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    微柱凝膠法檢測(cè)頭孢唑啉鈉和頭孢西丁鈉誘導(dǎo)形成藥物性抗體的可行性研究

    2022-01-06 04:06:56王波楊訊韓海心辛葉楊旭
    關(guān)鍵詞:頭孢西丁微柱包被

    王波,楊訊,韓海心,辛葉,楊旭

    (南陽(yáng)市中心醫(yī)院輸血科,河南 南陽(yáng) 473000)

    藥物誘導(dǎo)免疫性溶血性貧血(drug-induced immune hemolytic anemia,DIHA) 是一種免疫球蛋白G (immunoglobulin G,IgG) 或免疫球蛋白M(immunoglobulin M,IgM) 介導(dǎo)細(xì)胞毒性抗體的II型變態(tài)反應(yīng),因在臨床較為少見,故容易被忽視[1,2]。DIHA 發(fā)病機(jī)制是機(jī)體中產(chǎn)生某種藥物的抗藥物抗體,如藥物再次使用將導(dǎo)致溶血,多見于患者使用抗菌藥物后[3,4]。目前臨床鮮有關(guān)于藥物性抗體及其檢測(cè)方式的相關(guān)報(bào)道,患者發(fā)生溶血后分析其發(fā)生原因面臨著一定的困難。 微柱凝膠法是一種通過觀察凝膠柱介質(zhì)中紅細(xì)胞抗原和相應(yīng)抗體的凝集反應(yīng)判斷是否有抗體生成的新型免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù),相較于以往的試管法抗人球蛋白實(shí)驗(yàn)、菠蘿酶法具有操作簡(jiǎn)便、耗時(shí)短等優(yōu)勢(shì),但關(guān)于其應(yīng)用于抗菌素藥物性抗體生成情況的檢測(cè)中的研究尚少[5,6]。 頭孢菌素類藥物在臨床有著廣泛的應(yīng)用范圍,其中80%左右可誘發(fā)DIHA,同時(shí)相關(guān)報(bào)道也所有增加[7-10]。 頭孢唑啉鈉和頭孢西丁鈉分別屬于第一代、第二代頭孢菌素,抗菌譜廣,殺菌力強(qiáng),通常用于敏感性菌株感染性疾病的治療。 本研究選取使用頭孢唑啉鈉和頭孢西丁鈉的168 例患者為研究對(duì)象,分析微柱凝膠法檢測(cè)兩種藥物誘導(dǎo)形成藥物性抗體的可行性。

    1 資料與方法

    1.1 一般資料 選取2018年10月-2020年2月本院采用頭孢唑啉鈉和頭孢西丁鈉治療的患者168例,男91 例,女77 例;年齡19~78歲,平均(47.16±5.39)歲;頭孢唑啉鈉治療98 例,頭孢西丁鈉治療70 例。 納入標(biāo)準(zhǔn): 入院前7 d 未使用抗菌藥物治療; 入院后采用頭孢唑啉鈉和頭孢西丁鈉治療>3 d; 采用藥物治療后血液標(biāo)本中血紅蛋白水平<用藥之前。 本研究經(jīng)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過,所有受試者簽署知情同意書。

    1.2 藥物、試劑與儀器 頭孢唑啉鈉(1.0 g;深圳立健藥業(yè)有限公司;國(guó)藥準(zhǔn)字H20143067);頭孢西丁鈉(1.0 g; 揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司; 國(guó)藥準(zhǔn)字H20057973);LISS/Coombs/IgG +C3d 微柱凝膠卡(管中為中性凝膠,并含抗人球蛋白血清、低離子介質(zhì),中山市生科試劑儀器有限公司);O 型血健康受試者新鮮血液(采集自健康獻(xiàn)血者,EDTA 抗凝后冷藏);待檢血液(采集自頭孢唑啉鈉和頭孢西丁鈉治療的患者,EDTA 抗凝后冷藏)。

    醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)多功能離心機(jī)TD2Y(中山市生科試劑儀器有限公司);F37-12X2 37℃恒溫孵育器(上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司)。

    1.3 方法

    1.3.1 間接抗人球蛋白試驗(yàn)(Indirect Antiglobulin Test,IAT) 篩查不規(guī)則抗體 清晨采集患者空腹?fàn)顟B(tài)下5ml 左右靜脈血,加入EDTA 抗凝。 血漿標(biāo)本與不規(guī)則抗體篩查細(xì)胞各50μl,加入微柱凝膠試驗(yàn)卡(含抗球蛋白試劑),37℃下孵育20min,1000 r/min 離心半徑12cm 離心3min,2000r/min 離心半徑10cm 離心2min,判定結(jié)果。

    1.3.2 直接抗人球蛋白試驗(yàn) (direct antiglobulin test,DAT) 用0.9%的氯化鈉溶液經(jīng)濃縮紅細(xì)胞稀釋為0.8%紅細(xì)胞懸液,取50μl 加入微柱凝膠試驗(yàn)卡(含抗球蛋白試劑),1000r/min 離心半徑12cm離心3min,2000r/min 離心半徑10cm 離心2min,判定結(jié)果。如標(biāo)本DAT 結(jié)果為陽(yáng)性,繼續(xù)檢測(cè)其血漿及放散液中藥物性抗體; 如標(biāo)本DAT 結(jié)果為陰性,繼續(xù)檢測(cè)其血漿中藥物性抗體。

    1.3.3 放散實(shí)驗(yàn) 從DAT 結(jié)果陽(yáng)性標(biāo)本中采集濃縮紅細(xì)胞1ml,經(jīng)生理鹽水洗滌3 次,嚴(yán)格按照《輸血技術(shù)操作規(guī)程》進(jìn)行酸放散試驗(yàn),并快速離心、分離放散液。

    1.3.4 制備空白O 型人紅細(xì)胞 采集20 例O 型血健康受試者新鮮血液,混合均勻后取壓積紅細(xì)胞10ml 于試管中,再混合生理鹽水90ml,2500r/min離心半徑10cm 離心3min,棄上清,采用生理鹽水將紅細(xì)胞洗滌3 次,制備為不含有藥物的空白紅細(xì)胞待用。

    1.3.5 制備頭孢唑啉鈉、 頭孢西丁鈉包被紅細(xì)胞藥物0.1 g 溶于巴比妥緩沖液(pH 為9.6~9.8)0.25 ml 中,并與洗滌后O 型紅細(xì)胞170μl 混合均勻;另取一試管,加入等量巴比妥緩沖液與O 型紅細(xì)胞。兩試管均于室溫下孵育2h,每10min 輕搖勻1 次,之后生理鹽水洗滌3 次紅細(xì)胞,前者即為頭孢唑啉鈉、頭孢西丁鈉包被紅細(xì)胞,后者即為無藥物包被紅細(xì)胞。 使用前采用生理鹽水配置為2%紅細(xì)胞懸液。

    1.3.6 鑒定藥物包被紅細(xì)胞 抗體檢測(cè)試劑盒陽(yáng)性與陰性對(duì)照試劑(50μl)和2%紅細(xì)胞(藥物包被、無藥物包被各25μl)混合,加入微柱凝膠卡,37℃孵育1h,1000r/min 離心半徑12cm 離心3min,2000r/min 離心半徑10cm 離心2min。 采用兩種頭孢抗菌素抗體陰性與陽(yáng)性對(duì)照檢測(cè)試劑檢測(cè)藥物包被紅細(xì)胞,判定是否包被成功。

    1.3.7 微柱凝膠柱凝集試驗(yàn)檢測(cè)藥物性抗體 取20μl 2%頭孢唑啉鈉和頭孢西丁鈉紅細(xì)胞懸液,置于微柱凝膠柱上,同時(shí)再加100μl 待測(cè)血清,放置于恒溫孵育器中孵育20min,然后經(jīng)卡式定速離心機(jī)離心(1030r/min 離心15min)。 微柱凝膠抗人球蛋白卡自左向右標(biāo)記4 個(gè)孔,第1 個(gè)孔加入患者血漿/放散液50μl,藥物包被O 型紅細(xì)胞25μl;第2 個(gè)孔加入患者血漿/放散液50μl,無藥物包被O型紅細(xì)胞25μl; 第3 個(gè)孔加入混合的0 型紅細(xì)胞對(duì)應(yīng)血漿50μl,藥物包被O 型紅細(xì)胞25μl; 第4個(gè)孔加入混合的0 型紅細(xì)胞對(duì)應(yīng)血漿50μl,無藥物包被O 型紅細(xì)胞25μl。觀察微柱凝膠離心結(jié)果,陰性:紅細(xì)胞懸液沉積至微柱凝膠底部;陽(yáng)性:紅細(xì)胞懸液滯留于微柱凝膠上;弱陽(yáng)性:紅細(xì)胞群滯留于凝膠柱中間。 記錄凝集結(jié)果,如僅有第1 個(gè)孔中發(fā)生凝集,則為藥物性抗體陽(yáng)性。

    1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方式 采用SPSS 19.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理與分析,以[n(%)]表示計(jì)數(shù)資料,理論頻數(shù)為1~5時(shí)行校正χ2檢驗(yàn),>5 時(shí)行χ2檢驗(yàn)。 P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 IAT 檢測(cè)結(jié)果 168 例血漿標(biāo)本中不規(guī)則抗體篩查結(jié)果均未出現(xiàn)陽(yáng)性。

    2.2 DAT 檢測(cè)結(jié)果 168 例血漿標(biāo)本中DAT 結(jié)果陽(yáng)性32 例(19.05%),其中采用頭孢唑啉鈉治療的患者陽(yáng)性20 例,采用頭孢西丁鈉治療的患者陽(yáng)性12 例。

    2.3 藥物包被紅細(xì)胞鑒定結(jié)果 微柱凝膠抗人球蛋白卡第1 孔(加入陰性對(duì)照試劑與藥物包被紅細(xì)胞)無凝集,第2 孔(加入陰性對(duì)照試劑與無藥物包被紅細(xì)胞)無凝集,第3 孔(加入陽(yáng)性對(duì)照試劑與藥物包被紅細(xì)胞)凝集,第4 孔(加入陽(yáng)性對(duì)照試劑與無藥物包被紅細(xì)胞)無凝集。 由此可見,僅有第3 孔發(fā)生凝集,提示藥物包被紅細(xì)胞成功。

    2.4 頭孢唑啉鈉、 頭孢西丁鈉藥物性抗體陽(yáng)性率頭孢唑啉鈉藥物性抗體陽(yáng)性率高于頭孢西丁鈉(P<0.05); 頭孢唑啉鈉DAT 結(jié)果陽(yáng)性標(biāo)本與頭孢西丁鈉DAT 結(jié)果陽(yáng)性標(biāo)本中藥物性抗體陽(yáng)性率比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);頭孢唑啉鈉DAT結(jié)果陰性標(biāo)本中藥物性抗體陽(yáng)性率高于頭孢西丁鈉DAT 結(jié)果陰性標(biāo)本(P<0.05)。 見表1。

    表1 頭孢唑啉鈉、頭孢西丁鈉藥物性抗體陽(yáng)性率比較[n(%)]

    2.5 DAT 陽(yáng)性標(biāo)本放散液檢測(cè)結(jié)果 頭孢唑啉鈉、頭孢西丁鈉DAT 結(jié)果陽(yáng)性標(biāo)本中不規(guī)則抗體檢測(cè)結(jié)果均為陰性,藥物性抗體均為陽(yáng)性。 見表2。

    表2 DAT 陽(yáng)性標(biāo)本放散液檢測(cè)結(jié)果

    3 討論

    機(jī)體中生成藥物依賴性抗體是導(dǎo)致DIHA 的常見機(jī)制,通常為頭孢類藥物、哌拉西林等所致,DAT 試驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性時(shí)患者常表現(xiàn)為貧血、乏力、黃疸等溶血征象,蒼白、黃疸、脾腫大、淋巴結(jié)腫大等,甚至危及生命[11]。 因此,用藥前采取準(zhǔn)確、有效的藥物性抗體監(jiān)測(cè)預(yù)警技術(shù),減少DIHA 發(fā)生,保障臨床用藥安全,避免藥物誘導(dǎo)性抗體導(dǎo)致的輸血性溶血。

    微柱凝膠法通過離心技術(shù)、凝膠過濾技術(shù)、抗原抗體發(fā)生反應(yīng)的原理,凝集的紅細(xì)胞不能穿過凝膠間隙,留置于凝膠上層,從而呈現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果,而未發(fā)生凝集的紅細(xì)胞在離心力作用下可穿過凝膠間隙沉積于凝膠柱底部,從而呈現(xiàn)陰性結(jié)果[12,13]。DAT 是檢測(cè)機(jī)體中已被補(bǔ)體或不完全抗體致敏的紅細(xì)胞,通常用于新生兒溶血病、 溶血性輸血反應(yīng)、藥物性溶血性貧血等的檢測(cè)。 既往研究顯示[14],DAT 結(jié)果陽(yáng)性的標(biāo)本與藥物性抗體關(guān)系密切。 本研究結(jié)果顯示,168 例患者血漿標(biāo)本與DTA 結(jié)果為陽(yáng)性的標(biāo)本放散液中不規(guī)則抗體均顯示陰性,可排除實(shí)驗(yàn)過程中血型相關(guān)意外抗體陽(yáng)性導(dǎo)致假陽(yáng)性的可能性。此外,本研究的DAT 結(jié)果陽(yáng)性標(biāo)本中,血漿與放散液中均存在有兩種頭孢抗菌素的藥物性抗體;且DAT 結(jié)果陰性標(biāo)本中,同樣存在兩種頭孢抗菌素藥物性抗體。 分析原因可能為:DAT陽(yáng)性結(jié)果可能并非藥物性抗體所致; 部分患者在發(fā)生DIHA 部分癥狀時(shí),已經(jīng)接受了抗菌藥物治療,誘使紅細(xì)胞表面吸附大量藥物性抗體,導(dǎo)致DAT 陽(yáng)性。 通常情況下,采用抗人球蛋白介質(zhì)試管法時(shí)需要洗滌紅細(xì)胞3 至4 次后才可用于檢測(cè),但即使洗滌后血清蛋白極微量的殘留也可能與抗人球蛋白試劑中和。 洗滌不標(biāo)準(zhǔn)、不完全均可能導(dǎo)致結(jié)果可靠性降低,還可能由于抗體分子太少與紅細(xì)胞結(jié)合后無法被檢測(cè)出來。 根據(jù)紅細(xì)胞與IgG結(jié)合的檢測(cè)方式因采用的檢測(cè)方式不同而結(jié)果存在差異,相較于試管法,微柱凝膠法敏感性更強(qiáng),該檢測(cè)方式不需要洗滌紅細(xì)胞,標(biāo)準(zhǔn)加樣與結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)可控也是其優(yōu)勢(shì)之一[15,16]。然而,在某些特殊情況下,例如變形性較差的鐮狀細(xì)胞難以正常通過凝膠柱,影響結(jié)果判斷的準(zhǔn)確性,需臨床檢測(cè)人員細(xì)心觀察并分析患者臨床診斷結(jié)果,需要時(shí)使用試管法DAT 鑒定、分析。

    此外,本研究結(jié)果中,頭孢唑啉鈉及其DAT 陰性標(biāo)本中藥物性抗體陽(yáng)性率均高于頭孢西丁鈉,提示頭孢唑啉鈉面臨著更高的藥物性抗體形成風(fēng)險(xiǎn); 兩種頭孢抗菌素的DAT 陽(yáng)性標(biāo)本中藥物性抗體陽(yáng)性率比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,分析原因可能是當(dāng)DAT 表現(xiàn)為陽(yáng)性時(shí),患者已出現(xiàn)DIHA 相關(guān)癥狀,該種情況下產(chǎn)生的藥物性抗體可能與藥物的使用無關(guān)。

    綜上所述,微柱凝膠法檢測(cè)頭孢唑啉鈉和頭孢西丁鈉誘導(dǎo)形成藥物性抗體時(shí)操作簡(jiǎn)便,結(jié)果穩(wěn)定,可行性強(qiáng),可用于臨床檢驗(yàn)工作。 采用頭孢唑啉鈉和頭孢西丁鈉誘發(fā)DIHA 大多為外科手術(shù)圍術(shù)期預(yù)防性使用抗生素患者,如輸血患者發(fā)生溶血,特別是血管內(nèi)溶血時(shí)需要和輸血反應(yīng)進(jìn)行鑒別,以防誤診。 即便患者僅對(duì)一種頭孢菌素發(fā)生DIHA,同樣需建議其今后注意使用其他頭孢類藥物。

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