“半夏?天南星”藥對治療肺癌的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

黃重銘，林秋平，彭慧婷，林曉彤，曹 洋

（1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510405；2. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬東莞中醫(yī)院，廣東東莞 523000；3. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東廣州 510405）

肺癌是我國發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤。流行病學(xué)研究顯示，2014 年我國新發(fā)肺癌病例78.1萬，同期肺癌死亡病例為62.6 萬［1］。由于肺癌癥狀缺乏特異性，57%的肺癌患者初診時已經(jīng)發(fā)生了遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，失去手術(shù)切除的機會［2］。目前，手術(shù)、放療、化療、靶向治療、免疫治療等是肺癌主要的治療方式。中醫(yī)藥是肺癌綜合治療的重要組成部分，在抑制肺癌增殖和轉(zhuǎn)移，改善放化療、靶向治療及免疫治療的毒副作用，提高患者的生存質(zhì)量，延長生存期等多方面發(fā)揮重要作用［3］。

肺癌在中醫(yī)可歸屬“息賁”、“肺壅”、“肺積”等范疇。古人對肺癌的癥狀、病因、病機已經(jīng)有了較深入的理解，清代沈金鰲的《雜病源流犀燭》提出：邪積胸中，阻塞氣道，氣不宣通，為痰為食為血，皆得與正相搏，邪既勝，正不得而制之，遂結(jié)成形而有塊?？梢姺伟┦怯捎谡龤馓澨摚岸厩址?，肺氣宣降不利，血行瘀滯，津失輸布聚而成痰，痰瘀毒結(jié)聚而成［4］。“痰”、“瘀”、“毒”、“虛”是肺癌的基本病機，肺癌與“痰”關(guān)系密切［5］。國醫(yī)大師周岱翰教授將肺癌分為肺郁痰瘀、脾虛痰濕、陰虛痰熱、氣陰兩虛等4 個證型，在治療上將化痰散結(jié)貫穿始終［6］。鄧鐵濤教授治療肺癌的經(jīng)驗方“金福安湯”，以及周岱翰教授治肺癌經(jīng)驗方“星夏滌痰湯”和“星夏健脾飲”，均以生半夏和生南星為君藥。

半夏為天南星科植物半夏的干燥塊莖，《本草經(jīng)集錄》謂其“主消心腹胸中膈痰熱滿結(jié)，咳嗽上氣，心下急痛堅痞，時氣嘔逆，消癰腫”，具有燥濕化痰、降逆止嘔、消痞散結(jié)的功效；天南星為天南星科多年生本草植物天南星的干燥塊莖，《開寶本草》謂其能“除痰，下氣，破堅結(jié)，消癰腫”，具有燥濕化痰，祛風(fēng)止痙，散結(jié)消腫的功效［7］。李芬芳等［8］通過構(gòu)建Lewis 肺癌小鼠模型，觀察生半夏、生南星對皮下腫瘤體積，瘤體質(zhì)量的影響，結(jié)果表明生半夏-生南星能抑制小鼠Lewis 肺癌的生長。然而，目前針對半夏-天南星藥對治療肺癌的相關(guān)研究較少，其作用機制尚不明確，本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，篩選半夏-天南星治療肺癌的活性成分和關(guān)鍵靶點，并對其關(guān)鍵機制進行分析和預(yù)測，為今后更深入的研究提供思路和借鑒。

1 材料與方法

1.1 “半夏-天南星”藥對活性成分的篩選

中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php）收錄了2010 版《中國藥典》所載的499 味中藥，涉及化學(xué)成分29 384種［9］。口服生物利用度（OB）和類藥性（DL）是評價藥代動力學(xué)的重要參數(shù)。檢索“半夏”、“天南星”的相關(guān)化學(xué)成分，以O(shè)B≥30%，DL≥0.18 作為潛在活性成分的篩選條件，收集符合條件的活性成分。

1.2 靶點的收集

通過TCMSP 平臺查詢活性成分的靶點信息，將靶點分別輸入Uniprot 數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/），限定物種來源為人類，查詢靶點蛋白的基因名。以“l(fā)ung cancer”為檢索詞檢索DisGeNet數(shù)據(jù)庫（https：//www.disgenet.org/），獲得肺癌相關(guān)靶點。

1.3 “藥物-活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將“藥物-活性成分”、“活性成分-靶點”相互關(guān)系整理成Excel 文件導(dǎo)入cytoscape3.7.0，構(gòu)建“藥物-活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖，分析網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，對“半夏-天南星”關(guān)鍵成分進行篩選。

1.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）的構(gòu)建與分析

使用cytoscape3.7.0 的BisoGenet 插件分別構(gòu)建“活性成分作用靶點PPI 網(wǎng)絡(luò)”和“肺癌靶點PPI 網(wǎng)絡(luò)”。通過”Mergre”功能對兩個PPI 網(wǎng)絡(luò)取交集，獲得交集網(wǎng)絡(luò)。分別使用“analyze network”功能和CytoNCA 插件對網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)進行分析，分析內(nèi)容包括自由度（degree）、介度中心性（BC）和接近中心性（CC）等。通過Degree、BC、CC 等指標(biāo)篩選關(guān)鍵靶點，并從關(guān)鍵靶點中篩選出與活性成分和肺癌直接相關(guān)的靶點作為核心靶點。

1.5 分子對接驗證

從ZINC 數(shù)據(jù)庫（http：//zinc.docking.org/）查詢“1.3”中關(guān)鍵成分的結(jié)構(gòu)，并保存為mol 格式。從PDB 數(shù)據(jù)庫（http：//www.rcsb.org/）下載核心靶點的3D 結(jié)構(gòu)，保存為PDB 格式，使用PyMol 軟件刪除蛋白結(jié)構(gòu)的水分子和小分子配體，并導(dǎo)入AutoDockTools 進行加氫等預(yù)處理。將活性成分和靶點蛋白均轉(zhuǎn)換成pdbqt 格式文件。最后運行AutoDockTools 對活性成分和靶點蛋白分別進行對接，保存最低結(jié)合能數(shù)據(jù)作為分子對接的結(jié)果。結(jié)合能＜0 提示活性成分可與靶點蛋白自發(fā)結(jié)合。結(jié)合能越低，表明活性成分與靶蛋白的結(jié)合力越強。結(jié)合相關(guān)文獻，一般認(rèn)為結(jié)合能≤-5.0 KJ/mol 的藥物分子與靶點具有較好的結(jié)合活性［10］。

1.6 GO 生物過程及KEGG 通路富集分析

DAVID 數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/）能夠?qū)o定基因或蛋白質(zhì)的生物學(xué)意義進行系統(tǒng)分析［11］。將“1.4”中篩選得到的關(guān)鍵靶點上傳至DAVID 數(shù)據(jù)庫，

GO 分析時選擇生物過程（BP）模塊，通路分析選擇KEGG 模塊。篩選FDR＜0.05 的GO 生物過程和P＜0.01 的KEGG 富集結(jié)果。通過OmicShare平臺（https：//www.omicshare.com/）對分析結(jié)果進行可視化。

2 結(jié)果

2.1 “半夏-天南星”藥對活性成分的篩選

通過檢索TCMSP 數(shù)據(jù)庫，共收集到半夏化學(xué)成分116 個，天南星化學(xué)成分122 個。設(shè)定篩選條件OB≥30%，DL≥0.18，對具有較高活性的化學(xué)成分進行篩選，共得到活性成分18 個，其中半夏活性成分13 個，天南星活性成分7 個（表1）。半夏和陳皮共有活性成分2 個，分別為β-谷甾醇和豆甾醇。

表1 “半夏?天南星”藥對活性成分Tab 1 Active components of drug pair "Pinelliae rhizoma- Arisaematis rhizoma"

2.2 靶點的收集

使用TCMSP 數(shù)據(jù)庫收集活性成分對應(yīng)的靶點。由于半夏活性成分12，13-epoxy-9-hydroxynonadeca-7、黃芩苷和天南星活性成分8，11，14-Docosatrienoic acid 無對應(yīng)靶點信息，故予剔除。15 個活性成分共收集到100 個作用靶點，通過Uniprot 數(shù)據(jù)庫標(biāo)準(zhǔn)化后共獲取92 個靶點。通過DisGeNet 數(shù)據(jù)庫檢索肺癌相關(guān)靶點，設(shè)定檢索詞為“l(fā)ung cancer”，共收集到347 個肺癌相關(guān)靶點。

2.3 “藥物-活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將“半夏”、“天南星”所對應(yīng)的15 個活性成分、92 個靶點的相互關(guān)系導(dǎo)入cytoscape3.7.0，繪制“藥物-活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)（圖1）。網(wǎng)絡(luò)圖中共包括108 個節(jié)點，182 條邊。網(wǎng)絡(luò)中黃色節(jié)點代表藥物，紅色節(jié)點代表活性成分，藍色節(jié)點代表靶點。網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治鎏崾荆害?谷甾醇（degree=36）、黃芩素（degree=34）、豆甾醇（degree=31）等3 種活性成分能與30 個以上的靶點連接，卡文定堿（degree=24）和松柏苷（degree=21）2 種活性成分能與20 個以上靶點連接，因此可認(rèn)為上述5 個活性成分是“半夏-天南星”藥對的主要活性成分。

圖1 “藥對-活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)Fig 1 "Drug pair?active components?targets" network

2.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

通過BisoGenet 插件對347 個肺癌相關(guān)靶點構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)，獲得與肺癌直接或間接相關(guān)的作用靶點8 212 個，相互關(guān)系189 594 條；對活性成分作用的92 個靶點構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)，獲得活性成分直接或間接作用靶點3 604 個，相互關(guān)系89 187 條。將2 個PPI 網(wǎng)絡(luò)取交集得到1 個由3 442 個靶點，87 520 條相互關(guān)系的網(wǎng)絡(luò)。篩選交集網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵靶點，篩選策略見圖2。在交集網(wǎng)絡(luò)中，degree 的中位數(shù)為30。篩選出degree≥60 的子網(wǎng)絡(luò)包含886 個靶點和38 481 個靶點與靶點的相互關(guān)系。由于靶點數(shù)量較多，故對子網(wǎng)絡(luò)進行二次篩選。子網(wǎng)絡(luò)的degree、BC、CC 的中位數(shù)分別為101、5.62×104、0.449，選擇degree≥202、BC≥5.62×104、CC≥0.449 的靶點作為關(guān)鍵靶點，最終得到關(guān)鍵靶點95 個，靶點間相互關(guān)系1 704 條。95 個關(guān)鍵靶點中有11 個靶點與活性成分和肺癌均直接相關(guān)，分別為：ESR1（degree=764）、CDK2（degree=689）、AR（degree=348）、AKT1（degree=340）、RELA（degree=311）、JUN（degree=283）、PRKCA（degree=275）、ADRB2（degree=260）、FOS（degree=217）。選取degree 值最高的2 個靶點作為藥對治療肺癌的核心靶點（圖3），分別為ESR1 和CDK2。

圖2 交集網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵靶點的篩選Fig 2 Screening of key targets of intersection network

圖3 PPI 網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵靶點的degree 值Fig 3 Degree value of key targets of PPI network

2.5 分子對接驗證

將“2.4”中篩選得到的核心靶點（ESR1 和CDK2）與“半夏-天南星”藥對5 個主要活性成分進行分子對接，由表2 可知，ESR1 與β-谷甾醇、豆甾醇、卡文定堿和松柏苷有較好的結(jié)合活性；CKD2 與β-谷甾醇、豆甾醇和卡文定堿有較好的結(jié)合活性。其中ESRI 與豆甾醇（圖4）、CKD2 與卡文定堿（圖5）的結(jié)合力較好，為靶蛋白與活性成分的最佳組合。分子對接結(jié)果表明，半夏-天南星藥對的活性成分可以對核心靶點發(fā)揮調(diào)控作用。

表2 分子對接結(jié)果（kJ/mol）Tab 2 Molecular docking results（kJ/mol）

圖4 ESR1 與Stigmasterol 對接Fig 4 Docking between ESR1 and stigmasterol

圖5 CDK2 與Cavidine 對接Fig 5 Docking between CDK2 and cavidine

2.6 GO 生物過程及KEGG 通路富集分析

GO 生物功能分析結(jié)果表明，關(guān)鍵靶點主要涉及基因表達與轉(zhuǎn)錄的調(diào)控、凋亡過程的調(diào)控、蛋白質(zhì)代謝、藥物反應(yīng)等多個生物過程，表明半夏-天南星藥對可通過多個生物過程發(fā)揮治療肺癌的作用。圖6 展示顯著程度前20 的GO 生物功能富集結(jié)果。KEGG 通路富集分析表明，關(guān)鍵靶點富集在63 條通路上，剔除廣泛通路后共獲得21 條信號通路（圖7）。

圖6 排名前20 的GO 生物過程Fig 6 Top 20 GO biological processes

圖7 KEGG 通路富集分析Fig 7 KEGG pathway enrichment analysis

3 討論

本研究從半夏-天南星藥對中篩選得到15 個活性成分和92 個活性成分作用靶點。通過分析“藥物-活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)，推測β-谷甾醇、黃芩素、豆甾醇、卡文定堿和松柏苷等5 個成分是“半夏-天南星”治療肺癌的主要活性成分。β-谷甾醇和豆甾醇是半夏和天南星的共有活性成分。有研究表明，β-谷甾醇可顯著抑制A549 和NCI-H460 細(xì)胞的生長，誘導(dǎo)細(xì)胞周期的停滯與調(diào)亡，但不損害正常細(xì)胞［12］。豆甾醇在體外實驗中對黑色素瘤、肝癌、膽管癌、胃癌、皮膚癌等多種腫瘤細(xì)胞具有抑制作用，其機制涉及上調(diào)調(diào)亡基因的表達，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯、破環(huán)腫瘤血管的生成等［13］，但目前尚無針對肺癌的研究報道。黃芩素、卡文定堿和松柏苷是來自半夏的活性成分。黃芩素可下調(diào)VEGF、FGFR-2和RB-1 表達以抑制腫瘤血管生成［14］；通過抑制PTEN / PI3K / Akt 途徑增加NSCLC 對順鉑的敏感性，提高順鉑的療效［15］?？ㄎ亩▔A和松柏苷的相關(guān)研究較少，但本研究發(fā)現(xiàn)卡文定堿和松柏苷能與較多靶點連接，并且與核心靶點有較好的對接活性，提示這兩個活性成分具有潛在抗癌活性，值得進一步研究。在這5 個主要活性成分中，歸屬于半夏的活性成分有5 個，歸屬于天南星的活性成分有2個，說明半夏-天南星藥對在肺癌的治療中，半夏起主要的作用，天南星與半夏配伍可以增強半夏的療效。因此，從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的角度推測半夏-天南星藥對符合“相使”的配伍特點。

PPI 網(wǎng)絡(luò)中篩選出ESR1 和CDK2 作為核心靶點。分子對接發(fā)現(xiàn)核心靶點與大部分主要活性成分有較好的對接活性，說明半夏-天南星藥對的活性成分能對核心靶點發(fā)揮調(diào)控作用。 雌激素受體（ER）主要分為兩個亞型，即雌激素受體α（ESR1）和雌激素受體β（ESR2）。 ESR1 主要存在于NSCLC 細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中［16］。雌激素與雌激素受體結(jié)合后，可以通過輔助活化因子誘導(dǎo)相關(guān)基因的表達，加速細(xì)胞增殖和遷移；或通過激活MEK/ERK通路、PI3K/AKT 通路、cAMP/PKA 通路，從而發(fā)揮抑制調(diào)亡，加速增殖及腫瘤新生血管生成的作用［17］。由于雌激素受體通路與EGFR 通路存在部分相同的下游通路，因此雌激素還可活化EGFR，促進細(xì)胞生長增殖［18-19］。CDK2 是細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDKs）的主要成員之一，其主要作用是促進細(xì)胞周期時相的轉(zhuǎn)變［20］。目前，在胃癌、腸癌、肺癌等多種腫瘤中均有CDK2 異常表達的報道，有研究發(fā)現(xiàn)，在NSCLC 中CDK2 的表達顯著提高，且CDK2 的異常表達與肺癌分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性［21］。

GO 生物功能分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，關(guān)鍵靶點主要涉及基因表達與轉(zhuǎn)錄的調(diào)控、凋亡過程的調(diào)控、蛋白質(zhì)代謝、藥物反應(yīng)等多個生物過程。對21 條KEGG信號通路進行分析，發(fā)現(xiàn)半夏-天南星治療肺癌的主要信號通路可大致分為3 類：（1）調(diào)控細(xì)胞周期：PI3K-Akt 信號通路是抑制細(xì)胞凋亡的主要通路途徑，該通路的活化可以促進Bcl-2、caspase、FOXOs磷酸化抑制肺癌細(xì)胞凋亡，激活mTOR、CDKs、核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB 發(fā)揮促進肺癌細(xì)胞增殖、阻滯細(xì)胞周期、抑制細(xì)胞凋亡的作用［22］。腫瘤耐藥與細(xì)胞凋亡的抑制有關(guān)，PI3K-Akt 信號通路抑制劑可減少化療抵抗［23］。TGF-β 信號通路與Hippo 信號通路均參與細(xì)胞周期的調(diào)控［24，25］。核心蛋白聚糖可下調(diào)EGFR 表達，活化MAPK，上調(diào)p21 表達，抑制TGF-β 的活性，進而抑制肺癌細(xì)胞增殖［26］。（2）調(diào)控血管生成：HIF-1 在細(xì)胞缺氧時可促進VEGF 的表達，誘導(dǎo)腫瘤血管生成，增加血管的通透性，與腫瘤生長、浸潤和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［27］。腫瘤壞死因子（TNF）主要以TNF-α 的形式存在，TNF-α 參與誘導(dǎo)腫瘤血管損傷、抑制血管生成，從而引起腫瘤組織出血壞死［28］。（3）調(diào)控腫瘤干細(xì)胞：腫瘤干細(xì)胞是腫瘤組織中小部分具有干細(xì)胞性質(zhì)的細(xì)胞亞群，在腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、耐藥中起著重要作用。Wnt 信號通路和Notch 信號通路與肺癌干細(xì)胞的自我更新關(guān)系密切，靶向抑制上述通路可導(dǎo)致腫瘤干細(xì)胞凋亡［29］。

本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，對半夏-天南星藥對治療肺癌的作用機制進行探究，同時采用分子對接方法對核心靶點與關(guān)鍵成分進行對接驗證，間接證實了本研究的預(yù)測的準(zhǔn)確性和可靠性。半夏-天南星藥對通過β-谷甾醇、黃芩素、豆甾醇、卡文定堿和松柏苷等活性成分，調(diào)節(jié)ESR1、CDK2 等相關(guān)靶點的表達，進而干預(yù)PI3K-Akt、MAPK、HIF-1、FoxO、TGF-β、Hippo、TNF、Notch、VEGF、cAMP等多條肺癌相關(guān)通路，從調(diào)控細(xì)胞周期、調(diào)控血管生成、調(diào)控腫瘤干細(xì)胞等多個方面發(fā)揮治療肺癌的作用。半夏-天南星藥對治療肺癌的作用機制體現(xiàn)了中藥多成分、多靶點、多通路的特點，本研究可為后續(xù)進一步研究提供思路和借鑒，也為臨床應(yīng)用提供一定的依據(jù)。