“邵氏五針?lè)ā迸浜想p側(cè)“足三里”對(duì)慢性哮喘模型大鼠肺組織中SP、VIP蛋白表達(dá)影響的研究

胡曉京，邵素菊，華金雙，王培育，張君，任重，徐寧，田麗

（河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000）

支氣管哮喘是一種常見(jiàn)的慢性呼吸系統(tǒng)異質(zhì)性疾病，特征為由多種細(xì)胞及細(xì)胞組分參與的慢性炎癥，同時(shí)伴有可變的氣流受限和氣道高反應(yīng)性，隨著病程的延長(zhǎng)和病情的加重，可導(dǎo)致氣道重構(gòu)［1］。目前中國(guó)約有3 000 萬(wàn)人罹患哮喘［2］，14 歲以上的人群中哮喘患病率為1.24%，城區(qū)的總體控制率為28.5%［3］，給個(gè)人和社會(huì)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。如何防治哮喘已成為全球醫(yī)學(xué)界所面臨的重要課題［4］。針灸治療哮喘具有操作簡(jiǎn)便、療效顯著的特點(diǎn)，“邵氏五針?lè)ā笔巧劢?jīng)明教授在多年臨床實(shí)踐中不斷探索總結(jié)出的一種安全有效的哮喘防治方法［5］。本實(shí)驗(yàn)以慢性哮喘模型大鼠為對(duì)象探究哮喘的神經(jīng)源性炎癥機(jī)制，從興奮性神經(jīng)和抑制性神經(jīng)入手，通過(guò)觀察慢性哮喘模型大鼠肺組織中的非腎上腺素能非膽堿能（NANC）興奮性神經(jīng)肽P 物質(zhì)（SP）、NANC 抑制性神經(jīng)肽血管活性腸肽（VIP）蛋白的表達(dá)，探討“邵氏五針?lè)ā敝委熛淖饔脵C(jī)制，為針灸治療哮喘提供更科學(xué)的實(shí)驗(yàn)支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

健康雄性SPF 級(jí)SD 大鼠40只，體質(zhì)量180～200 g（河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK（豫）2017－0001。將大鼠置于溫濕度適宜的環(huán)境中適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d，根據(jù)計(jì)算機(jī)統(tǒng)計(jì)軟件產(chǎn)生的隨機(jī)數(shù)字表將大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、艾灸組和針刺組，每組10 只。大鼠分籠飼養(yǎng)，編號(hào)稱重。本實(shí)驗(yàn)已通過(guò)動(dòng)物倫理審查（倫理編號(hào)：DWLL201710327）。

1.2 主要試劑與儀器

卵蛋白（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：20180521）；氫氧化鋁干粉（上海麥克林生化科技有限公司，批號(hào)：20180411）；4%多聚甲醛（大連美侖生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：MA0192－Apr－14D）；SP 抗體（Bioss，批號(hào)：AG07171868）；VIP 抗體（武漢博士德生物工程有限公司，批號(hào)：ZP3878BP78）；一次性毫針（φ0.30 mm × 13 mm，北京中研太和醫(yī)療器械有限公司）；細(xì)艾條（φ0.7 cm×12 cm，臨湘市湖香艾生物科技有限責(zé)任公司）；彩色圖像分析系統(tǒng)（西安華海電子有限公司）。

1.3 模型制備

實(shí)驗(yàn)第1天和第8天時(shí)向模型組、針刺組和艾灸組大鼠腹腔內(nèi)注射10%的復(fù)合OVA抗原液1 mL致敏，空白組大鼠注射1 mL生理鹽水。實(shí)驗(yàn)第15天，將大鼠置于密閉的霧化箱內(nèi)，模型組、針刺組、艾灸組用霧化器噴入1%的卵蛋白溶液20 min激發(fā)哮喘，空白組用霧化器噴入0.9%的生理鹽水20 min激發(fā)哮喘，隔日1次，連續(xù)6 周。大鼠出現(xiàn)呼吸急促或節(jié)律不齊，抓耳撓腮，煩躁不安，輕度紫紺，甚則四肢癱軟，俯伏不動(dòng)，連續(xù)激發(fā)后大鼠毛色失去光澤，反應(yīng)遲鈍即為造模成功。

1.4 治療

針刺組：實(shí)驗(yàn)第15 天起，采用φ0.30 mm × 13 mm毫針直刺大鼠雙側(cè)“肺俞”、“大椎”、雙側(cè)“風(fēng)門”、雙側(cè)“足三里”，針刺深度分別為6、5、6、7 mm。每10 min行針1 次，采用平補(bǔ)平瀉手法，共留針20 min。起針后激發(fā)，隔日1次，連續(xù)6周。

艾灸組：實(shí)驗(yàn)第15 天起，采用細(xì)艾條在大鼠雙側(cè)“肺俞”、“大椎”、雙側(cè)“風(fēng)門”、雙側(cè)“足三里”上方2～3 cm處施灸?！胺斡帷薄按笞怠薄帮L(fēng)門”采用回旋灸，“足三里”采用溫和灸，每次施灸10 min。灸后激發(fā)，隔日1次，連續(xù)6周。

空白組、模型組每次均給相同力度抓握刺激，不做任何治療。隔日1次，連續(xù)6周。

1.5 指標(biāo)檢測(cè)

1.5.1 取材

末次治療后24 h內(nèi)，用10%水合氯醛（0.35 mL/100 g）腹腔注射麻醉大鼠，迅速消毒，打開(kāi)胸腔，充分暴露肺和心臟，取右肺中下葉（包括肺門），立即放入裝有新鮮配制的4%多聚甲醛溶液的玻璃瓶中，用濾紙與脫脂棉置于瓶口，使組織充分浸潤(rùn)于多聚甲醛中，做好標(biāo)記，固定1周，石蠟包埋。

1.5.2 HE染色

將肺組織蠟塊進(jìn)行切片、烤片，依次經(jīng)過(guò)二甲苯Ⅰ5 min→二甲苯Ⅱ5 min→二甲苯Ⅲ10 min 脫蠟；無(wú)水乙醇Ⅰ3 min→無(wú)水乙醇Ⅱ3 min→95%乙醇Ⅰ3 min→95%乙醇Ⅱ3 min→90%乙醇3 min 水化；蘇木素染色5 min→1%鹽酸乙醇（2～3 s）→流水沖凈肥皂水反藍(lán)15 min→伊紅染色8 min 進(jìn)行染色；80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇Ⅰ1 min、95%乙醇Ⅱ分別1 min→無(wú)水乙醇Ⅰ3 min→無(wú)水乙醇Ⅱ3 min 脫水；二甲苯Ⅰ2 min→二甲苯Ⅱ2 min透明，中性樹(shù)膠封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察各組肺組織情況。

1.5.3 肺組織免疫組織化學(xué)染色

將肺組織蠟塊進(jìn)行烤片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，3%H2O2氧化，抗原修復(fù)，5%BSA封閉液封閉，一抗（用PBS 按1∶200 比例稀釋的SP、VIP 抗體）孵育，二抗（生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG）孵育，SABC（親和素從鏈霉菌）孵育，DAB 顯色，蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。顯微鏡下觀察肺組織中SP、VIP 陽(yáng)性信號(hào)，隨機(jī)在每個(gè)切片中選取5 個(gè)高倍視野（× 400），測(cè)定每個(gè)視野中陽(yáng)性表達(dá)的光密度值，取其平均值，記錄數(shù)據(jù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行處理。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。首先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，若符合正態(tài)分布且方差齊，則進(jìn)行單因素方差分析。若方差不齊，采用非參數(shù)檢驗(yàn)進(jìn)行分析，以P<0.05代表差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠行為體征情況

空白組大鼠無(wú)異常表現(xiàn)，呼吸均勻，毛色光潔，反應(yīng)靈敏，飲食、二便均正常，霧化吸入0.9%生理鹽水激發(fā)后無(wú)明顯變化；模型組大鼠激發(fā)后，出現(xiàn)嗆咳、呼吸急促、抓耳撓腮、煩躁等情況，多次激發(fā)后，大鼠精神不振，反應(yīng)遲緩，呼吸喘促，皮毛蓬松無(wú)光澤，飲食量減少，糞便顆粒變小，質(zhì)地干硬；針刺組、艾灸組大鼠致敏后皆出現(xiàn)模型組相同癥狀，如呼吸急促、抓耳撓腮、煩躁不安、嗆咳等，經(jīng)過(guò)針刺或艾灸治療后，與模型組相比，大鼠呼吸較平穩(wěn)、嗆咳癥狀明顯減輕，精神尚可，活動(dòng)較靈敏，飲食、二便基本正常。

2.2 各組大鼠肺組織HE染色形態(tài)學(xué)觀察比較

空白組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整，肺泡壁清晰完整，支氣管管腔規(guī)則，平滑肌和血管壁未見(jiàn)明顯增厚，少見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡壁不完整，氣道黏膜上皮脫落，支氣管管壁增厚狹窄，腔內(nèi)見(jiàn)黏性分泌物及脫落的上皮細(xì)胞，氣管周圍及肺間質(zhì)內(nèi)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，平滑肌增厚。針刺組大鼠肺泡壁清晰，平滑肌及支氣管壁輕度增厚，腔內(nèi)極少量黏液及脫落的上皮細(xì)胞，血管及支氣管附近少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。艾灸組大鼠氣道黏膜上皮組織基本完整，平滑肌及支氣管壁增厚不明顯，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較少。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠肺組織形態(tài)學(xué)比較（HE染色，×400）

2.3 各組大鼠肺組織中SP蛋白表達(dá)情況比較

與空白組相比，模型組大鼠肺組織內(nèi)SP 蛋白陽(yáng)性表達(dá)明顯增多（P< 0.01）；與模型組相比，針刺組、艾灸組大鼠肺組織內(nèi)蛋白陽(yáng)性表達(dá)均明顯減少（P <0.01）；針刺組和艾灸組相比，SP 蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果見(jiàn)表1、圖2。

圖2 各組大鼠肺組織中SP蛋白表達(dá)比較（×400）

表1 各組大鼠肺組織中SP蛋白表達(dá)情況比較（±s）

表1 各組大鼠肺組織中SP蛋白表達(dá)情況比較（±s）

注：各組間比較，F(xiàn) = 138.442，P = 0.000 < 0.01；與空白組相比，△P<0.01；與模型組相比，▲P<0.01。

組別空白組模型組針刺組艾灸組n 10 10 10 10 SP平均光密度值0.106±0.030 0.388±0.041△0.201±0.032▲0.223±0.019▲

2.4 各組大鼠肺組織中VIP蛋白表達(dá)情況比較

與空白組相比，模型組大鼠肺組織內(nèi)VIP蛋白陽(yáng)性表達(dá)明顯減少（P<0.01）；與模型組相比，針刺組、艾灸組大鼠肺組織內(nèi)VIP 蛋白陽(yáng)性表達(dá)均明顯增多（P<0.01）；針刺組和艾灸組相比，VIP蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果見(jiàn)表2、圖3。

表2 各組大鼠肺組織中VIP蛋白表達(dá)情況比較（±s）

表2 各組大鼠肺組織中VIP蛋白表達(dá)情況比較（±s）

注：各組間比較，F(xiàn) = 85.950，P = 0.000 < 0.01；與空白組相比，△P<0.01；與模型組相比，▲P<0.01。

組別空白組模型組針刺組艾灸組n 10 10 10 10 VIP平均光密度值0.320±0.029 0.117±0.035△0.239±0.029▲0.228±0.020▲

圖3 各組大鼠肺組織中VIP蛋白表達(dá)比較（×400）

3 討論

哮喘是以發(fā)作性喉中哮鳴有聲，呼吸困難，甚則喘息不得平臥為主要表現(xiàn)的頑固發(fā)作性肺系疾病。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為哮喘的病因病機(jī)是臟腑虛弱，宿痰伏肺，復(fù)因外邪侵襲、飲食不節(jié)、情志過(guò)激等觸發(fā)，導(dǎo)致氣滯痰阻，氣道攣急，發(fā)為哮喘［6－7］。哮喘為本虛標(biāo)實(shí)之病，發(fā)作期以邪實(shí)為主，未發(fā)時(shí)以肺、脾、腎等臟腑虛弱之證候?yàn)橹?。哮喘的治療遵循“發(fā)則治標(biāo)，緩解治本，發(fā)作期與緩解期并重”的原則。本實(shí)驗(yàn)選取慢性哮喘模型大鼠，運(yùn)用邵經(jīng)明教授所創(chuàng)“邵氏五針?lè)ā?，以“肺俞”“大椎”“風(fēng)門”為主穴，同時(shí)選取“足三里”作為配穴［8－10］。肺俞屬于足太陽(yáng)膀胱經(jīng)，內(nèi)應(yīng)肺臟，是肺之精氣輸注于背部的處所，具有調(diào)理肺氣，止咳平喘，實(shí)腠固衛(wèi)之功，可統(tǒng)治呼吸系統(tǒng)內(nèi)傷外感諸疾，為治療肺病之主穴?！夺樉馁Y生經(jīng)》記載：“凡有喘與哮者，為按肺俞，無(wú)不酸痛”。大椎穴為“諸陽(yáng)之會(huì)”，是督脈與手足三陽(yáng)經(jīng)交會(huì)之處。《針灸甲乙經(jīng)》言大椎為“三陽(yáng)督脈之會(huì)”，治療哮喘可祛風(fēng)散寒、宣肺平喘、理氣降逆。風(fēng)門屬足太陽(yáng)膀胱經(jīng)穴，在肺俞上方，亦內(nèi)應(yīng)肺臟，為風(fēng)邪入侵機(jī)體之門戶，針之有疏散風(fēng)邪、調(diào)理肺氣之功［11－13］。哮喘多為慢性疾病，往往遷延難愈，患者病久體虛，配合足三里可以健脾和胃、扶正祛邪，與主穴合用，可健脾化痰、培土生金。

哮喘發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，氣道的慢性炎癥貫穿于哮喘的整個(gè)過(guò)程，其中非腎上腺素能非膽堿能（NANC）神經(jīng)介導(dǎo)的神經(jīng)源性炎癥機(jī)制受到越來(lái)越多的關(guān)注，該神經(jīng)無(wú)法被膽堿和腎上腺素拮抗劑阻斷［14］。P 物質(zhì)（SP）是NANC興奮神經(jīng)系統(tǒng)釋放的收縮支氣管平滑肌的感覺(jué)神經(jīng)肽［15］，多見(jiàn)于支氣管壁和肺泡壁，可引起支氣管平滑肌收縮、黏液分泌增多等［16］。SP 具有強(qiáng)大的致炎作用，可激活巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞，釋放IL－1、IL－6 和TNF－α 等細(xì)胞因子。血管活性腸肽（VIP）是NANC 抑制神經(jīng)系統(tǒng)釋放的舒張支氣管平滑肌的神經(jīng)介質(zhì)，含VIP 免疫反應(yīng)的神經(jīng)纖維分布于人體的氣道平滑肌、氣道上皮及黏膜下腺周圍，具有較強(qiáng)的舒張支氣管、抑制炎癥和抗損傷作用［17－18］。SZEMA 等［19］發(fā)現(xiàn)VIP 在調(diào)節(jié)氣道收縮和哮喘炎癥反應(yīng)中起著重要的生理作用，肺組織中VIP 的缺乏可導(dǎo)致哮喘的發(fā)生。

本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組大鼠肺組織中神經(jīng)肽SP表達(dá)明顯增加，VIP表達(dá)明顯減少，使氣道收縮痙攣，肺組織炎性浸潤(rùn)加重，從而發(fā)生哮喘；與模型組相比，針刺組、艾灸組肺組織中SP 表達(dá)均明顯減少，VIP 表達(dá)均明顯增加，可見(jiàn)針刺、艾灸“肺俞”“大椎”“風(fēng)門”均可下調(diào)肺組織中SP 的表達(dá)、上調(diào)VIP的表達(dá)，使支氣管舒張，緩解氣道平滑肌痙攣，改善肺組織炎癥情況，從而緩解哮喘。故調(diào)節(jié)SP、VIP的失衡可能是針灸治療哮喘的途徑之一。