國產(chǎn)人工視網(wǎng)膜視覺假體植入兔眼的短期安全性和穩(wěn)定性的研究

張赟 陳亦棋 陶繼偉 佘相均 董玉桂 沈麗君

視網(wǎng)膜退行性病變是導(dǎo)致視力喪失的主要原因之一，包括年齡相關(guān)性黃斑變性和視網(wǎng)膜色素變性，均可造成外層光感受器細(xì)胞的破壞，這些損傷的細(xì)胞不能傳遞信號至內(nèi)層視網(wǎng)膜，導(dǎo)致視功能下降，甚至失明[1-2]。目前尚無有效的方法挽救損傷的視細(xì)胞，基因治療也僅用于RPE65突變的患者[3]，干細(xì)胞治療遇到的成瘤性還有待解決[4]。視覺假體的發(fā)展可以避開損傷的光感受器細(xì)胞，直接刺激內(nèi)層視網(wǎng)膜，將視覺信息轉(zhuǎn)化為電信號，產(chǎn)生人工視覺，經(jīng)過前期的臨床實(shí)驗(yàn)證實(shí)，其具有一定的安全性，并能有效提高患者的視功能[5-6]。

人工視網(wǎng)膜視覺假體主要包括視網(wǎng)膜前假體、視網(wǎng)膜下及脈絡(luò)膜上腔假體，其中視網(wǎng)膜前假體因具有手術(shù)操作空間大、容易散熱的優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用[7]。通過長期的臨床觀察，商用的ArgusⅡ視覺假體能有效改善患者的生活視覺質(zhì)量，具有廣泛的臨床應(yīng)用前景[8]。目前，國外已上市的產(chǎn)品價(jià)格昂貴，且無法運(yùn)用于我國患者，而國內(nèi)尚無上市的人工視網(wǎng)膜視覺假體產(chǎn)品。本研究擬評估國產(chǎn)人工視網(wǎng)膜視覺假體在兔眼植入后的短期安全性和穩(wěn)定性，并為其設(shè)計(jì)、技術(shù)改良及臨床實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料 人工視網(wǎng)膜視覺假體試驗(yàn)樣品，型號規(guī)格：VS-10A；人工視網(wǎng)膜視覺信號處理器，型號規(guī)格：NVP-60A，由浙江諾爾康神經(jīng)電子科技股份有限公司提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年健康白毛黑眼兔10只，雌雄兼用（雌性未產(chǎn)并無孕），右眼為實(shí)驗(yàn)眼，購自新昌縣大市聚鎮(zhèn)欣健兔場，生產(chǎn)許可證：SCXK（浙）2015-0004。飼養(yǎng)于浙江省醫(yī)療器械檢驗(yàn)院動(dòng)物中心，普通環(huán)境，使用許可證號：SYXK（浙）2014-0016。適應(yīng)環(huán)境時(shí)間為5 d。符合GB/T 16886.2《醫(yī)療器械生物學(xué)評價(jià) 第2部分動(dòng)物福利要求》的規(guī)定及其他實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利的相關(guān)要求，操作均嚴(yán)格遵守《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》的相關(guān)規(guī)定。排除標(biāo)準(zhǔn)：排除有眼球發(fā)育異常、視網(wǎng)膜脫離、白內(nèi)障、視神經(jīng)發(fā)育不良等眼部疾病的兔子。

1.3 手術(shù)器械 所有手術(shù)均在浙江省醫(yī)療器械檢驗(yàn)院動(dòng)物中心完成，手術(shù)機(jī)器為玻璃體切除及超聲乳化吸除一體機(jī)（型號：Constellation，美國愛爾康公司）。

1.4 手術(shù)植入步驟

1.4.1 術(shù)前準(zhǔn)備 當(dāng)日頻點(diǎn)氧氟沙星眼藥水（日本參天制藥株式會社能登工廠，規(guī)格：5 ml∶24.4 mg，國藥準(zhǔn)字：J20100046）于術(shù)眼。術(shù)前復(fù)方托比卡胺滴眼液[參天制藥（中國）有限公司，規(guī)格：5 ml∶托吡卡胺25 mg，鹽酸去氧腎上腺素25 mg，國藥準(zhǔn)字：H20063360]散瞳、麻醉，全身麻醉后側(cè)臥位放置于手術(shù)臺上，手術(shù)眼與手術(shù)臺呈水平狀。準(zhǔn)備人工視網(wǎng)膜生物阻抗監(jiān)測儀（浙江諾爾康神經(jīng)電子科技股份有限公司），準(zhǔn)備手術(shù)。

1.4.2 手術(shù)過程

1.4.2.1 背部接收器植入 沿背部正中切開皮膚，鈍性分離兩側(cè)皮膚及皮下組織，接收器植入皮下。背部接收器植入示意見圖1。

圖1 背部接收器植入示意圖（a：沿背部皮膚正中切開皮膚；b：接收器；c：將接收器植入皮下）

1.4.2.2 導(dǎo)線準(zhǔn)備 術(shù)眼沿角膜緣360°打開球結(jié)膜及筋膜，往上穹窿方向分離眶皮膚，至眉弓，過耳前與背部皮下隧道相連。將背部皮下的接收器導(dǎo)線及電極芯片用保護(hù)鉗夾取，從隧道內(nèi)引入眶內(nèi)結(jié)膜下，導(dǎo)線從直肌下環(huán)繞眼球至電極芯片擬植入切口部位；10-0縫線固定導(dǎo)線于眼球壁，縫合背部皮膚。導(dǎo)線準(zhǔn)備步驟見圖2。

圖2 導(dǎo)線準(zhǔn)備步驟示意圖（a：沿角膜緣360°打開球結(jié)膜及筋膜；b：背部皮下的接收器導(dǎo)線及電極芯片用保護(hù)鉗夾取，從隧道內(nèi)引入眶內(nèi)結(jié)膜下，導(dǎo)線從直肌下環(huán)繞眼球至電極芯片擬植入切口部位；c：10-0縫線固定導(dǎo)線于眼球壁，縫合背部皮膚）

1.4.2.3 人工視網(wǎng)膜視覺假體芯片植入 切除術(shù)眼晶狀體及玻璃體；于植入部位角膜緣后1.5 mm處行鞏膜切口，電極植入鑷將電極芯片送入玻璃體腔內(nèi)至后極部，視網(wǎng)膜釘將電極芯片固定；切口縫合并用異體兔鞏膜補(bǔ)片覆蓋，密閉縫合；縫合手術(shù)切口，縫合結(jié)膜組織。將人工視網(wǎng)膜視覺假體體外機(jī)與植入體連接，測量植入體電極阻抗和通斷情況，人工視網(wǎng)膜視覺假體芯片植入步驟見圖3。

圖3 人工視網(wǎng)膜視覺假體芯片植入步驟示意圖（a：植入背部接收器；b：玻璃體切除；c：晶狀體切除；d：人工視網(wǎng)膜視覺假體芯片植入；e：異體兔鞏膜補(bǔ)片）

1.4.3 術(shù)后護(hù)理 碘伏消毒皮膚切口1周；40萬U青霉素肌肉注射預(yù)防術(shù)后感染；左氧氟沙星眼藥水（可樂必妥）4次/d，滴眼1個(gè)月；妥布霉素地塞米松滴眼液4次/d，滴眼1個(gè)月；妥布霉素地塞米松眼膏每晚1次，涂眼1個(gè)月。傷口愈合后每天將體外機(jī)與植入體連接，并開機(jī)刺激2 h，連續(xù)刺激2個(gè)月。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 術(shù)中觀察指標(biāo) 包括角膜是否透明、視網(wǎng)膜脫離、前房出血、眼內(nèi)出血、人工視網(wǎng)膜視覺假體電極芯片的位置。

1.5.2 術(shù)后觀察指標(biāo) 分別于術(shù)后 1、7 d，1、3、6個(gè)月觀察角膜是否透明、前房出血與術(shù)后并發(fā)癥發(fā)生情況（如眼內(nèi)出血、視網(wǎng)膜脫離、眼內(nèi)炎癥情況）。若眼屈光介質(zhì)清晰則利用光學(xué)相干斷層成像術(shù)（optical coherence tomography,OCT）（科林儀器股份有限公司），眼底照相（OPTOMED SMARTSCOPE VET2）及B超（法國光太AVISO眼科AB超）檢查評估人工視網(wǎng)膜視覺假體電極芯片與視網(wǎng)膜的位置。

1.5.3 病理學(xué)觀察 采用HE染色。植入術(shù)后6個(gè)月時(shí)，空氣栓塞處死動(dòng)物，摘取眼球后置于新鮮配制的10%甲醛固定2 d，將眼球從正中剪成兩半，去除晶狀體和玻璃體，小心取出視網(wǎng)膜釘，放入塑料包埋盒里，制作成石蠟塊并在視網(wǎng)膜釘處進(jìn)行切片，厚度為5 μm，將玻片放入烘箱（設(shè)為70℃）烤2 h，分別置于二甲苯Ⅰ、Ⅱ液體各10 min，并用無水乙醇洗去二甲苯，洗去后將樣本玻片依次浸入100%、95%、70%、30%乙醇各2 min，然后置于溫水鍋（37～38℃）煮2 min進(jìn)行脫蠟。將玻片用蒸餾水潤濕1 min，濾紙吸干水分，使用蘇木素染色1～5 min，并用PBS沖洗，再使用1%鹽酸乙醇和1%稀氨水返藍(lán)后沖洗，并使用伊紅復(fù)染，分別用95%乙醇、無水乙醇、二甲苯各處理2 min，吸取中性樹膠液滴在組織上封片，在顯微鏡下觀察視網(wǎng)膜形態(tài)學(xué)改變。

2 結(jié)果

2.1 人工視網(wǎng)膜視覺假體植入術(shù)中及術(shù)后情況 10只兔均完成人工視網(wǎng)膜視覺假體植入術(shù)。術(shù)中觀察角膜透明。1只兔眼術(shù)中植入電極芯片時(shí)出現(xiàn)視網(wǎng)膜裂孔及視網(wǎng)膜出血，玻璃體積血較為明顯；余9只兔眼無明顯出血，人工視網(wǎng)膜固定于視網(wǎng)膜表面。人工視網(wǎng)膜視覺假體植入術(shù)中、植入術(shù)后1 d及1個(gè)月情況見圖 4（插頁）。

圖4 人工視網(wǎng)膜視覺假體植入術(shù)中及術(shù)后情況（a：術(shù)中觀察角膜透明，箭頭示電極芯片；b：視覺假體植入術(shù)后1 d，角膜透明，前房氣泡，少許出血；c：植入術(shù)后1個(gè)月時(shí)眼前節(jié)照相，箭頭示人工視網(wǎng)膜視覺假體導(dǎo)線位于球結(jié)膜下）

2.2 人工視網(wǎng)膜視覺假體植入后安全性評估 10只兔進(jìn)行植入手術(shù)后均完成了6個(gè)月的觀察，無死亡情況。1只兔眼術(shù)中出現(xiàn)眼內(nèi)出血，術(shù)后1個(gè)月時(shí)出血吸收，可見人工視網(wǎng)膜視假體芯片位正，芯片附近出現(xiàn)視網(wǎng)膜脫離；余9例兔眼術(shù)后無眼內(nèi)出血，人工視網(wǎng)膜視覺假體位于視網(wǎng)膜表面，無視網(wǎng)膜脫離，見表1。

表1 人工視網(wǎng)膜視覺假體植入術(shù)后安全性評估[只（%）]

2.3 人工視網(wǎng)膜視覺假體貼附效果 因視網(wǎng)膜假體接收器位于兔背部，導(dǎo)線經(jīng)皮下穿行，繞過頸部，因此術(shù)后兔頭部活動(dòng)度差，配合拍眼底照難度較大。眼底彩照顯示視網(wǎng)膜表面人工視網(wǎng)膜視覺假體貼附，可見視網(wǎng)膜釘，見圖5（插頁）。B超檢查顯示視網(wǎng)膜表面扁平樣物貼附，一端見高回聲影突向玻璃體腔（符合視網(wǎng)膜釘聲影），見圖6。由于兔眼配合度差OCT掃描欠清，隱約可見視網(wǎng)膜表面有扁平物貼附，見圖7（插頁）。

圖5 人工視網(wǎng)膜視覺假體植入術(shù)后眼底照相示意圖（a：眼底照相拍攝兔眼的示意圖；b：眼底照相中拍攝的人工視網(wǎng)膜視覺假體芯片，箭頭所指為芯片位置；c：箭頭所指為人工視網(wǎng)膜視覺假體的電極芯片；d：眼底彩照，箭頭所指為視網(wǎng)膜釘所在位置）

圖6 人工視網(wǎng)膜視覺假體植入術(shù)后B超檢查示意圖（a：B超檢查示意圖；b：后極部見高回聲突起，箭頭所示為人工視網(wǎng)膜視覺假體視網(wǎng)膜釘所在位置；c：人工視網(wǎng)膜視覺假體芯片所在位置）

圖7 人工視網(wǎng)膜視覺假體植入光學(xué)相干斷層成像術(shù)（OCT）檢查示意圖（a：術(shù)中OCT檢查示意圖；b：正常兔眼的視網(wǎng)膜OCT掃描結(jié)構(gòu)，視網(wǎng)膜平復(fù)；c：視網(wǎng)膜表面見粗糙不均勻信號，為視覺假體芯片所在位置，未見視網(wǎng)膜脫離）

2.4 人工視網(wǎng)膜視覺假體植入眼內(nèi)位置及病理切片評估 植入術(shù)后6個(gè)月時(shí)，摘除眼球，觀察人工視網(wǎng)膜視覺假體芯片所在視網(wǎng)膜的位置，并進(jìn)行病理切片檢查，HE染色可見芯片植入附近視網(wǎng)膜外核層變薄，視網(wǎng)膜單核細(xì)胞浸潤，見圖8（插頁）。

圖8 人工視網(wǎng)膜視覺假體植入6個(gè)月時(shí)芯片位置及視網(wǎng)膜病理切片圖[a：眼球摘除去除角膜后觀察到眼底情況，箭頭所指為視覺假體位置；b：切塊眼球的縱向示意圖，箭頭所指為視網(wǎng)膜釘；c：病理切片示意圖，可見外核層（ONL）和內(nèi)核層（LNL）細(xì)胞排列紊亂，呈空泡樣改變；RPE為視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞；HE染色，×100]

3 討論

國產(chǎn)人工視網(wǎng)膜視覺假體放置于視網(wǎng)膜表面，手術(shù)中操作空間大，術(shù)后6個(gè)月的觀察結(jié)果顯示，具有良好的視網(wǎng)膜貼附性，對視網(wǎng)膜損傷小，穩(wěn)定性和安全性均較好，但是依然存在術(shù)中出血，形成視網(wǎng)膜裂孔的風(fēng)險(xiǎn)。

視網(wǎng)膜前視覺假體通過直接刺激神經(jīng)節(jié)細(xì)胞產(chǎn)生信號，而在植入過程中常常通過釘子將電極固定于視網(wǎng)膜上，會損傷視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，同時(shí)植入視網(wǎng)膜釘時(shí)需要用力尋找突破感，力的大小難以把握，容易造成視網(wǎng)膜出血和視網(wǎng)膜脫離；因此通過視網(wǎng)膜釘把芯片成功植入視網(wǎng)膜上并減少損傷和并發(fā)癥是該類技術(shù)的難點(diǎn)[9-11]。ArgusⅡ也是視網(wǎng)膜前的視覺假體，在2013年時(shí)獲得FDA的批準(zhǔn)用于臨床實(shí)驗(yàn)。最新的一項(xiàng)57例在視網(wǎng)膜色素變性患者中使用人工視網(wǎng)膜視覺假體的臨床研究表明，經(jīng)過1年的觀察，49%患者發(fā)生了不良事件，26%患者發(fā)生了嚴(yán)重不良事件，其中9例與產(chǎn)品有關(guān)，4例與手術(shù)操作有關(guān)，絕大多數(shù)不良事件均能解決，在該研究中也發(fā)現(xiàn)2例患者發(fā)生了視網(wǎng)膜脫離和玻璃體出血[12]。視網(wǎng)膜脫離及出血是常見的并發(fā)癥，這一結(jié)論在5年的長期觀察中也被證實(shí)，但概率僅為3.3%左右[13-14]。本研究也發(fā)現(xiàn)了1眼視網(wǎng)膜脫離，并有眼內(nèi)出血，這可能與手術(shù)經(jīng)驗(yàn)和釘子的材料有關(guān)。術(shù)中盡量控制眼壓，是減少視網(wǎng)膜損傷的關(guān)鍵[12]。視覺假體植入前后需要密切關(guān)注并發(fā)癥，并及時(shí)處理。

視網(wǎng)膜假體在體內(nèi)的安全性和穩(wěn)定性極為重要，本研究顯示，國產(chǎn)人工視網(wǎng)膜視覺假體植入6個(gè)月時(shí)，視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)發(fā)生了紊亂，主要表現(xiàn)為整個(gè)視網(wǎng)膜的萎縮，外核層的破壞和單核細(xì)胞浸潤，提示植入體存在引起視網(wǎng)膜損傷的風(fēng)險(xiǎn)，然而神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的完整性是視覺假體發(fā)生功能的基礎(chǔ)，因此未來的研究中應(yīng)該更多關(guān)注如何減少植入體對視網(wǎng)膜的損傷[15-16]。視覺假體植入后可能發(fā)生炎癥，在之前的臨床研究中看到，絕大多數(shù)炎癥發(fā)生在眼表，少有眼內(nèi)炎的報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，植入體下方可以見到炎癥細(xì)胞浸潤的情況，玻璃體腔未見眼內(nèi)炎，炎癥也主要表現(xiàn)在前節(jié)[17-18]。表明該類型的人工視網(wǎng)膜視覺假體短期的觀察安全性尚可，但仍需要延長時(shí)間觀察視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)的損傷恢復(fù)情況，力求通過設(shè)計(jì)優(yōu)化，材質(zhì)改進(jìn)減少對視網(wǎng)膜的損傷。本實(shí)驗(yàn)為人工視網(wǎng)膜動(dòng)物眼的初步安全性探索，同時(shí)在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了有效性的初步檢測，將體外發(fā)射線圈與皮下植入線圈耦合，發(fā)送電刺激檢測電阻抗，顯示植入體與體位設(shè)備連接正常，提示可正常工作。在此基礎(chǔ)上，將在以后實(shí)驗(yàn)中結(jié)合視覺電生理誘發(fā)電信號分析其有效性。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)表明國產(chǎn)人工視網(wǎng)膜視覺假體具有貼合性良好、損傷小、產(chǎn)品穩(wěn)定等特點(diǎn)，具有廣泛的應(yīng)用前景。但植入中造成的視網(wǎng)膜損傷也是亟待解決的關(guān)鍵問題，需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本和延長觀察事件，證實(shí)其安全性。本研究為國產(chǎn)人工視網(wǎng)膜視覺假體的動(dòng)物眼植入實(shí)驗(yàn)早期探索，存在不足之處，因術(shù)后檢查設(shè)備及術(shù)后兔頸部皮下導(dǎo)線的影響，對術(shù)后觀察還不夠詳盡。之后將進(jìn)行小型豬的國產(chǎn)人工視網(wǎng)膜視覺假體實(shí)驗(yàn)，希望之后的實(shí)驗(yàn)可以帶來更多的成果，從而為其設(shè)計(jì)、技術(shù)改良及臨床實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)。