新建體外受精實(shí)驗(yàn)室的鼠胚實(shí)驗(yàn)質(zhì)控和氧氣濃度對(duì)胚胎體外發(fā)育的影響

余柯達(dá) 毛佳婷 柴娟 包云 高輝 師帥

不孕不育癥已成為一種常見疾病，在我國(guó)已婚夫婦中的比列約為10%，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)[1]。輔助生殖技術(shù)是治療不育不孕癥主要的技術(shù)手段，體外受精（in vitro fertilization,IVF）實(shí)驗(yàn)室是輔助生殖技術(shù)中最重要的組成部分，是人類配子和胚胎體外培養(yǎng)的場(chǎng)所。人類配子和胚胎在體外對(duì)環(huán)境非常敏感，因此對(duì)新建IVF實(shí)驗(yàn)室整個(gè)培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行質(zhì)控評(píng)估，是進(jìn)行輔助生殖技術(shù)治療前的必要程序[2]。目前鼠胚實(shí)驗(yàn)（mouse embryo assay，MEA）已應(yīng)用于 IVF領(lǐng)域的試劑、耗材和儀器設(shè)備的質(zhì)量控制，以及新建或新啟動(dòng)IVF實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量控制[3]。金華市人民醫(yī)院IVF實(shí)驗(yàn)室于2020年初建成，經(jīng)過前期潔凈消毒和“熱處理”[4]后，自2021年4至5月采用MEA檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的培養(yǎng)環(huán)境和培養(yǎng)體系是否符合輔助生殖技術(shù)人類胚胎體外培養(yǎng)的要求，并探討不同培養(yǎng)環(huán)境（O2濃度）對(duì)小鼠早期胚胎體外發(fā)育的影響，為開展人類胚胎體外培養(yǎng)提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)及質(zhì)量保障，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 無特定病原體級(jí)4～8周齡雌性ICR小鼠100只、8周齡以上雄性ICR小鼠20只，均購自金華市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，在恒溫（25℃）環(huán)境下飼養(yǎng)，12 h光照12 h黑暗環(huán)境，正常晝夜節(jié)律自由飲食，喂養(yǎng)1周后用于實(shí)驗(yàn)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及操作均獲金華市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)編號(hào)：AL-JSYJ202199）。

1.2 試劑與設(shè)備 孕馬血清促性腺激素（pregnant mare serum gonadotropin,PMSG）和人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin,hCG）均購自寧波第二激素廠；取卵-胚胎處理液G-MOPS PLUS、洗精受精液G-IVF PLUS、卵裂胚培養(yǎng)液G-1 PLUS、囊胚培養(yǎng)液G-2 PLUS、石蠟油均購自瑞典Vitrolife公司；二氧化碳培養(yǎng)箱（二氣，日本SANYO公司）；二氧化碳培養(yǎng)箱（三氣，日本 ASTEC公司）；解剖顯微鏡（日本NIKON公司）；倒置顯微鏡（日本 OLYMPUS公司）；HARIOMED IVF工作站（中國(guó)華粵行儀器有限公司）等。

1.3 小鼠超排卵 用0.9%氯化鈉溶液將PMSG和hCG分別配制成100 U/ml的溶液，分裝保存于-80℃。于17∶00雌鼠腹腔內(nèi)注射PMSG 10 U/只，48 h后再腹腔內(nèi)注射hCG 10 U/只。根據(jù)受精方式將雌鼠分為體內(nèi)受精組和IVF組。

1.4 體內(nèi)受精組 注射hCG后將50只雌鼠和雄鼠按1∶1合籠，次日8∶00觀察雌鼠陰道栓形成情況，分3批進(jìn)行。將形成陰道栓的雌鼠頸椎脫臼處死，無菌條件下取出卵巢和輸卵管，在G-MOPS PLUS中洗滌3遍，在解剖顯微鏡下用1 ml注射器刺破輸卵管膨大部位使合子團(tuán)（顆粒細(xì)胞包裹的原核胚）自動(dòng)溢出，吸取合子團(tuán)置于透明質(zhì)酸酶中去除顆粒細(xì)胞，觀察原核胚的形成情況后進(jìn)行微滴培養(yǎng)。

1.5 IVF組

1.5.1 卵母細(xì)胞的采集 注射hCG后次日8∶00頸椎脫臼處死50只未合籠的雌鼠，無菌條件下取出卵巢和輸卵管，在G-MOPS PLUS中洗滌3遍，在解剖顯微鏡下用1 ml注射器刺破輸卵管膨大部位使卵子團(tuán)（顆粒細(xì)胞包裹的卵子）自動(dòng)溢出，吸取卵子團(tuán)置于G-IVF PLUS中。

1.5.2 精子的采集與處理 將上述20只雄鼠頸椎脫臼處死，無菌條件下取出附睪及部分輸精管在GMOPS PLUS中洗滌3遍，放入G-IVF PLUS液滴中，在解剖顯微鏡下用1 ml注射器刺破附睪，使精子游出，將含有精子的G-IVF PLUS液滴加入裝有G-IVF PLUS的試管底部，上游法處理30～60 min，活動(dòng)力好的精子均游到G-IVF PLUS的上層液體中。

1.5.3 IVF與培養(yǎng) 收集獲能后G-IVF PLUS上層液體中的精子，觀察其活力，并用精子計(jì)數(shù)板計(jì)算濃度，取適量含精子的G-IVF PLUS加入含有卵子團(tuán)的GIVF PLUS中，使精子終濃度約為1×106/ml，受精4～6 h后觀察原核。

1.6 不同O2濃度下培養(yǎng) 將體內(nèi)受精組所獲得的原核胚分別放入二氣（37℃，6% CO2，大氣O2濃度）和三氣（37 ℃，6% CO2，5% O2）CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。IVF組則是將加入精子懸液后的卵子團(tuán)分別放入二氣和三氣CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，觀察原核后將原核胚再次放回對(duì)應(yīng)CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.7 原核及早期胚胎的觀察與培養(yǎng) 倒置顯微鏡下觀察原核及早期胚胎培養(yǎng)情況。當(dāng)天（D0）：原核觀察，轉(zhuǎn)移至G-1 PLUS微滴中培養(yǎng)；D1：2細(xì)胞期胚胎觀察；D2：4細(xì)胞期胚胎觀察；D3：8細(xì)胞期或桑椹期胚胎觀察，并轉(zhuǎn)移至G-2 PLUS微滴中培養(yǎng)；D4：囊胚觀察；D5：孵化期囊胚觀察。

1.8 受精率、卵裂率和囊胚形成率計(jì)算 受精率=受精卵數(shù)/獲卵數(shù)×100%，卵裂率=2細(xì)胞胚胎數(shù)/受精卵數(shù)×100%，囊胚形成率=囊胚數(shù)/2細(xì)胞胚胎數(shù)×100%。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠胚胎的體外培養(yǎng)觀察情況 卵子團(tuán)為顆粒細(xì)胞包裹的卵子（圖1a，見插頁）；D0可見受精卵內(nèi)雙原核及雙極體（圖1b，見插頁）；D1可見受精卵分裂為2個(gè)大小均勻的卵裂球，為2細(xì)胞期胚胎（圖1c，見插頁）；D2可見4個(gè)大小均勻的卵裂球，為4細(xì)胞期胚胎（圖1d，見插頁）；D3可見8個(gè)大小均勻的卵裂球，為8細(xì)胞期胚胎（圖1e，見插頁），或?yàn)槁蚜亚蚧ハ嗳诤系纳ｉ┢谂咛ィ▓D1f，見插頁）；D4可見胚胎進(jìn)入早期囊胚或擴(kuò)張期囊胚階段（圖1g，見插頁）；D5可見囊胚的一部分或全部從透明帶中逸出，為孵化期囊胚（圖1h，見插頁）。

圖1 小鼠的卵子團(tuán)和胚胎發(fā)育情況（a：卵子團(tuán)；b：受精卵；c：2細(xì)胞期胚胎；d：4細(xì)胞期胚胎；e：8細(xì)胞期胚胎；f：桑椹期胚胎；g：早期囊胚及擴(kuò)張期囊胚；h：孵化期囊胚；×200）

2.2 體內(nèi)受精組和IVF組胚胎發(fā)育情況比較 體內(nèi)受精組和IVF組各處理了50只雌鼠。體內(nèi)受精組共獲卵1 387個(gè)，受精率、卵裂率和囊胚形成率分別為86.37%、94.74%和91.72%；IVF組共獲卵1 345個(gè)，受精率、卵裂率和囊胚形成率分別為80.67%、94.75%和91.05%。體內(nèi)受精組的受精率明顯高于IVF組（P＜0.05），但兩組卵裂率和囊胚形成率比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見表 1。

表1 小鼠體內(nèi)受精組和IVF組胚胎發(fā)育情況比較

2.3 不同O2濃度對(duì)小鼠胚胎發(fā)育的影響 體內(nèi)受精組中，二氣培養(yǎng)環(huán)境下，受精率、卵裂率和囊胚形成率分別為87.04%、93.09%和88.19%；三氣培養(yǎng)環(huán)境下，受精率、卵裂率和囊胚形成率分別為85.79%、96.21%和94.75%。二氣培養(yǎng)與三氣培養(yǎng)受精率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但二氣培養(yǎng)卵裂率和囊胚形成率均低于三氣培養(yǎng)（均P＜0.05）。IVF組中，二氣和三氣培養(yǎng)環(huán)境下的鼠胚發(fā)育情況與體內(nèi)受精組類似，二氣培養(yǎng)與三氣培養(yǎng)受精率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但二氣培養(yǎng)卵裂率和囊胚形成率均低于三氣培養(yǎng)（均 P＜0.01），見表 2。

表2 不同O2濃度對(duì)小鼠胚胎發(fā)育的影響

3 討論

健康的單胎活產(chǎn)是IVF的目標(biāo)，這一目標(biāo)的實(shí)現(xiàn)在一定程度上取決于良好的培養(yǎng)環(huán)境，即IVF實(shí)驗(yàn)室，其能夠支持實(shí)現(xiàn)具有植入潛能的健康胚胎的發(fā)育[5]。良好的IVF實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)環(huán)境評(píng)估需要進(jìn)行質(zhì)量控制，MEA是新建或新啟動(dòng)IVF實(shí)驗(yàn)室最廣泛應(yīng)用的質(zhì)量控制方法[2，6-8]，其可以有效檢測(cè)空氣質(zhì)量、溫濕度、耗材、培養(yǎng)試劑、培養(yǎng)箱和實(shí)驗(yàn)人員的技術(shù)水平等[9]。

本研究利用ICR小鼠進(jìn)行體內(nèi)受精和IVF實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明體內(nèi)受精組的受精率為86.37%，高于IVF組的80.67%，原因可能是體內(nèi)受精的受精過程是在無光、恒溫、恒濕、低氧的小鼠輸卵管內(nèi)進(jìn)行的，而IVF則受到體外環(huán)境（溫濕度、滲透壓、pH等）的影響[10]；體內(nèi)受精組和IVF組的囊胚形成率達(dá)91.72%和91.05%，均大于輔助生殖技術(shù)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的80%，且超過近幾年國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道的囊胚形成率[2，6-7]。表明本院生殖醫(yī)學(xué)中心新建的IVF實(shí)驗(yàn)室的培養(yǎng)環(huán)境、培養(yǎng)體系和實(shí)驗(yàn)室人員的技術(shù)水平已達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)，能夠開展人類輔助生殖技術(shù)。

早期胚胎在體外培養(yǎng)過程中，O2濃度會(huì)影響其發(fā)育的速度和質(zhì)量，其是調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育的重要生理因素。目前國(guó)內(nèi)外IVF實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行早期胚胎體外培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)箱中的O2濃度5%和20%均存在[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠的體內(nèi)受精組和IVF組中，二氣培養(yǎng)（大氣O2濃度，約20%）和三氣培養(yǎng)（5% O2）的受精率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但二氣培養(yǎng)的卵裂率和囊胚形成率均低于三氣培養(yǎng)，表明三氣培養(yǎng)更有利于小鼠早期胚胎的發(fā)育。這一結(jié)果與高亞可等[12]和Ciray等[13]的研究結(jié)果一致。

最早進(jìn)行IVF治療時(shí)，早期胚胎體外培養(yǎng)是在大氣O2濃度（約20%）下進(jìn)行的，數(shù)百萬健康嬰兒的出生證明了這種方法的有效性[14]。然而，目前許多研究表明在大氣O2濃度下，胚胎在體外培養(yǎng)過程中活性氧（reactive oxygen species,ROS）的增加會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激，會(huì)使哺乳動(dòng)物的胚胎在體外培養(yǎng)過程中發(fā)育受損[15-17]。在胚胎發(fā)育早期階段DNA復(fù)制活躍，ROS會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞中DNA斷裂及不可逆的雙鏈斷裂，從而導(dǎo)致胚胎不均勻分裂、延遲分裂和發(fā)育停滯等情況發(fā)生[18]。哺乳動(dòng)物母體輸卵管環(huán)境中生理O2濃度約為5%，大部分研究表明低氧環(huán)境可有效促進(jìn)哺乳動(dòng)物胚胎的發(fā)育和提高囊胚的質(zhì)量[12，19]。而本研究中O2濃度對(duì)受精率無影響的可能原因是受精過程中大氣O2濃度下并未產(chǎn)生過量的ROS，或者是配子與胚胎的自我修復(fù)機(jī)制抵消了這部分影響[20]。

綜上所述，MEA的體內(nèi)受精和IVF均可有效評(píng)估新建或新啟動(dòng)IVF實(shí)驗(yàn)室的培養(yǎng)環(huán)境和培養(yǎng)體系的可靠性，本研究MEA的囊胚形成率達(dá)到了IVF實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。目前輔助生殖技術(shù)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計(jì)的是體內(nèi)受精的1細(xì)胞期或2細(xì)胞期胚胎形成囊胚的比例，但其無法評(píng)價(jià)配子和受精卵對(duì)培養(yǎng)環(huán)境和培養(yǎng)體系的敏感性，且不能對(duì)實(shí)驗(yàn)室人員的IVF技術(shù)水平進(jìn)行全面評(píng)價(jià)，因此本研究建議進(jìn)行培養(yǎng)環(huán)境和培養(yǎng)體系質(zhì)控時(shí)，除了關(guān)注囊胚形成率，還應(yīng)結(jié)合IVF的受精情況。目前新建實(shí)驗(yàn)室IVF的受精率均在80%以上[2，6-7，12]，因此建議 MEA IVF 的受精率應(yīng)達(dá) 80%。對(duì)于IVF實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行早期胚胎體外培養(yǎng)的氣體環(huán)境的選擇，本研究建議選用三氣培養(yǎng)（5% O2），其可有效減少ROS對(duì)早期胚胎的氧化應(yīng)激作用，并可提高其發(fā)育潛能。