基于p38 MAPK通路探討盤龍七片對膝骨關(guān)節(jié)炎模型大鼠的治療作用與可能機(jī)制

時超，譚亮*，孫春生，陳繼平，孟建國

（1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬徐州市中醫(yī)院，江蘇 徐州 221003；2. 陜西盤龍藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，陜西 西安 710025）

膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）是骨科的常見疾?。?］。KOA 發(fā)病率及致殘率正呈逐年增長趨勢，預(yù)計到2030年，歐洲及美國將有1/5 的人口罹患KOA［2］。目前研究認(rèn)為，關(guān)節(jié)軟骨異常炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致KOA 患者關(guān)節(jié)組織發(fā)生病變的重要原因之一［3］。p38 絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen activated protein kinase，p38 MAPK）信號通路可介導(dǎo)炎癥通路活化，并參與KOA的發(fā)生、發(fā)展過程［4］。

盤龍七片可活血化瘀、祛風(fēng)除濕、消腫止痛，臨床上常用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腰肌勞損、骨折及軟組織損傷等［5］。近來研究發(fā)現(xiàn)，盤龍七片可通過抑制軟骨細(xì)胞凋亡、抑制炎癥因子釋放從而治療KOA［6］，但盤龍七片抑制軟骨細(xì)胞凋亡和促炎因子釋放的具體分子生物學(xué)機(jī)制尚不明確。本研究基于p38 MAPK信號通路，探討盤龍七片對KOA模型大鼠軟骨組織病變的影響與可能的分子生物學(xué)機(jī)制，以期為臨床合理用藥提供參考。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物

清潔級SD雄性大鼠60只，體質(zhì)量200～220 g，6～7 周齡，購自于斯貝福（北京）實驗動物科技有限公司，批號：SCXK（京）2016－0002。所有大鼠于本院動物房中飼養(yǎng)，實驗動物遵循3R原則。

1.1.2 主要試劑及儀器

盤龍七片（陜西盤龍藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，批號：20190320005）；茴香霉素（上海信裕生物科技有限公司，貨號：XY－01323）；HE 染色試劑盒（上海生物公司，貨號：E677218－0200）；腫瘤壞死因子（TNF－α）及白細(xì)胞介素－1β（IL－1β）等ELISA 試劑盒（上海振譽生物科技有限公司、上海心語生物科技有限公司，貨號：EL－R0019、SY－2235）；p38 MAPK 磷酸化蛋白（pp38 MAPK）、核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF－κB）磷酸化蛋白（p－NF－κB）等兔抗大鼠免疫組化用抗體（貨號：ab4822、ab194726）、Ⅱ型膠原（COL2）（貨號：ab168356）、解聚蛋白樣金屬蛋白酶－4（ADAMTS－4，貨號：ab84792）、基質(zhì)金屬蛋白酶－13（MMP－13，貨號：ab51072）、水通道蛋白3（AQP3，貨號：ab125219）、凋亡蛋白－半胱天冬酶（Caspase－3，貨號：ab184787）抗體等（美國abcam 公司）；SMZ745光學(xué)顯微鏡（日本尼康公司）。

1.2 方法及觀察指標(biāo)

1.2.1 大鼠分組、建立KOA模型及給藥

全部60 只SD 大鼠按隨機(jī)數(shù)字表分為正常對照組、模型組、盤龍七片組、p38 MAPK 抑制劑組（SB203580 組）、p38 MAPK 激動劑組（茴香霉素組）和盤龍七片+茴香霉素組，每組各10只。除正常對照組外，對其余各組大鼠進(jìn)行造模。參照文獻(xiàn)［7］方法取大鼠，麻醉后用1 mL 注射器將50 μLⅡ型膠原酶溶液于右后側(cè)膝關(guān)節(jié)處注入關(guān)節(jié)腔內(nèi)，4 d 后重復(fù)上述操作，7 d 后觀察大鼠行為變化，若大鼠右后肢出現(xiàn)收縮、跛行等現(xiàn)象，視為造模成功。正常對照組大鼠則于關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射等體積的生理鹽水。

參照文獻(xiàn)［7］設(shè)置盤龍七片組給藥劑量為1.29 g/kg（相當(dāng)于成人等效劑量的10 倍），將盤龍七片用生理鹽水稀釋成濃度為0.129 g/mL 混懸液，按10 mL/kg 灌胃給藥；參照文獻(xiàn)［8］設(shè)置茴香霉素組及SB203580 組給藥劑量分別為5 mg/kg 和10 μL/只，茴香霉素及SB203580 均于大鼠右后肢膝關(guān)節(jié)處經(jīng)皮下注射給藥，每3日注射1 次；盤龍七片+ 茴香霉素組大鼠給予盤龍七片混懸液10 mL/kg 灌胃，同時膝關(guān)節(jié)皮下注射茴香霉素溶液10 μL/只；正常對照組與模型組大鼠灌胃等量生理鹽水，各組均連續(xù)給藥14 d。

1.2.2 大鼠一般行為觀察及LequesneMG行為學(xué)評分

末次給藥并禁食禁水12 h 后，觀察各組大鼠局部按壓疼痛反應(yīng)、步態(tài)等行為學(xué)變化，并參照文獻(xiàn)［9］進(jìn)行LequesneMG 行為學(xué)評分。評分時，由同一名不知情的非本實驗人員進(jìn)行評分并記錄總分，各組大鼠取總分平均值進(jìn)行比較。

1.2.3 大鼠膝關(guān)節(jié)腫脹程度測量及病理變化

采用電子數(shù)字顯示游標(biāo)卡尺測量大鼠膝關(guān)節(jié)直徑，評估膝關(guān)節(jié)腫脹情況。麻醉處死大鼠，解剖膝關(guān)節(jié)，肉眼觀察關(guān)節(jié)病理變化。

1.2.4 HE染色檢測軟骨組織病理變化

迅速剝離并取出大鼠右后肢整個膝關(guān)節(jié)軟骨組織，剪取部分組織置于－80 ℃冰箱中保存，剩余軟骨組織迅速置于4%中性多聚甲醛中固定24 h 后，用乙二胺四乙酸溶液脫鈣處理并制備成5 μm切片，取部分切片按HE 試劑盒說明書進(jìn)行染色，光鏡下觀察組織形態(tài)變化。參照文獻(xiàn)［10］用Mankin's評分表對組織病理損傷程度進(jìn)行評分。

1.2.5 免疫組化染色法檢測軟骨組織中p－p38 MAPK、p－NF－κB表達(dá)水平

取剩余軟骨組織石蠟切片，脫蠟及抗原修復(fù)后，加入一抗抗體（p－p38 MAPK、p－NF－κB，1∶800）4 ℃孵育過夜，后加入羊抗兔二抗（1∶1 000）室溫孵育4 h，DAB 顯色，蘇木精復(fù)染、封片后，于光鏡下觀察拍照，用Image Pro Plus 5.0圖像分析系統(tǒng)分析單位面積陽性染色區(qū)的平均光密度值。

1.2.6 ELISA 法檢測軟骨組織中炎性因子IL－1β、TNF－α水平

取“1.2.4”中保存于－80 ℃的軟骨組織，4 ℃解凍后，冰上勻漿，3 000 r/min 離心分離15 min 后，取勻漿液，按ELISA 試劑盒說明書方法檢測IL－1β、TNF－α水平。

1.2.7 Western Blot 法檢測AQP3、Caspase－3、COL2、ADAMTS－4、MMP－13和IL－1β蛋白相對表達(dá)水平

取“1.2.6”中剩余勻漿液，用蛋白提取及BCA 法提取并測蛋白總濃度后，取50 μg 蛋白上樣，進(jìn)行電泳和轉(zhuǎn)膜反應(yīng)，加入一抗抗體（AQP3、Caspase－3、COL2、ADAMTS－4、MMP－13、IL－1β、β －actin 內(nèi) 參，1∶1 000）4 ℃搖床孵育過夜，后加入HRP 羊抗兔二抗（1∶2 000），室溫孵育1 h，用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色，以化學(xué)發(fā)光儀觀察條帶并拍照，以Image－J 軟件分析測定蛋白相對表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS22.0 軟件對所得實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示計量資料，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩組間比較行SNK－q檢驗，P<0.05代表差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠行為學(xué)評分結(jié)果比較

正常對照組大鼠跑動正常，無跛行。與正常對照組相比，模型組大鼠右后肢收縮痙攣、跛行明顯，行為學(xué)評分升高（P< 0.05）。與模型組相比，盤龍七片組及SB203580 組大鼠跛行明顯改善，行為學(xué)評分降低（P<0.05）；茴香霉素組大鼠右后肢跛行嚴(yán)重，大部分不能參與行走，行為學(xué)評分升高（P<0.05）；而盤龍七片+ 茴香霉素組上述指標(biāo)變化與盤龍七片組相反（P<0.05）。見表1。

表1 各組大鼠行為學(xué)評分結(jié)果（±s，分）

表1 各組大鼠行為學(xué)評分結(jié)果（±s，分）

注：與正常組比較，*P < 0.05；與模型組比較，#P < 0.05；與盤龍七片組比較，△P<0.05。

組別正常對照組模型組盤龍七片組SB203580組茴香霉素組盤龍七片+茴香霉素組n 10 10 10 10 10 10行為學(xué)評分0.02±0.00 4.08±0.04*2.02±0.02#2.02±0.02#5.53±0.04#△4.03±0.04△

2.2 各組大鼠膝關(guān)節(jié)腫脹程度及大體觀察結(jié)果比較

正常對照組大鼠膝關(guān)節(jié)情況正常。與正常對照組相比，模型組大鼠膝關(guān)節(jié)腫脹，關(guān)節(jié)軟骨無光澤，色稍黃，關(guān)節(jié)液增多，軟骨表面裂紋、糜爛及潰瘍增多，膝關(guān)節(jié)直徑增大（P< 0.05）。與模型組相比，盤龍七片組及SB203580組大鼠右后肢膝關(guān)節(jié)軟骨表面粗糙，呈毛刺狀，部分出現(xiàn)裂紋、糜爛及潰瘍，膝關(guān)節(jié)直徑減?。≒< 0.05）；茴香霉素組大鼠右后肢膝關(guān)節(jié)軟骨表面裂紋、糜爛及潰瘍增多，且部分直達(dá)骨質(zhì)，軟骨下骨暴露較多，膝關(guān)節(jié)直徑升高（P<0.05）；盤龍七片+茴香霉素組上述指標(biāo)變化與盤龍七片組相反（P< 0.05）。見圖1、表2。

圖1 各組大鼠膝關(guān)節(jié)損傷大體觀察圖

表2 各組大鼠膝關(guān)節(jié)直徑檢測結(jié)果（±s，mm）

表2 各組大鼠膝關(guān)節(jié)直徑檢測結(jié)果（±s，mm）

注：與正常組比較，*P < 0.05；與模型組比較，#P < 0.05；與盤龍七片組比較，△P<0.05。

組別正常對照組模型組盤龍七片組SB203580組茴香霉素組盤龍七片+茴香霉素組n 10 10 10 10 10 10膝關(guān)節(jié)直徑11.02±0.15 12.98±0.16*11.03±0.13#11.12±0.14#13.53±0.16#△12.93±0.16△

2.3 各組大鼠軟骨組織HE染色結(jié)果比較

正常對照組大鼠軟骨組織無明顯病理學(xué)改變。與正常對照組相比，模型組大鼠軟骨組織壞死脫落，原有結(jié)構(gòu)及潮線破壞，壞死區(qū)殘留少量軟骨細(xì)胞，有大量纖維組織增生，Mankin's評分升高（P<0.05）。與模型組相比，盤龍七片組及SB203580組大鼠軟骨表面局部粗糙不平、潰瘍減少，移行層水腫、變形，在壞死區(qū)兩側(cè)可見軟骨基質(zhì)，染色不一，Mankin's評分降低（P<0.05）；茴香霉素組軟骨組織壞死脫落現(xiàn)象增多明顯，Mankin's評分升高（P<0.05）；盤龍七片+茴香霉素組上述指標(biāo)變化與盤龍七片組相反（P<0.05）。見表3、圖2。

圖2 各組大鼠軟骨組織HE染色結(jié)果（×200）

表3 各組大鼠病理損傷程度Mankin's評分結(jié)果（±s，分）

表3 各組大鼠病理損傷程度Mankin's評分結(jié)果（±s，分）

注：與正常組比較，*P < 0.05；與模型組比較，#P < 0.05；與盤龍七片組比較，△P<0.05。

組別正常對照組模型組盤龍七片組SB203580組茴香霉素組盤龍七片+茴香霉素組n 10 10 10 10 10 10 Mankin's評分1.02±0.19 7.68±0.26*4.93±0.23#5.02±0.24#8.53±0.25#△7.66±0.26△

2.4 各組大鼠軟骨組織IL－1β、TNF－α水平結(jié)果比較

與正常對照組相比，模型組大鼠軟骨組織IL－1β、TNF－α 水平升高（P< 0.05）。與模型組相比，盤龍七片組及SB203580 組大鼠軟骨組織IL－1β、TNFα水平降低（P<0.05）；茴香霉素組大鼠軟骨組織IL－1β、TNF－α 水平進(jìn)一步升高（P<0.05）；盤龍七片+茴香霉素組上述指標(biāo)變化與盤龍七片組相反（P<0.05）。見表4。

表4 各組大鼠軟骨組織IL－1β、TNF－α水平比較（±s，n=10）

表4 各組大鼠軟骨組織IL－1β、TNF－α水平比較（±s，n=10）

注：與正常組比較，*P < 0.05；與模型組比較，#P < 0.05；與盤龍七片組比較，△P<0.05。

組別正常對照組模型組盤龍七片組SB203580組茴香霉素組盤龍七片+茴香霉素組IL－1β（pg/g）148.32±14.98 326.58±17.95*184.86±16.52#185.62±15.04#487.63±17.25#△325.13±17.93△TNF－α（pg/g）29.46±5.91 102.08±8.03*46.07±7.21#48.96±6.04#192.99±9.33#△101.39±8.02△

2.5 各組大鼠軟骨組織p－p38 MAPK、p－NF－κB陽性表達(dá)結(jié)果比較

免疫組化染色結(jié)果顯示，正常對照組大鼠軟骨組織中p－p38 MAPK、p－NF－κB 呈弱陽性表達(dá)。與正常對照組相比，模型組大鼠軟骨組織中p－p38 MAPK、p－NF－κB 陽性表達(dá)升高（P<0.05）。與模型組相比，盤龍七片組及SB203580 組大鼠p－p38 MAPK、p－NF－κB 陽性表達(dá)降低（P< 0.05）；茴香霉素組軟骨細(xì)胞p－p38 MAPK、p－NF－κB 陽性表達(dá)進(jìn)一步升高（P<0.05）；盤龍七片+茴香霉素組上述指標(biāo)變化與盤龍七片組相反（P<0.05）。見圖3、表5。

表5 各組大鼠軟骨組織p－p38 MAPK、p－NF－κB陽性表達(dá)比較結(jié)果（±s，n=10）

表5 各組大鼠軟骨組織p－p38 MAPK、p－NF－κB陽性表達(dá)比較結(jié)果（±s，n=10）

注：與正常組比較，*P < 0.05；與模型組比較，#P < 0.05；與盤龍七片組比較，△P<0.05。

組別正常對照組模型組盤龍七片組SB203580組茴香霉素組盤龍七片+茴香霉素組p－p38 MAPK（平均光密度/mm2）0.32±0.03 2.08±0.21*1.03±0.13#1.02±0.14#2.83±0.22#△2.06±0.21△p－NF－κB（平均光密度/mm2）0.22±0.02 2.17±0.20*1.33±0.13#1.32±0.14#2.96±0.23#△2.19±0.20△

圖3 各組大鼠軟骨組織p－p38 MAPK、p－NF－κB陽性表達(dá)染色結(jié)果（×400）

2.6 各組大鼠軟骨組織COL2、ADAMTS－4、MMP－13、AQP3、Caspase－3蛋白表達(dá)結(jié)果

與正常對照組相比，模型組大鼠軟骨組織中ADAMTS－4、MMP－13、AQP3、Caspase－3 蛋白表達(dá)升高（P< 0.05），COL2 蛋白表達(dá)降低（P< 0.05）。與模型組相比，盤龍七片組及SB203580 組大鼠ADAMTS－4、MMP－13、AQP3、Caspase－3 蛋白表達(dá)均降低（P<0.05），COL2 蛋白表達(dá)升高（P<0.05）；茴香 霉 素 組 大 鼠 ADAMTS－4、MMP－13、AQP3、Caspase－3 蛋白表達(dá)升高（P< 0.05），COL2 蛋白表達(dá)降低（P< 0.05）；盤龍七片+ 茴香霉素組上述指標(biāo)變化與盤龍七片組相反（P<0.05）。見圖4、表6。

表6 各組大鼠軟骨組織ADAMTS－4、MMP－13、COL2、AQP3、Caspase－3蛋白表達(dá)比較（±s，n=10）

表6 各組大鼠軟骨組織ADAMTS－4、MMP－13、COL2、AQP3、Caspase－3蛋白表達(dá)比較（±s，n=10）

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與盤龍七片組比較，△P<0.05。

組別正常對照組模型組盤龍七片組SB203580組茴香霉素組盤龍七片+茴香霉素組ADAMTS－4/β－actin 1.02±0.11 1.86±0.18*1.47±0.12#1.48±0.13#2.09±0.19#1.87±0.18△MMP－13/β－actin 1.16±0.10 1.79±0.17*1.39±0.12#1.40±0.13#2.16±0.20#1.88±0.18△COL2/β－actin 1.11±0.09 0.45±0.05*0.71±0.07#0.79±0.07#0.16±0.01#0.41±0.04△AQP3/β－actin 1.09±0.10 1.99±0.18*1.57±0.12#1.58±0.13#2.46±0.19#1.98±0.19△Caspase－3/β－actin 1.17±0.10 1.75±0.15*1.31±0.13#1.39±0.13#2.16±0.22#1.71±0.17△

圖4 各組大鼠軟骨組織ADAMTS－4、MMP－13、COL2、AQP3、Caspase－3蛋白表達(dá)免疫印跡圖

3 討論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為滑膜、軟骨等關(guān)節(jié)組織的退變和破壞是KOA 的主要病機(jī)［11］。西醫(yī)治療KOA 費用昂貴且效果不甚明顯，尋找經(jīng)濟(jì)簡便的治愈膝骨關(guān)節(jié)炎方法尤為重要［11］。SD 大鼠膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射Ⅱ型膠原蛋白酶，可成功建立早期KOA 模型［12］。本研究成功建立SD 大鼠KOA 模型后發(fā)現(xiàn)，KOA 大鼠右后肢痙攣收縮等行為嚴(yán)重、膝關(guān)節(jié)腫脹程度增加，肉眼觀察可見關(guān)節(jié)軟骨無光澤、關(guān)節(jié)液增多，光鏡觀察可見軟骨組織壞死、纖維組織增生、炎性浸潤等病理損傷，軟骨組織IL－1β、TNF－α 等炎性因子分泌增加。中醫(yī)學(xué)將KOA 歸屬于“骨癖”“膝痹”“鶴膝風(fēng)”等范疇，并認(rèn)為KOA 病機(jī)為“虛”“邪”“瘀”所致，風(fēng)寒濕毒蓄積于骨節(jié)、四肢、髓間，是造成患者痛如虎噬的主要原因，針對KOA 的病因，宜采用活血化瘀療法改善患者疼痛癥狀［13］。盤龍七片由龍七、當(dāng)歸、壯筋丹、丹參、五加皮等29 味中草藥組成，具有活血化瘀、消腫止痛的功效，對慢性炎性疼痛類疾病有較好的治療作用［14］。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)盤龍七片治療后，大鼠右后肢痙攣收縮、行走困難等行為減少，膝關(guān)節(jié)腫脹、軟骨組織壞死、纖維組織增生、炎性浸潤等病理損傷減輕，軟骨組織中IL－1β、TNF－α 炎性因子水平降低，提示盤龍七片對KOA 的療效確切，但其具體的分子生物學(xué)機(jī)制還不甚明確。

目前研究發(fā)現(xiàn)，抑制關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)是緩解KOA 軟骨病變的主要機(jī)制。p38 MAPK 可直接或間接調(diào)控NF－κB 炎性通路活化，誘導(dǎo)TNF－α、IL－1β 等炎性細(xì)胞因子釋放，促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶如MMP－13 及ADAMTS－4 等表達(dá)，導(dǎo)致COL2 降解，引發(fā)軟骨細(xì)胞凋亡，加速KOA 進(jìn)程［15］。此外，除了介導(dǎo)炎性因子表達(dá)和促進(jìn)細(xì)胞炎性損傷，p38 MAPK 還能調(diào)控水分子跨膜轉(zhuǎn)運相關(guān)蛋白如AQP3 等蛋白表達(dá)，破壞細(xì)胞內(nèi)外滲透壓平衡，使細(xì)胞因吸水膨脹而破裂凋亡［16］。TAN 等［17］及劉欣等［18］發(fā)現(xiàn)，通過抑制炎性因子表達(dá)或阻斷p38 MAPK 激活來下調(diào)AQP3 表達(dá)，對緩解KOA 軟骨退變有重要意義。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠軟骨組織中的p－p38 MAPK 活化途徑被激活，用茴香霉素進(jìn)一步激活p－p38 MAPK 活化途徑后，p38 MAPK 介導(dǎo)的炎性反應(yīng)及凋亡途徑相關(guān)通路蛋白即p－NF－κB、ADAMTS－4、MMP－13 及Caspase－3 表達(dá)升高，COL2 蛋白表達(dá)降低，水通道調(diào)控蛋白AQP3等蛋白表達(dá)升高，大鼠關(guān)節(jié)腫脹、軟骨組織炎性壞死等KOA 癥狀進(jìn)一步加重。反之，阻斷p－p38 MAPK 介導(dǎo)的炎性反應(yīng)及AQP3表達(dá)后，大鼠KOA 癥狀明顯緩解，提示p38 MAPK 通路激活，可能是KOA 軟骨損傷加重的關(guān)鍵原因之一。盤龍七片組大鼠軟骨組織中p38 MAPK/NF－κB/AQP3 通路處于抑制狀態(tài)，而在p38 MAPK 激動劑茴香霉素的影響下，盤龍七片的上述治療作用可被逆轉(zhuǎn)。這些結(jié)果均提示，盤龍七片發(fā)揮KOA 大鼠軟骨組織炎性損傷及退變的抑制作用，可能與抑制p38 MAPK/NF－κB/AQP3通路活化有關(guān)。

綜上所述，盤龍七片可通過抑制p38 MAPK/NFκB/AQP3 通路活化來緩解KOA 大鼠軟骨組織炎性損傷癥狀，這為盤龍七片治療KOA 可能的分子生物學(xué)機(jī)制提供了一定的理論依據(jù)。但中醫(yī)藥治療疾病具有多靶點、多途徑作用，p38 MAPK 通路還可能與氧化應(yīng)激及自噬等因素有關(guān)，盤龍七片治療KOA 的其他機(jī)制，還有待后續(xù)深入研究。