(shè)定蟲螨腈在甘藍(lán)中的最大殘留限量1 mg·kg－1，本文推薦360 g·L－1蟲螨腈懸浮劑在甘藍(lán)上的采收間隔期為14 d。

表4 蟲螨腈和溴代吡咯腈在甘藍(lán)中的最終殘留Table 4 Final residues of chlorfenapyr and tralopyril in lettuce

根據(jù)食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB 2763－2019，蟲螨腈的每日允許攝入量（ADI）為0.03 mg/kg bw［2］。目前，我國蟲螨腈的登記作物包括韭菜、甘藍(lán)、芥藍(lán)、小白菜、大白菜、茄子、黃瓜、節(jié)瓜、豇豆、豆角、姜、柑橘、蘋果、梨、茶葉。根據(jù)我國現(xiàn)有的最大殘留限量以及膳食風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估作物分類，選擇普通白菜（參考中國限量10 mg/kg［2］）、姜（參考韓國限量0.1 mg/kg［28］）、蘋果（參考澳大利亞限量0.5 mg/kg［29］）、茶葉（參考中國限量20 mg/kg［2］），結(jié)合我國人均膳食結(jié)構(gòu)，按照長期攝入計(jì)算蟲螨腈的膳食風(fēng)險(xiǎn)。普通人群蟲螨腈（膳食風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估定義）的國家估算每日攝入量為1.28 mg，占日允許攝入量的67.7%。表明蟲螨腈對(duì)一般人群健康不會(huì)產(chǎn)生不可接受的風(fēng)險(xiǎn)［30］。

3 結(jié) 論

本文建立了采用固相萃取凈化和超高壓液相色譜同時(shí)測(cè)定水果和蔬菜中蟲螨腈及其代謝物溴代吡咯腈殘留量的分析方法，該方法簡(jiǎn)單、高效、準(zhǔn)確，方法驗(yàn)證結(jié)果符合我國《農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則》（NY/T 788－2018）要求［11］。田間殘留試驗(yàn)結(jié)果表明，蟲螨腈在甘藍(lán)中的降解趨勢(shì)符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程，半衰期為4.1～11.0 d。當(dāng)樣品采收間隔期為14 d 時(shí)，甘藍(lán)中蟲螨腈、蟲螨腈（膳食風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估定義）的殘留中值分別為0.05、0.55 mg·kg－1，殘留最大值分別為0.488、0.988 mg·kg－1；溴代吡咯腈的殘留量均低于定量下限（0.05 mg·kg－1）。膳食風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估結(jié)果顯示，蟲螨腈（膳食風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估定義）的國家估算每日攝入量為1.28 mg，占日允許攝入量的67.7%，表明對(duì)居民健康不會(huì)產(chǎn)生明顯影響。本文研究結(jié)果為360 g·L－1蟲螨腈懸浮劑的合理使用以及膳食風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。