連草瀉痢膠囊對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠模型腸黏膜炎癥因子及TLR4/PI3K/Akt/mTOR 信號(hào)通路的影響

戰(zhàn)晶玉，袁星星，王炳予，劉長(zhǎng)發(fā)，張雅麗

（黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院南崗分院，黑龍江哈爾濱 150036）

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種以直結(jié)腸黏膜及黏膜下層彌漫性、連續(xù)性炎癥改變?yōu)橹饕卣鞯姆翘禺愋缘难装Y性腸?。?］。近幾十年來，隨著工業(yè)化和城市化進(jìn)程，UC 的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年增加的趨勢(shì)［2］。作為炎癥性腸病的常見類型之一，UC 好發(fā)于乙狀結(jié)腸及直腸部位，通常以腹瀉、腹痛和黏液膿血便為主要臨床表現(xiàn)，并呈現(xiàn)發(fā)作-緩解反復(fù)交替的特征［3］。不僅如此，UC 患者總體癌變率為3.7%，約占UC 死亡原因的15%，從UC-腸癌的發(fā)病呈現(xiàn)“炎癥—不典型增生—癌變”的模式［4］。因此有效抑制腸道黏膜炎癥是治療UC 和預(yù)防結(jié)直腸癌的重要途徑。

連草瀉痢膠囊是張雅麗教授治療UC 的經(jīng)驗(yàn)方，具有清熱解毒、滲濕排膿、行氣止痛的功效。前期的研究結(jié)果表明，連草瀉痢膠囊能夠顯著改善腸道黏膜屏障功能和降低炎癥因子IL-17 和TNF-α 的水平，對(duì)于大腸濕熱證UC 具有較好的臨床療效［5］。因此，本研究通過觀察連草瀉痢膠囊對(duì)UC 小鼠模型腸道黏膜炎癥因子及toll 樣受體4/磷脂酰肌醇激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素的哺乳動(dòng)物靶標(biāo)（TLR4/PI3K/Akt/mTOR）TLR4/PI3K/Akt/mTOR 信號(hào)通路的影響，以期進(jìn)一步明確其治療UC 的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)C57BL/6N 小鼠（雄性，8～10 周齡），體質(zhì)量約20～26 g，購于北京Charles River 公司（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證：SCXK（京）2016-0011）。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)條件：溫度：21～24℃，濕度：44%～55%，自由飲水及攝食，同時(shí)給予循環(huán)光照。本實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》中相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行［6］。

1.2 藥物與試劑

連草瀉痢膠囊（0.5 g/粒，黑藥制字：Z20180005）購于黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院南崗分院成藥局；美沙拉嗪腸溶片（美莎欣，800 mg/片，國(guó)藥準(zhǔn)字：H20103359）購于黑龍江天宏藥業(yè)有限公司；葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium，DSS）購于MP Biomedicals 公司；TLR4、PI3K、Akt、p-Akt（Thr308）、mTOR、p-mTOR（Ser2448）及β-actin 兔單抗購于美國(guó)Cell Signaling Technology 公司；山羊抗兔IgG 二抗購于美國(guó)Abcam 公司；Western Blot ECL 化學(xué)發(fā)光液購于美國(guó)Millipore 公司；小鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）、白介素-1β（IL-1β）、白介素-8（IL-8）、白介素-17（IL-17）和γ-干擾素（INF-γ）酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒（ELISA）購于江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司。蘇木素伊紅（HE）染色試劑盒購于北京Solarbio 公司。

1.3 方法

1.3.1 藥物制備 造模開始前取3 g DSS 溶于蒸餾水100 mL 中配置成終濃度為3%的DSS 溶液；同時(shí)分別取適量連草瀉痢膠囊和粉碎后的美沙拉嗪腸溶片溶于蒸餾水500 mL 配置成16.1 g/L 和15.6 g/L 的混懸液。

1.3.2 分組與動(dòng)物造模 小鼠按照體質(zhì)量隨機(jī)分為空白組、模型組、連草瀉痢組和美沙拉嗪組，每組10 只。適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后參照文獻(xiàn)中方法進(jìn)行造模［7］：除空白組外，余下3 組小鼠給予3%DSS 溶液自由飲用，空白組小鼠予以自由飲水，每日記錄各小鼠飲水量并補(bǔ)充新鮮DSS 溶液，連續(xù)7 d。造模期間，各組給予相應(yīng)的藥物治療（參照人和動(dòng)物藥物等效劑量進(jìn)行換算），其中連草瀉痢組給予0.77 g/kg 連草瀉痢水溶液灌胃，美沙拉嗪組給予0.68 g/kg 美沙拉嗪混懸液進(jìn)行灌胃，而空白組和模型組小鼠則給予等體積的生理鹽水進(jìn)行灌胃，每日1 次，每次1 mL，連續(xù)7 d。各組小鼠末次給藥后24 h，以1%戊巴比妥鈉40 mg/kg 腹腔注射麻醉后眼球取血，采血后以1%戊巴比妥鈉800 mg/kg 腹腔注射處死小鼠后分離結(jié)腸組織，并測(cè)定各組小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度。隨后取1 cm 中段結(jié)腸組織以磷酸鹽緩沖鹽溶液沖洗干凈后置于4%多聚甲醛中的固定，余下組織置于-80℃保存。

1.3.3 結(jié)腸組織病理學(xué)觀察 取固定于4%多聚甲醛中的結(jié)腸組織，梯度乙醇脫水后置于二甲苯中進(jìn)行透明處理，石蠟包埋后以中性樹脂進(jìn)行封片，置于切片機(jī)上進(jìn)行切片，切片厚度設(shè)定為4 μm。參照HE 染色試劑盒說明書進(jìn)行染色，光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)腸組織病理形態(tài)的改變，并參照文獻(xiàn)中評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行組織病理學(xué)評(píng)分［8］。

1.3.4 EILSA 檢測(cè) 取適量結(jié)腸組織并加入預(yù)冷的磷酸鹽緩沖鹽溶液中沖洗，玻璃勻漿器于冰浴中充分勻漿。于4 ℃環(huán)境下3 500 r/min 離心10 min，取上清。此外，取眼球血，靜置后4 ℃環(huán)境下3 500 r/min 離心10 min，取上清。參照ELISA 試劑盒說明書測(cè)定組織及血清中TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-8、IL-17、INF-γ 的含量。

1.3.5 Western blot 檢測(cè) 取適量結(jié)腸組織剪碎，加裂解液冰上裂解，離心取上清，以BCA 法測(cè)定總蛋白濃度；加入15 μL 蛋白樣品進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜至PVDF 膜，5%脫脂牛奶封閉2 h；分別加入稀釋后的TLR4、PI3K、Akt、p-Akt（Thr308） 、mTOR、p-mTOR（Ser2448）及β-actin 兔單抗（1∶1 000），4 ℃條件孵育過夜；TBST 緩沖液洗膜5 次，加入適量稀釋后的山羊抗兔后室溫下繼續(xù)孵育1 h，TBST 緩沖液洗膜5 次。滴加ECL 顯影液，凝膠成像系統(tǒng)分析，計(jì)算目的蛋白條帶的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

通過SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）的形式表示。多組間數(shù)據(jù)的比較以單因素方差（ANOVA）進(jìn)行分析，組間兩兩的比較采用LSD 檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 連草瀉痢膠囊對(duì)小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度的影響

實(shí)驗(yàn)過程中，模型組小鼠死亡2 只，連草瀉痢組和美沙拉嗪組小鼠各死亡1 只。模型組結(jié)腸長(zhǎng)度較空白組明顯縮短，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組相比，連草瀉痢膠囊和美沙拉嗪均能明顯增加UC 小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度，組間比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

2.2 連草瀉痢膠囊對(duì)小鼠結(jié)腸病理組織學(xué)的影響

空白組小鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)正常，而模型組小鼠結(jié)腸組織中可見局部潰瘍、糜爛，黏膜下層可見大量的炎性細(xì)胞存在及肉芽組織形成，其中組織病理學(xué)評(píng)分與空白組相比顯著增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。連草瀉痢膠囊及美沙拉嗪均能夠顯著改善結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)及炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)，尤其是組織水腫和黏膜潰瘍、糜爛明顯得到改善。兩組組織病理學(xué)評(píng)分與模型組比較均顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見圖1 和表1。

表1 連草瀉痢膠囊對(duì)小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度的影響（±s）Tab 1 Effect of Liancao Xieli capsule on colon length in mice（±s）

表1 連草瀉痢膠囊對(duì)小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度的影響（±s）Tab 1 Effect of Liancao Xieli capsule on colon length in mice（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組織學(xué)評(píng)分（分）0.20±0.42 3.25±0.71**1.44±0.73##1.56±0.53##38.278 0.000組別空白組模型組連草瀉痢組美沙拉嗪組n 10 899 FP結(jié)腸長(zhǎng)度（cm）9.21±1.42 6.64±1.12**8.20±1.09#8.19±1.03#7.539 0.001

圖1 各組小鼠結(jié)腸HE 染色（×400）Fig 1 HE staining of colon of mice in each group（×400）

2.3 連草瀉痢膠囊對(duì)血清及結(jié)腸組織炎癥因子的影響

ELISA 結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組血清及結(jié)腸組織中TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-8、IL-17 和INF-γ 的含量均明顯增加，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組相比，連草瀉痢組和美沙拉嗪組血清及結(jié)腸組織中炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-8、IL-17 和INF-γ 的含量均明顯減少，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表2、3。

表2 連草瀉痢膠囊對(duì)血清炎癥因子的影響（pg/mL，±s）Tab 2 Effect of Liancao Xieli capsule on serum inflammatory factors（pg/mL，±s）

表2 連草瀉痢膠囊對(duì)血清炎癥因子的影響（pg/mL，±s）Tab 2 Effect of Liancao Xieli capsule on serum inflammatory factors（pg/mL，±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別空白組模型組連草瀉痢組美沙拉嗪組INF-γ 1.20±0.05 2.57±0.30**1.66±0.14##1.68±0.16##90.012 0.000 n 10 899 FP TNF-α 0.17±0.06 0.28±0.06**0.21±0.04##0.22±0.04##7.140 0.001 IL-6 34.01±3.20 62.70±6.71**46.72±6.21##46.56±5.70##39.969 0.000 IL-1β 3.17±0.24 12.30±1.89**5.98±0.51##5.96±1.03##113.983 0.000 IL-8 10.12±2.59 32.36±3.29**16.76±2.20##17.12±2.89##100.810 0.000 IL-17 18.91±2.14 50.05±3.00**31.60±2.10##30.84±2.30##254.541 0.000

表3 連草瀉痢膠囊對(duì)結(jié)腸組織中炎癥因子的影響（pg/mg，±s）Tab 3 Effect of Liancao Xieli capsule on serum inflammatory factors（pg/mg，±s）

表3 連草瀉痢膠囊對(duì)結(jié)腸組織中炎癥因子的影響（pg/mg，±s）Tab 3 Effect of Liancao Xieli capsule on serum inflammatory factors（pg/mg，±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別空白組模型組連草瀉痢組美沙拉嗪組INF-γ 0.99±0.04 2.46±0.37**1.34±0.20##1.45±0.35##47.925 0.000 n 10 899 FP TNF-α 0.12±0.03 0.23±0.03**0.16±0.06##0.22±0.04##8.717 0.000 IL-6 21.26±2.00 63.51±3.59**35.55±4.12##37.11±1.91##295.585 0.000 IL-1β 1.22±0.14 10.63±2.01**4.37±0.63##4.45±0.58##124.447 0.000 IL-8 7.17±0.86 25.10±4.89**18.10±3.74##19.06±2.28##50.115 0.000 IL-17 13.73±2.92 44.52±12.43**29.03±4.33##30.71±5.27##29.816 0.000

2.4 連草瀉痢膠囊對(duì)TLR4/PI3K/Akt/mTOR 信號(hào)通路的影響

由圖2 可見，與空白組相比，模型組結(jié)腸組織中TLR4、PI3K、p-Akt 和p-mTOR 蛋白的表達(dá)水平顯著上調(diào)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），而Akt和mTOR 蛋白的表達(dá)水平無明顯變化，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與模型組相比，連草瀉痢組和美沙拉嗪組結(jié)腸組織中TLR4、PI3K、p-Akt 和p-mTOR 蛋白的表達(dá)顯著下調(diào)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），而連草瀉痢膠囊及美沙拉嗪對(duì)結(jié)腸組織中Akt 和mTOR 蛋白的的表達(dá)水平無明顯影響，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表4。

圖2 各組小鼠結(jié)腸組織中TLR4/PI3K/Akt/mTOR 信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)Fig 2 Expression of TLR4 /PI3K /Akt/mTOR signal pathway related proteins in colon tissues of mice in each group

表4 連草瀉痢膠囊對(duì)TLR4/PI3K/Akt/mTOR 信號(hào)通路的影響（pg/mg，±s）Tab 4 Effect of Liancao Xieli Capsule on TLR4/PI3K/Akt/mTOR signal pathway（pg/mg，±s）

表4 連草瀉痢膠囊對(duì)TLR4/PI3K/Akt/mTOR 信號(hào)通路的影響（pg/mg，±s）Tab 4 Effect of Liancao Xieli Capsule on TLR4/PI3K/Akt/mTOR signal pathway（pg/mg，±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

p-mTOR/ mTOR 0.35±0.08 0.64±0.13**0.40±0.11##0.43±0.09##13.382 0.000組別空白組模型組連草瀉痢組美沙拉嗪組n 10 899 FP TLR4/β-actin 0.22±0.03 0.74±0.12**0.41±0.18##0.42±0.18##20.448 0.000 PI3K/β-actin 0.12±0.03 0.47±0.09**0.27±0.06##0.29±0.04##56.318 0.000 p-Akt/Akt 0.35±0.17 0.68±0.19**0.42±0.17##0.48±0.15##5.973 0.002

3 結(jié)論

UC 的發(fā)病是由多種因素共同參與的結(jié)果，主要包括飲食環(huán)境因素、心理因素及遺傳易感性等。有研究顯示，蛋奶制品和高動(dòng)物脂肪飲食能夠增加UC 發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)，這可能是因?yàn)榈澳讨破泛透邉?dòng)物脂肪飲食能夠?qū)δc道菌群及腸道免疫產(chǎn)生影響，從而損傷腸道黏膜屏障［9］。此外根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，UC 的發(fā)病因地域而異，表現(xiàn)為歐美地區(qū)高，亞非地區(qū)低發(fā)病率，農(nóng)村低于城市的特點(diǎn)［10］。除此之外，UC 還具有復(fù)雜的病理機(jī)制，目前尚未完全闡明。目前的研究普遍認(rèn)為腸道黏膜屏障功能受損出現(xiàn)在UC 發(fā)病的早期，進(jìn)而導(dǎo)致腸道黏膜上皮通透性的改變誘導(dǎo)腸道神經(jīng)內(nèi)分泌功能的紊亂［11］。此外，一旦結(jié)腸黏膜的完整性和功能受到破壞，來源于腸道內(nèi)的病原菌及其代謝產(chǎn)物通過侵入結(jié)腸黏膜，加重或誘發(fā)腸道局部炎癥反應(yīng)，從而導(dǎo)致UC 的形成［12］。

炎癥反應(yīng)是UC 病理機(jī)制的核心，而細(xì)胞因子作為炎癥介質(zhì)調(diào)控腸道黏膜的病理性損傷，在UC的發(fā)病過程中發(fā)揮著重要的作用［13］。TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-8、IL-17 和INF-γ 是重要的促炎因子，介導(dǎo)UC 的發(fā)病。TNF-α 由活化的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞的增殖、分化和募集中性粒細(xì)胞，促進(jìn)腸道黏膜的局部炎癥。不僅如此，TNF-α 還可以促進(jìn)IL-1 和IL-6 的分泌，并與之協(xié)同作用，參與細(xì)胞的炎癥和凋亡［14］。IL-8 是由TNF-α 和IL-6 促進(jìn)生成的炎性細(xì)胞因子，通過對(duì)嗜堿性粒細(xì)胞及T細(xì)胞的趨化作用和促進(jìn)中性粒細(xì)胞的黏附與活化，參與腸道炎癥反應(yīng)［15］。同時(shí)，臨床研究顯示UC 患者TNF-α、IL-6、IL-1β 和IL-8 的水平增加，并且與UC 的疾病活動(dòng)指數(shù)呈明顯正相關(guān)［16］。IL-17 主要由輔助性T 細(xì)胞17 分泌，不僅可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞分析IL-6 和IL-8 等炎癥因子，還可以通過增加腸道黏膜的通透性并募集中性粒細(xì)胞，誘導(dǎo)UC 腸道黏膜的炎癥反應(yīng)，引起腹瀉和黏液膿血便的發(fā)生［17］。

TLR4 是TLRs 家族的一員，通過識(shí)別病原體表面的相關(guān)分子模式誘導(dǎo)下游信號(hào)通路的活化，從而激活炎癥因襲的表達(dá)，誘導(dǎo)腸道炎癥反應(yīng)［18］。TLR4 信號(hào)是促炎細(xì)胞因子釋放的主要通路之一，通過激活下游PI3K/Akt/mTOR 信號(hào)通路的活化，參與UC 腸道炎癥反應(yīng)和癌變過程［19-21］。PI3K 是細(xì)胞內(nèi)磷脂酰肌醇的激酶，激活后的PI3K 通過質(zhì)膜上產(chǎn)生的第二信使磷脂酰肌醇三磷酸與細(xì)胞內(nèi)含有PH 結(jié)構(gòu)域的信號(hào)蛋白Akt 結(jié)合，從Akt 轉(zhuǎn)移至細(xì)胞膜并改變其構(gòu)象。作為Akt 下游重要的效應(yīng)分子之一，Akt 的活化常伴隨著m TOR 的磷酸化，而mTOR 的活化對(duì)于細(xì)胞的增殖、凋亡和炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)方面具有重要的作用［22］。課題組前期的研究結(jié)果顯示，連草瀉痢膠囊能夠有效改善UC 腸道黏膜屏障功能。在此基礎(chǔ)上本研究結(jié)果顯示，連草瀉痢膠囊可以抑制UC 小鼠腸組織中TLR4 蛋白的表達(dá)，進(jìn)而抑制PI3K/Akt/mTOR 信號(hào)通路的活化，從而減少炎癥因子的分泌和腸道炎癥反應(yīng)。

綜上所述，連草瀉痢膠囊可以有效改善UC 腸道炎癥反應(yīng)，其作用機(jī)制主要是通過抑制TLR4/PI3K/Akt/mTOR 信號(hào)通路的活化實(shí)現(xiàn)的。

作者貢獻(xiàn)度說明：

戰(zhàn)晶玉：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，指標(biāo)檢測(cè)，撰寫論文；袁星星、王炳予：實(shí)驗(yàn)造模、藥物干預(yù)；劉長(zhǎng)發(fā)：指標(biāo)檢測(cè)；張雅麗：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)審核及統(tǒng)計(jì)分析，審閱。