趨化因子CXCL10誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞活化促進(jìn)免疫治療對(duì)HER2陽性乳腺癌的效果①

張曉俊 賈苗苗 衛(wèi)麗圓 趙 蓉 高晉南（山西白求恩醫(yī)院乳腺外科，太原 030032）

趨化因子是大小為8～10 kD的趨化細(xì)胞因子。根據(jù)保守位置存在的4個(gè)半胱氨酸殘基，可將趨化因子分為4個(gè)亞族：CXC（α）、CC（β）、C（γ）和CX3C（δ）［1］。其受體分別為CXCR、CCR、CR和CX3CR。CXCL10為CXC亞族成員。不同細(xì)胞類型產(chǎn)生的IFN-γ及促炎細(xì)胞因子刺激可誘導(dǎo)CXCL10分泌［2-3］。CXCL10主要通過CXCR3發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)，為白細(xì)胞化學(xué)誘導(dǎo)劑，尤其是Th1淋巴細(xì)胞［4］。此外，CXCL10參與感染性疾病發(fā)生發(fā)展。外周體液中CXCL10水平升高是宿主Th1細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)標(biāo)志［5］。活化的Th1淋巴細(xì)胞可引起IFN-γ和TNF-α等上調(diào)，刺激靶細(xì)胞CXCL10，使免疫級(jí)聯(lián)反應(yīng)持續(xù)存在。

HER2在15%～20%乳腺癌患者中過表達(dá)，HER2陽性乳腺癌細(xì)胞往往侵襲性更強(qiáng)，是導(dǎo)致HER2陽性乳腺癌患者預(yù)后較差的原因之一［6-7］。過去20年大規(guī)模臨床試驗(yàn)顯示，單克隆抗體曲妥珠單抗在晚期乳腺癌和早期乳腺癌臨床治療中均取得了巨大進(jìn)展［8-9］。而其他藥物，如帕妥珠單抗及曲妥珠單抗-美坦新偶聯(lián)物（T-DM1）均對(duì)HER2陽性晚期乳腺癌有顯著治療效果，有助于延長患者生存時(shí)間［10］。但在各種單抗對(duì)HER2陽性乳腺癌的治療中，有哪些因素參與其中，以及各種單抗對(duì)HER2陽性乳腺癌的治療機(jī)制尚未完全闡明。因此，課題組初步發(fā)現(xiàn)，趨化因子CXCL10可通過誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞活化促進(jìn)曲妥珠單抗在HER2陽性乳腺癌中的治療效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞與小鼠SKBR-3乳腺癌細(xì)胞系購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所細(xì)胞庫（購買鏈接：http：//www.cellbank.org.cn/index.asp）；BALB/c小鼠購自南京大學(xué)模式生物研究所。

1.1.2 主要試劑與儀器McCoy's 5a培養(yǎng)基（Gibco）；胎牛血清（ExCell）；青霉素、鏈霉素（Solarbio）；Lipofectamine2000（Thermo Fisher）；TRIzol試劑（Qiagen）；無RNA酶水（GE）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Oligo dT18和SYBR Green熒光定量試劑盒（TaKaRa）；qRT-PCR所用各基因引物由華大基因合成；RIPA細(xì)胞裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒（碧云天公司）；SDSPAGE預(yù)制膠和Western blot相關(guān)試劑（雅酶公司）；CXCL10單克隆抗體（#14969）、HER2單克隆抗體（#4290）、內(nèi)參β-actin（#4970，Cell signaling technology公司）；CD8多克隆抗體（ab4055，Abcam公司）；HRP標(biāo)記羊抗兔特異性二抗（AS014，Abclonal公司）；ECL顯色液（Millipore公司）；HistostainTMSP-9000免疫組化染色試劑盒（Zymed公司）；紫外可見分光光度計(jì)Nanodrop 2000（Thermo Fisher）；FACSCalibur流式細(xì)胞儀（Becton Dickinson）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 采用含10%胎牛血清的McCoy's 5a培養(yǎng)基培養(yǎng)SKBR-3乳腺癌細(xì)胞系（37℃、5%CO2）。采用慢病毒載體構(gòu)建HER2過表達(dá)的SKBR-3穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，pMD2.g HER2過表達(dá)質(zhì)粒和psPAX2按1∶3∶3轉(zhuǎn)染，按照Lipofecta mine2000說明書轉(zhuǎn)染。

1.2.2 趨化因子CXCL10轉(zhuǎn)基因BALB/c小鼠制備 將PMSG注射至雌性小鼠（5 U/只），2 d后注射HCG（5 U/只）。隨后將雌雄小鼠合籠，分離含陰道栓的雌性小鼠。取若干只小鼠處死，取出輸卵管，采用0.1%透明質(zhì)酸酶和胚胎體外操作液HKSOM處理并清洗小鼠輸卵管，置于胚胎體外培養(yǎng)液KSOM中備用。用注射針吸入線性化的含CXCL10基因的質(zhì)粒，采用持卵針固定受精卵，采用注射針將質(zhì)粒打入受精卵的雄原核內(nèi)，直至雄原核肉眼可見地增大。將性成熟的母鼠與結(jié)扎的公鼠合籠，腹腔注射戊巴比妥溶液（10 mg/ml，0.01 mg/g）。受體母鼠麻醉后，75%乙醇徹底消毒手術(shù)部位，于小鼠背部第一根肋骨下方剪1個(gè)小口，將輸卵管和子宮拉出體外，在子宮上扎1個(gè)小口，將注射有CXCL10基因的受精卵連同培養(yǎng)基等注射至輸卵管傘部，將子宮和輸卵管放回腹腔并縫合。另一側(cè)輸卵管采用相同方法處理。放回鼠籠，20 d后收集鼠崽。

1.2.3 qRT-PCR實(shí)驗(yàn) 收集各組細(xì)胞樣品，采用TRIzol法裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞和組織樣本總RNA，提取步驟參照產(chǎn)品說明書。紫外可見分光光度計(jì)檢測RNA質(zhì)量和濃度。根據(jù)RNA濃度，取1μg RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系和程序參照產(chǎn)品說明書。逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA采用RNase free water稀釋10倍，作為模板進(jìn)行qRT-PCR檢測，按照SYBR Green熒光定量試劑盒說明操作，引物序列見表1。

表1 引物序列Fig.1 Primers sequence

1.2.4 Western blot采用RIPA處理細(xì)胞，4℃孵育30 min，收集細(xì)胞裂解液至1.5 ml EP管，12 000 g、4℃離心15 min，收集上清，BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。向細(xì)胞裂解液中加入蛋白loading buffer煮沸5 min，進(jìn)行10%SDS-PAGE電泳，將20 mg蛋白樣品電轉(zhuǎn)至PVDF膜（0.3 A，20 V），5%脫脂奶粉封閉1 h，分別加入TBST稀釋的CXCL10兔抗（1∶2 000）或HER2兔抗（1∶1 000）4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，加入HRP標(biāo)記的鼠抗兔二抗，室溫孵育1 h，TBST洗膜6次，ECL顯色液顯影，凝膠圖像分析軟件Image J分析各條帶灰度值，計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參蛋白條帶灰度值比值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn) 從處死的移植瘤小鼠中取腫瘤組織及淋巴結(jié)組織，4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，4μm連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟處理。采用SP法常規(guī)操作，微波加熱修復(fù)抗原，沸騰后停止加熱5 min，重復(fù)加熱1次，冷卻至常溫。PBS沖洗切片，滴加正常山羊血清封閉液封閉。HistostainTMSP-9000免疫組化染色試劑盒染色，按試劑盒說明書操作。染色后采用CXCL10兔抗（1∶100）4℃處理過夜，復(fù)溫，PBS沖洗，滴加羊抗兔二抗，37℃孵育30 min，PBS沖洗，滴加辣根標(biāo)記工作液孵育，DAB顯色5～10 min，鏡下調(diào)整染色時(shí)間，蘇木精復(fù)染1 min，樹膠封片，拷片，拍照保存。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù) 收集、清洗細(xì)胞，冰冷PBS、10%FCS、1%疊氮化鈉調(diào)節(jié)細(xì)胞懸液濃度至（1～5）×106個(gè)/ml，添加0.1～10μg/ml偶聯(lián)的CD8一抗4℃避光培養(yǎng)30 min，清洗3次，400 g離心5 min，重懸于500μl～1 ml冰冷PBS、10%FCS及1%疊氮化鈉中，避光冰上保存，立即采用FACSCalibur流式細(xì)胞儀檢測。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 趨化因子CXCL10轉(zhuǎn)基因BALB/c小鼠鑒定PCR結(jié)果顯示，CXCL10在BALB/c小鼠中成功表達(dá)（圖1A）。Western blot證實(shí)CXCL10成功過表達(dá)（圖1B）。qRT-PCR和免疫組化實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步顯示，CXCL10成功過表達(dá)（圖1C、D）。證實(shí)CXCL10過表達(dá)的BALB/c小鼠模型構(gòu)建成功，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 趨化因子CXCL10過表達(dá)BALB/c小鼠鑒定（×200）Fig.1 Identification of chemokine CXCL10 overexpression BALB/c mice（×200）

2.2 HER2陽性SKBR-3乳腺癌細(xì)胞模型鑒定qRT-PCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)，HER2成功過表達(dá)（圖2A）。Western blot結(jié)果與qRT-PCR一致，HER2成功過表達(dá)（圖2B）。證實(shí)HER2過表達(dá)的SKBR-3乳腺癌細(xì)胞模型構(gòu)建成功，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 HER2陽性SKBR-3乳腺癌細(xì)胞模型鑒定Fig.2 Identification of of HER2-positive SKBR-3 breast cancer cells model

2.3 趨化因子CXCL10誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞活化 流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠外周血中各種細(xì)胞分布情況（圖3A），過表達(dá)CXCL10，CD8+T細(xì)胞比例升高，提示HER2陽性乳腺癌小鼠模型中CD8+T細(xì)胞受CXCL10過表達(dá) 的活化（圖3B、C）。但CXCL10在HER2陽性乳腺癌模型中如何誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞活化有待進(jìn)一步研究。

圖3 趨化因子CXCL10誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞活化Fig.3 CXCL10 induces activation of CD8+T cells

2.4 趨化因子CXCL10促進(jìn)HER2陽性乳腺癌免疫治療效果 過表達(dá)CXCL10小鼠中，給予低劑量曲妥珠單抗治療（20μg/只）可抑制HER2高表達(dá)的乳腺癌皮下腫瘤形成（圖4A）。而給予PBS處理的小鼠中，皮下腫瘤大小未見明顯變化。未過表達(dá)CXCL10的小鼠中，無論是否給予曲妥珠單抗治療，皮下腫瘤大小均未見明顯變化（圖4A）。過表達(dá)CXCL10的小鼠中，給予低劑量曲妥珠單抗治療可顯著降低腫瘤重量和體積（圖4B、C）。表明CXCL10過表達(dá)可在給予低劑量曲妥珠單抗治療時(shí)即體現(xiàn)出顯著抗腫瘤效果，推測CXCL10對(duì)HER2陽性乳腺癌免疫治療的促進(jìn)效果是通過CXCL10誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞活化實(shí)現(xiàn)的。

圖4 趨化因子CXCL10促進(jìn)HER2陽性乳腺癌免疫治療效果Fig.4 CXCL10 promoting effect of immunotherapy on HER2-positive breast cancer

3 討論

趨化因子C-X-C基序配體包括CXCL9、CXCL10、CXCL11，通常在細(xì)胞和機(jī)體穩(wěn)定狀態(tài)下表達(dá)較低，但可通過多種因素誘導(dǎo)并激活表達(dá)，如炎癥、腫瘤等［11］。單核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、纖維母細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞均可分泌CXCL9、CXCL10和CXCL11［12］。腫瘤細(xì)胞中，趨化因子分泌主要是由于細(xì)胞對(duì)Ⅰ-IFN、Ⅱ-IFN和TNF-α的反饋應(yīng)答作用，通過激活轉(zhuǎn)錄因子STAT-1和NF-κB實(shí)現(xiàn)［13］。但干擾素調(diào)節(jié)因子3（IFN-regulatory factor-3，IRF-3）可通過直接與CXCL10的啟動(dòng)子靶向結(jié)合，促進(jìn)并調(diào)控CXCL10表達(dá)，并不受I-IFN釋放的影響。因此，通過細(xì)胞和機(jī)體自身的效應(yīng)分子，如STING或TLR-3，IRF-3可直接誘導(dǎo)CXCL10轉(zhuǎn)錄激活［14］。

近年研究表明，趨化因子CXCL10的受體主要包括T細(xì)胞和NK細(xì)胞，并在T細(xì)胞和NK細(xì)胞的抗腫瘤反應(yīng)中，通過促進(jìn)藥物對(duì)腫瘤的滲透以增強(qiáng)其對(duì)腫瘤的治療效果［15-16］。CXCL10可被CXCR3+淋巴細(xì)胞招募，從而直接誘導(dǎo)黑色素瘤退化［17-18］。此外有研究報(bào)道，CXCL10可激活其受體，從而抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖和功能，表現(xiàn)出強(qiáng)大的抗血管生成能力［19］。

CD8+T細(xì)胞通?？杀荒[瘤細(xì)胞消耗殆盡，但也會(huì)受抑制性受體（inhibitory receptors，IRs），如程序性細(xì)胞死亡受體（programmed cell death-1，PD-1）、T-細(xì)胞免疫球蛋白和其黏蛋白3（T-cell immunoglobulin mucin-domain containing-3，TIM-3）、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原（cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4）、T-細(xì)胞Ig和ITIM結(jié)構(gòu)域（TIGIT）及CD160和CD244等激活，從而表達(dá)升高［20-23］。這些IRs功能類似于免疫調(diào)控因子，可促進(jìn)機(jī)體或細(xì)胞對(duì)抗原的耐受性。因此，CD8+T細(xì)胞通常與這些IRs共同表達(dá)。

乳腺癌的免疫治療是一個(gè)不斷發(fā)展的領(lǐng)域，旨在鼓勵(lì)免疫系統(tǒng)更有效地靶向腫瘤細(xì)胞，同時(shí)也希望降低副作用，因此，乳腺癌免疫治療方法是豐富多樣的，如免疫治療疫苗接種、免疫檢查點(diǎn)阻斷、溶瘤病毒治療和抗腫瘤單克隆抗體［24-25］。根據(jù)免疫治療類型，腫瘤免疫治療可分為主動(dòng)免疫和被動(dòng)免疫，其中注射是主動(dòng)免疫治療最常見方法之一。乳腺癌免疫治療面臨的最大的挑戰(zhàn)依然是腫瘤耐藥性，即獲得性耐藥，因此乳腺癌免疫治療初期，一般療效較好，但一段時(shí)間后往往會(huì)復(fù)發(fā)，導(dǎo)致患者預(yù)后較差［26-27］。因此提高免疫治療效果，或發(fā)展多重治療方法，以降低腫瘤獲得性耐藥對(duì)治療的影響，提高患者預(yù)后，改善患者生活質(zhì)量，是目前亟需解決的問題。

本研究發(fā)現(xiàn)，趨化因子CXCL10可通過誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞活化，在給予低劑量曲妥珠單抗治療時(shí)即可起顯著抗腫瘤效果。本研究成功培育了CXCL10轉(zhuǎn)基因的BALB/c小鼠模型，成功構(gòu)建了HER2高表達(dá)的SKBR-3乳腺癌細(xì)胞模型，流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，HER2陽性乳腺癌小鼠異種移植模型中，CXCL10高表達(dá)可有效誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞活化，也直接促進(jìn)曲妥珠單抗的治療效果。本結(jié)果為HER2陽性乳腺癌的免疫治療靶點(diǎn)提供了初步理論依據(jù)，而具體的CXCL10誘導(dǎo)CD8+T活化的機(jī)制，以及CD8+T細(xì)胞在HER2陽性乳腺癌免疫治療中的作用有待進(jìn)一步研究。