抗生素聯(lián)合糞菌移植構(gòu)建人源化小鼠的可行性研究

徐美玲，張 瑜，桑 明，王普清

（1.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬襄陽(yáng)市第一人民醫(yī)院，2.湖北省帕金森病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，湖北襄陽(yáng) 441000）

人體腸道中定植了大量細(xì)菌，其基因總數(shù)約為人體基因數(shù)的150 倍，稱(chēng)為人體“第二腦”。近些年，多項(xiàng)研究顯示諸多疾病的發(fā)生可能與菌群結(jié)構(gòu)紊亂有關(guān)。因此有研究人員嘗試用糞菌移植的方法治療復(fù)發(fā)性艱難梭菌感染、肥胖、代謝綜合征和自閉癥等疾?。?-4］，且已取得一定效果。在糞菌移植研究中，小鼠是極好的模型，但因無(wú)特定病原體級(jí)（specific pathogen free，SPF）小鼠及野生型小鼠存在定植抗性，即原始的腸道菌群對(duì)外源細(xì)菌定植存在抵抗。所以無(wú)菌小鼠成為了研究者們的首要選擇。但是，無(wú)菌動(dòng)物存在價(jià)格昂貴、獲取困難、飼養(yǎng)要求高的缺點(diǎn)及限制［5］。綜上考慮，多個(gè)研究機(jī)構(gòu)選擇先用抗生素處理降低常規(guī)小鼠或SPF 小鼠的定植抗性，然后再進(jìn)行腸道菌群移植研究［6-8］。但對(duì)于抗生素的使用方法及糞菌移植的時(shí)間尚無(wú)統(tǒng)一意見(jiàn)，且構(gòu)建人源化小鼠方法的可行性，尚無(wú)系統(tǒng)報(bào)道。

因此，在既往研究基礎(chǔ)上［3，8-10］，本實(shí)驗(yàn)選擇了一種目前常用且未曾被驗(yàn)證過(guò)的方法，通過(guò)對(duì)小鼠一般情況、腸道菌群的消耗情況以及移植糞菌定植效果3 個(gè)方面研究，對(duì)該構(gòu)建人源化小鼠方法的可行性進(jìn)行新驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6 周齡SPF 級(jí)雄性野生型C57BL/6 小鼠，來(lái)自中國(guó)湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。飼養(yǎng)于湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬襄陽(yáng)市第一人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室［SYXK（鄂）2017-0093］。飼養(yǎng)期間各組小鼠可自由獲得食物和水。飼養(yǎng)環(huán)境：晝夜各半循環(huán)照明，濕度控制在40%～60%，溫度控制在（24.0±2.0）℃。本研究方案經(jīng)湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬襄陽(yáng)第一人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（2019DW0 08），并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R 原則給予人道的關(guān)懷。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 氨芐青霉素（A6265，Macklin），硫酸新霉素（N6063，Macklin），甲硝唑（M813526，Macklin），萬(wàn)古霉素（V6062，Macklin），革蘭氏染色試劑（G1060，Solarbio），QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit（51604，Qiagen），PCR MIX（D7251，Beyotime），DNA ladder（D0107，Beyotime），普通瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒（DP209，TIANGEN），GoTaq Qpcr Master Mix（A60001，Promega）

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 生物安全柜（Hfsmfe-1500LC，上海力申科學(xué)（力康），中國(guó)），電子天平（STX1202 ZH，OHAUS，中國(guó)），麻醉機(jī)（R580，瑞沃德，中國(guó)），分光光度計(jì)，Veriti?96-Well Thermal Cycler儀，電泳儀，7500 Fast Real-Time PCR System。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 為明確抗生素處理對(duì)腸道微生物的消耗情況及小鼠腸道的影響，小鼠被隨機(jī)分為2 組，抗生素組（n=10）：用氨芐青霉素1 g/L、硫酸新霉素1 g/L、甲硝唑1 g/L、萬(wàn)古霉素0.5 g/L 混入滅菌飲用水中連續(xù)3 周［6，11］。對(duì)照組（n=10）：用滅菌飲用水喂養(yǎng)小鼠3 周。在實(shí)驗(yàn)期間每3～4 d 記錄動(dòng)物體重、飲用水消耗量及飼料消耗情況。

為評(píng)價(jià)抗生素處理后對(duì)后續(xù)移植糞菌定植效果的影響，小鼠被隨機(jī)分為2 組：移植1 號(hào)人糞菌組（n=7）：給予抗生素處理后小鼠移植1 號(hào)人的糞菌1周；移植2 號(hào)人糞菌組（n=7）：給予抗生素處理后小鼠移植2 號(hào)人的糞菌1 周。

1.2.2 革蘭氏染色 收集小鼠新鮮糞便于無(wú)菌EP管中，每10 mg 糞便加入無(wú)菌生理鹽水100 μL，靜置15 min 后勻漿直至完全溶解，1 000 r/min，4 ℃下離心5 min，收集上清液，混勻后抽取10 μL，滴于載玻片上，按革蘭氏染色試劑說(shuō)明書(shū)制作糞菌涂片并染色觀察。

1.2.3 糞便細(xì)菌DNA 提取 按QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit 說(shuō)明書(shū)提取糞便細(xì)菌DNA。用分光光度計(jì)在260 nm 處測(cè)量DNA 濃度，并通過(guò)測(cè)量A260/A280 來(lái)評(píng)估純度。保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 PCR 引物特異性驗(yàn)證 本文所用引物序列由金開(kāi)瑞生物工程有限公司（武漢）商業(yè)化合成。對(duì)上述提取的糞菌DNA 行普通PCR 驗(yàn)證引物特異性。20 μL 反應(yīng)體系包括2×master mix 12.5 μL，引物（Bacteroidetes：forward primer，5'-GGARCATGTGGTTTAATTCGATGAT-3'；reverse primer，5'-AGCTGACGA-CAACCATGCAG-3'；Firmicutes：forward primer，5'GGAGYATGTGGTTTAATTCGAAGC-A-3'；reverse primer，5'-AGCTGACGACAACCATGCAC-3'）［12，13］（10 μmol/L）各1 μL，DNA 模板5 μL，無(wú)核酶水5.5 μL。采用Veriti?96-Well Thermal Cycler 儀進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃變性5 min 后，95 ℃30 s，60 ℃30 s，72 ℃45 s 共35 個(gè)循環(huán)，最后以72 ℃10 min 延伸后結(jié)束。用2%的瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作及RT-PCR 條件 對(duì)上述電泳后凝膠，按照普通瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒說(shuō)明書(shū)，進(jìn)行切膠，純化回收DNA 處理。隨后使用分光光度計(jì)測(cè)濃度及純度后，保存在-20 ℃。并按公式計(jì)算細(xì)菌拷貝數(shù)：拷貝數(shù)=［6.02×1023×濃度（ng/μL）×10-9］/（DNA 長(zhǎng)度×660）計(jì)算出每毫升PCR 所含的拷貝數(shù)，然后做10 倍系列稀釋?zhuān)蛊湫纬?05～1010拷貝/mL，進(jìn)行熒光定量PCR。PCR條件為：20 μL 反應(yīng)體系包括2×master mix 10 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.4 μL，DNA 模板25 ng，用無(wú)核酶水補(bǔ)足至20 μL。擴(kuò)增程序?yàn)?0 ℃循環(huán)1 次，持續(xù)2 min；95 ℃循環(huán)1 次，持續(xù)10 min；95 ℃15 s，60 ℃30 s，72 ℃30 s，循環(huán)40 次。以模板的不同l g（拷貝數(shù)）為縱坐標(biāo)，以PCR 反應(yīng)過(guò)程中出現(xiàn)熒光信號(hào)的初始循環(huán)數(shù)（CT）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。后續(xù)RT-PCR 均按上述條件執(zhí)行。

1.2.6 糞菌制備及移植 移植糞菌的制備：收集新鮮糞便于無(wú)菌離心管中，用無(wú)菌PBS（5 mL/g）浸泡，4 ℃下放置約15 min 或渦旋直至混勻，以1 000 r/m 離心，4 ℃離心5 min。留取上清液。上清液與等體積的50%無(wú)菌甘油的混合至終濃度25% ，然后儲(chǔ)存在-80 ℃直到移植。糞菌移植：每只小鼠每天灌胃200 μL 糞菌懸液，共持續(xù)7 d。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)結(jié)果用均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差（Mean ±SEM）表示。所有數(shù)據(jù)用GraphPad Prism 8.0 軟件處理，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 抗生素混合處理對(duì)小鼠一般情況的影響

根據(jù)既往研究文獻(xiàn)［14］，在小鼠飲用水中添加氨芐青霉素、萬(wàn)古霉素、新霉素和甲硝唑4 種抗生素來(lái)消耗其原本的腸道微生物群。然后對(duì)抗生素處理期間小鼠體重變化及食水的消耗量進(jìn)行記錄并分析。結(jié)果顯示：相比于正常對(duì)照組，抗生素處理組小鼠飲用水消耗明顯減少（P=0.000 3，t=4.232，F(xiàn)=1.940，圖1A）；飼料消耗也減少（P=0.001 2，t=3.716，F(xiàn)=1.759，圖1B）。體重變化方面，正常飲用水組與抗生素處理組小鼠體重在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.217 8，t=1.277，F(xiàn)=3.019，圖1C），而在給予小鼠廣譜抗生素處理第1 周，小鼠體重下降明顯，尤其是前3 天（P＜0.000 1，t=5.869，F(xiàn)=6.943，圖1E），隨后兩組小鼠體重均呈增加趨勢(shì)，最后在抗生素處理3 周結(jié)束時(shí)，兩組小鼠體重差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.747 6，t=0.326 8，F(xiàn)=7.959，圖1D）。對(duì)于小鼠糞便性質(zhì)觀察，在整個(gè)抗生素處理過(guò)程中，部分小鼠體重出現(xiàn)稀便、大便不成型癥狀，但期間無(wú)便血，未予以處理，觀察1 d 后可自行緩解。且整個(gè)抗生素處理階段，兩組小鼠均無(wú)死亡現(xiàn)象。

圖1 抗生素組與對(duì)照組飲水量消耗（A）、飼料消耗（B）及體重變化情況（C-E）Fig 1 Water intake，food intake and weight changes of the mice in the antibiotic and control groups

2.2 抗生素處理消耗原有腸道微生物，降低定植抗性

在抗生素處理3 周后分別對(duì)兩組小鼠的新鮮糞便行糞便涂片及革蘭氏染色。結(jié)果顯示，抗生素處理后小鼠糞便微生物數(shù)量明顯下降，但抗生素處理不能完全清除腸道微生物（圖2A、2B）?？股靥幚斫Y(jié)束后，解剖小鼠發(fā)現(xiàn)小鼠腸道存在盲腸擴(kuò)張（圖2C、2D），符合無(wú)菌小鼠相關(guān)表現(xiàn)［14-16］。

同時(shí)，對(duì)小鼠腸道長(zhǎng)度進(jìn)行測(cè)量分析，結(jié)果顯示抗生素處理后小鼠腸道長(zhǎng)度未有明顯異常（P=0.823 1，t=0.238 7，F(xiàn)=1.590，圖2D、2E）。

圖2 抗生素干預(yù)后小鼠糞便革蘭氏染色（A、B）、腸道外觀（C、D）及腸道長(zhǎng)度情況（D、E）Fig 2 Gram staining of mice feces、intestinal appearance and the gut length of mice after antibiotic intervention

2.3 糞菌移植后小鼠腸道菌群的定植情況

首先，普通PCR 顯示擬桿菌及厚壁菌的引物特異性良好（圖3A）。隨后標(biāo)準(zhǔn)曲線制作，得到厚壁菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖3B）為：Y=-0.292 3×X+13.05（R2=0.980 4）；擬桿菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖3C）為Y=-0.275 8×X+10.63（R2=0.999 7）。最后通過(guò)RTPCR 分別對(duì)糞菌移植的供體及受體糞便微生物進(jìn)行檢測(cè)（圖3D～F），結(jié)果顯示，1 號(hào)人糞菌比2 號(hào)人糞便中的擬桿菌高（P=0.001 0，t=5.930，F(xiàn)=13.63）、厚壁菌低（P=0.001 5，t=5.545，F(xiàn)=1.522）及厚壁菌/擬桿菌濃度低（P=0.001 2，t=5.726，F(xiàn)=1.578），比例分別為104.0%、33.7% 和32.0%。在糞菌移植后7 d，1 號(hào)小鼠比2 號(hào)小鼠擬桿菌濃度高（P=0.014 5，t=3.402，F(xiàn)=1.683），厚壁菌濃度低（P=0.000 1，t=8.809，F(xiàn)=6.992），厚壁菌/擬桿菌濃度低（P=0.000 2，t=8.031，F(xiàn)=8.430），比例分別為112.0%、15.4%和13.7%。

圖3 糞菌移植后供體人糞菌與受體小鼠糞菌比較Fig 3 Comparison of donor human feces and recipient mouse feces after transplantation

3 討論

本研究對(duì)一種比較常用的使SPF 小鼠人源化方法的可行性進(jìn)行新驗(yàn)證。其中不同于Schuijt 等［6］僅對(duì)抗生素處理后小鼠腸道進(jìn)行評(píng)價(jià)及Le Roy等［17］和Emal 等［18］僅側(cè)重于糞菌移植后糞菌的定植效果，本研究選擇通過(guò)對(duì)抗生素處理后小鼠一般情況、抗生素處理后糞便微生物消耗情況、糞菌移植的定植效果3 個(gè)方面的聯(lián)合研究驗(yàn)證。

其中，為明確多種抗生素聯(lián)合處理的安全性，首先評(píng)估了抗生素處理對(duì)小鼠一般情況的影響。發(fā)現(xiàn)抗生素處理減少小鼠飲用水消耗，結(jié)果同之前研究存在一致性［14］，考慮原因可能為飲用水含有較苦的甲硝唑所致。有部分研究為改善抗生素飲用水味道，給予飲用水中添加甜味劑［11］或葡萄糖［18］，但是本實(shí)驗(yàn)為防止以上物質(zhì)影響小鼠代謝，繼而使實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生偏差，所以未添加。而小鼠飼料消耗降低，考慮原因?yàn)閺V譜抗生素致腸道菌群消耗，從而進(jìn)一步影響消化功能及食欲。體重方面，正常組體重呈穩(wěn)步上升的趨勢(shì)，而抗生素組體重趨勢(shì)為先下降，在1 周左右達(dá)到最低，而后上升，最后與正常組持平。與Reikvam 等［14］的報(bào)道一致，在引入抗生素治療后第4～5 天，小鼠經(jīng)歷了短暫的體重減輕，但在1 周內(nèi)，接受抗生素治療的小鼠與未治療的小鼠相比恢復(fù)了體重，并且看起來(lái)很健康。其中Reikvam 等［14］認(rèn)為是氨芐青霉素的原因，而本研究經(jīng)觀察后認(rèn)為抗生素組前期體重降低原因?yàn)樾∈箫嬘盟帮暳蠑z入少所致，隨后體重增加，考慮抗生素處理后小鼠盲腸擴(kuò)張，腸內(nèi)容物多而導(dǎo)致小鼠體重增加的假象?？傮w上而言，抗生素處理期間，未出現(xiàn)死亡等嚴(yán)重不良事件，表明抗生素處理小鼠腸菌是安全可行的。

鑒于抗生素組飲用水消耗明顯減少，小鼠攝入抗生素劑量是否可以達(dá)到消耗原有腸道微生物降低定植抗性的目的，用革蘭氏染色對(duì)抗生素處理后小鼠腸道微生物做了定性檢測(cè)，提示抗生素處理后小鼠腸道微生物消耗明顯，而且盲腸擴(kuò)張情況符合無(wú)菌小鼠表現(xiàn)。本研究雖然缺少抗生素處理前后糞便微生物的絕對(duì)定量分析，但定性結(jié)果同其他既往實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致［8，9］。眾所周知，長(zhǎng)期抗生素處理可能導(dǎo)致抗生素相關(guān)性腸炎［19］，而小鼠腸炎多數(shù)表現(xiàn)為腸道長(zhǎng)度異常。本研究顯示抗生素處理后小鼠腸道長(zhǎng)度無(wú)明顯異常。提示抗生素處理可消耗腸道微生物構(gòu)建相對(duì)無(wú)菌動(dòng)物。

如前所述，糞菌移植是將供體糞便微生物移植到受體胃腸道內(nèi)，重建新的腸道菌群，實(shí)現(xiàn)腸道及腸道外疾病的治療。為了建立人源化動(dòng)物模型，且明確該方法是否使人源腸道微生物定植于小鼠腸道內(nèi)。課題組給予腸道微生物消耗小鼠連續(xù)1 周移植人冷凍糞便微生物懸液，隨后分別對(duì)糞菌移植供體及受體的糞便微生物進(jìn)行RT-PCR 定量。結(jié)果顯示，抗生素處理后再給予糞菌移植不僅可以使微生物定植于消化道，而且接受1 號(hào)人與2 號(hào)人糞菌的小鼠之間腸道菌群的差異和1 號(hào)人與2 號(hào)人原本糞便微生物的差異趨勢(shì)存在一致性。該結(jié)果同Hintze 等［8］推薦使用抗生素聯(lián)合糞菌移植處理建立人源化動(dòng)物模型存在一致性，但是二者選擇抗生素種類(lèi)不同，灌胃周期也不同。而且兩種方法均存在的弊端是不會(huì)導(dǎo)致供體糞便微生物與受體糞便微生物的完全一致性。對(duì)于本研究而言，1 號(hào)人糞菌與1 號(hào)小鼠二者厚壁菌濃度、擬桿菌濃度及厚壁菌與擬桿菌濃度比例均存在差異；2 號(hào)人糞菌與2 號(hào)小鼠在厚壁菌濃度及擬桿菌濃度存在差異，而厚壁菌與擬桿菌濃度比例沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。分析其原因可能為人與小鼠種屬及飲食結(jié)構(gòu)不同，腸道微生物存在差異性；或者是糞菌移植本身只能定植一部分的腸道微生物［3，20］。

在本研究中，課題組通過(guò)對(duì)抗生素處理后一般情況、抗生素處理后糞便微生物消耗情況、抗生素處理后糞菌移植的定植效果3 個(gè)方面的研究結(jié)果表明，通過(guò)抗生素處理及糞菌移植可以使SPF 級(jí)小鼠人源化，而且是安全可行的。但是糞菌移植仍有個(gè)體化差異存在，應(yīng)該在設(shè)計(jì)未來(lái)的糞菌移植實(shí)驗(yàn)方案時(shí)需考慮進(jìn)去。

作者貢獻(xiàn)度說(shuō)明

徐美玲：實(shí)驗(yàn)操作、數(shù)據(jù)分析、文章撰寫(xiě)。張瑜：文章修改。桑明：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)分析。王普清：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、文章修改。