基于Nrf2通路探討環(huán)黃芪醇調(diào)控H2O2致HT22細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的作用

郝任娟，陸韻薇，于顧然

（南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease，AD）作為比較常見(jiàn)的神經(jīng)退行性疾病之一，其基本病理特征主要表現(xiàn)為淀粉樣蛋白和Tau 蛋白沉積、神經(jīng)元丟失以及突觸功能障礙［1］?？寡趸到y(tǒng)的失衡，即氧化應(yīng)激作為引起AD 病理改變的基本機(jī)制之一，會(huì)導(dǎo)致AD 患者大腦中神經(jīng)毒性蛋白的積累。由于大腦中含有相對(duì)于其他器官更少的抗氧化酶，故其神經(jīng)元更易受到氧化損傷，進(jìn)而導(dǎo)致疾病的惡化［2］。研究表明，核因子E2 相關(guān)因子2（Nuclear factor E2－related factor 2，Nrf2）在調(diào)節(jié)氧化還原穩(wěn)態(tài)中起重要作用，Nrf2 信號(hào)的激活在體外和體內(nèi)對(duì)AD相關(guān)模型均有改善作用。因此，Nrf2途徑可能成為篩選和開(kāi)發(fā)對(duì)AD 具有預(yù)防或治療作用的新型抗氧化劑的潛在靶點(diǎn)［3］。

環(huán)黃芪醇（Cycloastragenol）為三萜皂苷類化合物，是黃芪甲苷在胃腸道代謝過(guò)程中水解的生物活性皂苷，而黃芪甲苷則是黃芪的活性成分［4］。研究顯示，黃芪具有抗菌、止汗、消炎、利尿和滋補(bǔ)的作用，現(xiàn)代藥理學(xué)研究則表明，黃芪對(duì)于D－gal 誘導(dǎo)的衰老小鼠模型具有顯著的抗衰老作用，黃芪處理可抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)因子MDA 的水平、增加抗氧化因子SOD 和GSH 活性［5-6］。此外，ADESSO 等［7］發(fā)現(xiàn)，黃芪可刺激H2O2誘導(dǎo)的體外腸上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激模型中Nrf2 的活化，增加Nrf2 相關(guān)保護(hù)因子HO－1 和NQO1 的表達(dá)。環(huán)黃芪醇作為黃芪活性成分的水解產(chǎn)物，現(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示，其具有抗衰老、抗炎、抗氧化、抗凋亡、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞、調(diào)節(jié)免疫等多種藥理作用［8］。體外實(shí)驗(yàn)研究表明，環(huán)黃芪醇還可以通過(guò)減弱Aβ1－42誘導(dǎo)的內(nèi)皮連接蛋白的下調(diào)，保護(hù)血腦屏障的通透性［9］。然而目前尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)環(huán)黃芪醇對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷保護(hù)作用的相關(guān)探討，基于此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)H2O2處理小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞以構(gòu)建體外氧化應(yīng)激模型，評(píng)估環(huán)黃芪醇調(diào)控氧化應(yīng)激損傷的作用。

1 材料與儀器

1.1 細(xì)胞

小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞（HT22 細(xì)胞，武漢普諾賽生命科技有限公司）。

1.2 試劑與藥品

環(huán)黃芪醇（純度>99%，成都曼斯特生物科技有限公司），配制為5 mmol/L 工作液于－20 ℃儲(chǔ)存；二甲基亞砜（DMSO）及MTT 工作液（Sigma 公司）；DCFH－DA活性氧探針（碧云天生物技術(shù)有限公司）；β－actin、Caspase－3、 Cleaved Caspase－3、 Bax、 Bcl－2、Cytochrome C、Nrf2 檢測(cè)試劑盒（Proteintech 公司）；鼠二抗、兔二抗（武漢賽維爾生物科技公司）。

1.3 儀器

CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（HERA cell 1501 型）；生物安全柜（1300A2 型）；酶標(biāo)儀（ELX－800 型）；電泳儀及轉(zhuǎn)膜儀（北京六一生物科技有限公司）；伯樂(lè)凝膠系統(tǒng)成像儀（CHEMIDO C XRS +）；離心機(jī)（Heraeus Fresco21）；正置熒光顯微鏡（DS－Qi2型）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

HT22 細(xì)胞采用添加青霉素－鏈霉素－兩性霉素B（100×）的DMEM 培養(yǎng)基（高糖，含10%胎牛血清）培養(yǎng)，所有細(xì)胞置于5%CO2，37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%密度時(shí)進(jìn)行傳代，每天更換培養(yǎng)基。

2.2 MTT 法檢測(cè)環(huán)黃芪醇對(duì)細(xì)胞活性的影響和保護(hù)作用

先通過(guò)對(duì)不同濃度環(huán)黃芪醇處理的HT22 細(xì)胞活性進(jìn)行檢測(cè)，以篩選出較為合適的濃度用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，采用環(huán)黃芪醇對(duì)HT22 細(xì)胞先進(jìn)行預(yù)保護(hù)24 h，再于每組細(xì)胞中分別添加H2O2，觀察環(huán)黃芪醇對(duì)HT22 細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用。方法：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)周期的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5 × 104/mL，均勻接種于96 孔板中，每孔100 μL，于5% CO2，37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，之后分別加入100 μL 不同濃度的環(huán)黃芪醇繼續(xù)培養(yǎng)24 h。每孔加入20 μL MTT 溶液，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，之后棄去原有培養(yǎng)基，每孔加入150 μL DMSO，充分震蕩10 min，酶標(biāo)儀490 nm 處檢測(cè)每孔的吸光度值（OD）。

細(xì)胞活性（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD 值－調(diào)零孔OD 值）/（空白組OD 值－調(diào)零孔OD 值）× 100%

2.3 DCFH－DA 活性氧熒光探針檢測(cè)ROS 水平

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為（15～25）×104/mL，均勻接種于12 孔板中，每孔1 mL，于5% CO2，37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。第2 天棄去原培養(yǎng)基，將細(xì)胞分為5 組，其中空白組和H2O2組加入不含環(huán)黃芪醇的培養(yǎng)基，其余3 組分別加入含有不同濃度環(huán)黃芪醇（50、75、100 μmol/L）的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。之后除空白組外，其余4 組均加入H2O2繼續(xù)培養(yǎng)4 h 以造成細(xì)胞急性氧化應(yīng)激。按試劑說(shuō)明書(shū)配制DCFH－DA 活性氧探針工作液，12 孔板中棄去原有培養(yǎng)基，加入工作液37 ℃避光孵育30 min，吸去工作液，用PBS 洗3 遍后，正置熒光顯微鏡下觀察ROS 的產(chǎn)生情況。

2.4 免疫熒光染色檢測(cè)細(xì)胞入核情況

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為（10～20）×104/mL，均勻接種于12 孔板中，每孔1 mL，分組及后續(xù)給藥處理操作同上。用預(yù)冷的PBS 洗3 遍，4%多聚甲醛室溫固定20 min，0.3% TritonX－100 室溫孵育20 min，免疫熒光封閉液室溫封閉60 min，與一抗（Nrf2）4 ℃共同孵育過(guò)夜。37 ℃復(fù)溫后用PBST洗3遍，與相應(yīng)種屬二抗室溫避光孵育1 h，復(fù)染DAPI 10 min，正置熒光顯微鏡下觀察Nrf2的入核情況。

2.5 蛋白免疫印跡檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)量

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為（30～40）×104/mL，均勻接種于6 孔板中，每孔2 mL，于5% CO2，37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，分組及后續(xù)給藥處理操作同上。棄去培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS 洗3 遍，之后每孔加入60 μL RIPA 裂解液（含有蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑、EDTA、PMSF）冰上裂解30 min，收集細(xì)胞超聲裂解15 s，每個(gè)樣品3次，4 ℃，12 000 rpm離心20 min，之后根據(jù)BCA 法進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定，添加5× 還原型上樣緩沖液，99 ℃煮蛋白10 min。根據(jù)蛋白濃度計(jì)算上樣量，添加蛋白樣品至10%～12%SDS－PAGE 凝膠中進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后將膠中蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，用5%的脫脂牛奶室溫封閉1 h，與特異性一抗（Caspase－3、 Cleaved Caspase－3、 Bax、 Bcl－2、

Cytochrome C、β－actin）4 ℃孵育過(guò)夜，TBST 洗3 遍，10 min，與對(duì)應(yīng)種屬二抗室溫孵育1 h，TBST 洗3 遍，10 min。ECL化學(xué)檢測(cè)法分析相應(yīng)蛋白表達(dá)量。

2.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)

采用SPSS 22.0 軟件和GraphPad 8.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和科研繪圖，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，滿足正態(tài)分布的多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，事后檢驗(yàn)方差齊性采用Turkey檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)采用Dunnetts' T3 檢驗(yàn)。以P< 0.05 代表差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 環(huán)黃芪醇對(duì)HT22細(xì)胞活性的影響和保護(hù)作用

1～100μmol/L 濃度的環(huán)黃芪醇所處理的細(xì)胞沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的毒性作用，而當(dāng)濃度繼續(xù)增加達(dá)到150 μmol/L 以上時(shí)，其活性表現(xiàn)出下降趨勢(shì)，因此選擇50、75、100 μmol/L的環(huán)黃芪醇用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見(jiàn)表1。各組細(xì)胞經(jīng)環(huán)黃芪醇和H2O2處理后，與空白組相比，H2O2組細(xì)胞存活率明顯降低（P<0.001）；而經(jīng)環(huán)黃芪醇預(yù)處理的細(xì)胞可明顯減輕H2O2造成的細(xì)胞活性的損傷，其中100 μmol/L 濃度的環(huán)黃芪醇保護(hù)作用最強(qiáng)（P<0.001），表現(xiàn)出濃度依賴性。見(jiàn)表2。

表1 不同濃度環(huán)黃芪醇處理的HT22細(xì)胞存活率（±s）

表1 不同濃度環(huán)黃芪醇處理的HT22細(xì)胞存活率（±s）

濃度（μmol/L）0 1 5 10 25 50 75 100 150 200細(xì)胞存活率（%）100 96.52±2.88 102.62±14.34 104.39±18.46 101.56±17.94 100.19±21.30 100.65±23.18 102.67±20.10 76.54±17.65 62.02±15.72

表2 不同濃度環(huán)黃芪醇對(duì)H2O2處理的HT22細(xì)胞存活率的影響（±s）

表2 不同濃度環(huán)黃芪醇對(duì)H2O2處理的HT22細(xì)胞存活率的影響（±s）

注：與空白組相比，***P < 0.001；與H2O2組相比，##P < 0.01，###P <0.001。

組別空白組H2O2組H2O2+環(huán)黃芪醇50 μmol/L組H2O2+環(huán)黃芪醇75 μmol/L組H2O2+環(huán)黃芪醇100 μmol/L組細(xì)胞存活率（%）100 42.31±1.47***47.52±1.59##48.91±1.42###50.89±1.55###

3.2 環(huán)黃芪醇對(duì)H2O2處理的HT22 細(xì)胞中ROS 水平的影響

與空白組相比，H2O2組ROS 生成明顯增多（P<0.001）。與H2O2組相比，經(jīng)不同濃度環(huán)黃芪醇預(yù)處理的HT22細(xì)胞中ROS生成均明顯減少，并呈現(xiàn)出一定的濃度依賴性（P<0.01，P<0.001，P<0.001）。見(jiàn)圖1、表3。

表3 不同濃度環(huán)黃芪醇對(duì)H2O2處理的HT22細(xì)胞活性氧產(chǎn)生情況的影響（±s）

表3 不同濃度環(huán)黃芪醇對(duì)H2O2處理的HT22細(xì)胞活性氧產(chǎn)生情況的影響（±s）

注：與空白組相比，***P < 0.001；與H2O2組相比，##P < 0.01，###P <0.001。

組別空白組H2O2組H2O2+環(huán)黃芪醇50 μmol/L組H2O2+環(huán)黃芪醇75 μmol/L組H2O2+環(huán)黃芪醇100 μmol/L組DCFH－DA活性氧平均熒光值8.31±1.53 34.96±4.51***21.56±5.59##12.57±2.11###6.65±1.23###

圖1 不同濃度環(huán)黃芪醇對(duì)H2O2處理的HT22細(xì)胞活性氧產(chǎn)生情況的影響

3.3 環(huán)黃芪醇對(duì)H2O2處理的HT22 細(xì)胞Nrf2 入核情況的影響

與空白組相比，H2O2組細(xì)胞Nrf2 入核減少（P<0.05）。與H2O2組相比，經(jīng)不同濃度環(huán)黃芪醇預(yù)處理的HT22 細(xì)胞Nrf2 的入核呈增加趨勢(shì)，且表現(xiàn)出濃度依賴性（P<0.001）。見(jiàn)表4、圖2。

圖2 不同濃度環(huán)黃芪醇對(duì)H2O2處理的HT22細(xì)胞Nrf2入核情況的影響

表4 不同濃度環(huán)黃芪醇對(duì)H2O2處理的HT22細(xì)胞Nrf2入核情況的影響（±s）

表4 不同濃度環(huán)黃芪醇對(duì)H2O2處理的HT22細(xì)胞Nrf2入核情況的影響（±s）

注：與空白組相比，*P<0.05；與H2O2組相比，###P<0.001。

組別空白組H2O2組H2O2+環(huán)黃芪醇50 μmol/L組H2O2+環(huán)黃芪醇75 μmol/L組H2O2+環(huán)黃芪醇100 μmol/L組Nrf2核漿比3.03±0.21 2.16±0.31*3.65±0.22###4.15±0.24###4.96±0.22###

3.4 不同濃度環(huán)黃芪醇對(duì)H2O2處理的HT22 細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與空白組相比，H2O2組Cleaved Caspase－3/Caspase－3、Bax/Bcl－2、Cytochrome C 的表達(dá)量均增加（P< 0.05，P< 0.01，P< 0.05）。與H2O2組相比，經(jīng)不同濃度環(huán)黃芪醇預(yù)處理的HT22 細(xì)胞中上述蛋白的表達(dá)量均有所下降。其中，H2O2+ 環(huán)黃芪醇50、75、100 μmol/L 組 中Cleaved Caspase－3/Caspase－3 的表達(dá)均明顯下降（P< 0.05，P< 0.01，P< 0.01）；H2O2+ 環(huán)黃芪醇75、100 μmol/L 組 中Bax/Bcl－2、Cytochrome C 的表達(dá)明顯下降（P< 0.01，P< 0.001）。見(jiàn)表5、圖3。

表5 不同濃度環(huán)黃芪醇對(duì)H2O2處理的HT22細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量的影響（±s）

表5 不同濃度環(huán)黃芪醇對(duì)H2O2處理的HT22細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量的影響（±s）

注：與空白組相比，*P<0.05，**P<0.01；與H2O2組相比，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001。

組別空白組H2O2組H2O2+環(huán)黃芪醇50 μmol/L組H2O2+環(huán)黃芪醇75 μmol/L組H2O2+環(huán)黃芪醇100 μmol/L組Cleaved Caspase－3/Caspase－3 1.00±0.19 1.82±0.26*0.84±0.10#0.73±0.11##0.60±0.10##Bax/Bcl－2 1.00±0.14 1.66±0.14**1.18±0.25 0.99±0.32##0.79±0.26##Cytochrome C/β－actin 1.00±0.06 1.45±0.18*1.13±0.19 0.90±0.11##0.73±0.08###

圖3 不同濃度環(huán)黃芪醇對(duì)H2O2處理的HT22細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量的影響

4 討論

氧化應(yīng)激被認(rèn)為是引起AD 的輔助因素，甚至是主要因素之一，對(duì)氧化應(yīng)激進(jìn)行干預(yù)可改善其病理結(jié)果［10］?；钚匝酰≧OS）是正常代謝的副產(chǎn)品，在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、穩(wěn)態(tài)、自噬和細(xì)胞分裂中發(fā)揮重要作用。在生理?xiàng)l件下，低水平的ROS 快速產(chǎn)生和消除，并通過(guò)氧化還原穩(wěn)態(tài)的過(guò)程嚴(yán)格調(diào)節(jié)。然而，當(dāng)存在老化、遺傳或環(huán)境因素等不利條件時(shí)，氧化還原穩(wěn)態(tài)被破壞，這將導(dǎo)致DNA 結(jié)構(gòu)受損、膜紊亂、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能改變，使細(xì)胞損傷，細(xì)胞膜通透性增加，可引發(fā)凋亡［11-12］。H2O2是ROS 的常見(jiàn)形式之一，它可以輕易地穿透細(xì)胞質(zhì)膜并影響鄰近的細(xì)胞［13］。因此，我們選擇H2O2處理小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞（HT22）以模擬體外氧化應(yīng)激微環(huán)境。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，H2O2可誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生更多的ROS 物質(zhì)，而環(huán)黃芪醇可抑制這種作用，且隨著濃度的增加，抑制作用也會(huì)增強(qiáng)。

Caspases 屬于半胱氨酸蛋白酶家族，在細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)和執(zhí)行中起著關(guān)鍵作用。Caspase－3是凋亡的主要調(diào)控因子，負(fù)責(zé)凋亡通路的最后步驟［14］。Bcl－2是一種抗凋亡蛋白，可通過(guò)阻止細(xì)胞色素C 從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。抗凋亡蛋白Bcl－2和促凋亡蛋白Bax 之間的平衡對(duì)于維持細(xì)胞正常的凋亡信號(hào)至關(guān)重要［15］。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，環(huán)黃芪醇可降 低Cleaved Caspase－3/Caspase－3、Bax/Bcl－2 水平，減少細(xì)胞色素C 的表達(dá)，表現(xiàn)出抗凋亡作用，證明了環(huán)黃芪醇對(duì)H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。

Nrf2被認(rèn)為是細(xì)胞外生物和氧化應(yīng)激反應(yīng)的主要協(xié)調(diào)者之一，可通過(guò)與抗氧化響應(yīng)元件（ARE）結(jié)合，調(diào)節(jié)抗氧化、抗炎和解毒基因，進(jìn)而調(diào)控氧化應(yīng)激反應(yīng)［16-17］。未被激活時(shí)，Nrf2在細(xì)胞質(zhì)中被Keap1隔離并靶向于蛋白酶體降解。在氧化應(yīng)激條件下，Nrf2－Keap1 相互作用以劑量依賴的方式分解，Nrf2 易位到細(xì)胞核中。此外，Nrf2 可調(diào)控氧化應(yīng)激條件下的多種ROS 解毒酶的轉(zhuǎn)錄，控制GSH 等多種抗氧化系統(tǒng)關(guān)鍵組分的表達(dá)，在維持細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用［12，18］。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，環(huán)黃芪醇可促進(jìn)Nrf2 的入核，并表現(xiàn)出一定的濃度依賴性，這表明環(huán)黃芪醇可能通過(guò)調(diào)控Nrf2的激活發(fā)揮抗氧化作用。

綜上，環(huán)黃芪醇可減少H2O2處理的HT22 細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生，并且可減少凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，表現(xiàn)出一定的抗氧化損傷作用，環(huán)黃芪醇發(fā)揮抗氧化作用可能是通過(guò)刺激Nrf2 的入核、調(diào)節(jié)Nrf2 通路的激活來(lái)實(shí)現(xiàn)的。