猴痘病毒及其疫苗的研究進(jìn)展

呂詩(shī)韻，盧佳，李新國(guó)，楊曉明

1.武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司，湖北 武漢 430207；2.中國(guó)生物技術(shù)股份有限公司，北京 100029

猴痘病毒（monkeypox virus，MPXV）屬痘病毒科（Poxviridae）、脊痘病毒亞科（Chordopoxvirinae）、正痘病毒屬（Orthopoxvirus）的猴痘病毒種。正痘病毒屬還包括天花病毒（variola virus，VARV）、牛痘病毒（cowpox virus，CPXV）和痘苗病毒（vaccinia virus，VACV）［1］。猴痘是由MPXV 感染導(dǎo)致的人畜共患疾病，臨床癥狀與天花相似，癥狀較輕。自1977年全球根除天花以來(lái)，MPXV 成為威脅人類生命健康的重大隱患之一［2］。2022年5月以來(lái)，多個(gè)非猴痘流行國(guó)家相繼報(bào)告了猴痘確診病例，引起了全球的廣泛關(guān)注［3］。截止2022年11月，已有超過(guò)100 個(gè)國(guó)家和地區(qū)報(bào)告了猴痘病例，累計(jì)確診超過(guò)7.7 萬(wàn)例，絕大多數(shù)發(fā)生在今年以前從未報(bào)告猴痘病例的地區(qū)，累計(jì)死亡病例38 例，其中美國(guó)報(bào)告的猴痘病例超過(guò)2.7 萬(wàn)例，位居全球之首，給全球公共衛(wèi)生安全帶來(lái)巨大威脅。中國(guó)重慶、中國(guó)香港、中國(guó)臺(tái)灣共出現(xiàn)3 例輸入性猴痘病例。為避免MPXV 傳入國(guó)內(nèi)，需增強(qiáng)對(duì)MPXV 的認(rèn)識(shí)，提高警惕性，采取各種積極有效的防控措施。同時(shí)還應(yīng)加速研制安全有效的猴痘疫苗及抗病毒藥物，為猴痘疫情的防控提供切實(shí)的保障。本文對(duì)MPXV 及其疫苗的研究進(jìn)展作一綜述，以期進(jìn)一步了解MPXV 及其疫苗研制策略，為防控猴痘疫情在全球的傳播提供幫助。

1 MPXV概述

1.1 MPXV流行病學(xué) MPXV起源于非洲熱帶雨林，1958年，首次從丹麥哥本哈根國(guó)家血清研究所受感染食蟹猴的囊泡-膿皰病變中分離得到［4］。1970 —1979年期間，共發(fā)現(xiàn)了47 例人類猴痘病例，其中38例發(fā)生在剛果，其余發(fā)生在喀麥隆、中非共和國(guó)、加蓬、科特迪瓦、利比里亞、尼日利亞和塞拉利昂［5］。1981—1986年期間，非洲報(bào)告了404例人猴痘病例，其中有386例（96%）來(lái)自剛果民主共和國(guó)。此后，猴痘作為非洲地區(qū)特有的一種人畜共患疾病在小范圍內(nèi)傳播，主要集中在剛果。2003年夏天，美國(guó)中西部地區(qū)報(bào)告了72 例猴痘病例，這是西半球首次出現(xiàn)MPXV［6］。2017年，在尼日利亞暴發(fā)了較大規(guī)模的猴痘疫情，共發(fā)現(xiàn)262例疑似病例、115例確診病例和7例死亡病例［7］。2022年5月以來(lái)，多個(gè)非猴痘流行國(guó)家報(bào)告了猴痘確診病例，證實(shí)了猴痘疫情逐漸在世界范圍內(nèi)蔓延。2022年7月23日，世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）宣布猴痘疫情構(gòu)成“國(guó)際關(guān)注的突發(fā)公共衛(wèi)生事件（Public Health Emergency of International Concern，PHEIC）”。此次猴痘疫情病例數(shù)量增長(zhǎng)迅速，擴(kuò)散范圍極廣，在猴痘疫情發(fā)展歷史上前所未有。

人群對(duì)MPXV 普遍易感，既往接種天花疫苗者對(duì)MPXV 存在一定程度的交叉保護(hù)。所有年齡的人群均可能感染MPXV，幼兒和免疫功能低下人群的病死率較高，尤其是未預(yù)防接種天花疫苗的兒童一旦感染，病死率可達(dá)11%。猴痘為自限性疾病，大部分預(yù)后良好。嚴(yán)重病例常見(jiàn)于年幼兒童、免疫功能低下人群，預(yù)后與感染的不同病毒株、病毒暴露程度、既往健康狀況和并發(fā)癥嚴(yán)重程度等有關(guān)。接種天花疫苗在過(guò)去具有保護(hù)作用，消滅天花后，全球范圍內(nèi)停止了天花疫苗接種，因此，40歲以下人群可能更易感染MPXV。MPXV 經(jīng)黏膜和破損皮膚侵入人體，主要通過(guò)接觸感染動(dòng)物的呼吸道分泌物、病變滲出物、血液、其他體液，或被感染動(dòng)物咬傷、抓傷而感染［8］。人與人之間主要通過(guò)密切接觸傳播。

1.2 MPXV 生物學(xué)特性 MPXV 是正痘病毒屬（痘病毒科，脊痘病毒亞科）的一員，該群體的其他成員包括VARV（天花的病原體）和CPXV 等［1］。正痘病毒均含有可溶性抗原、核蛋白抗原和紅細(xì)胞凝集素，抗原性質(zhì)基本相同，彼此之間有交叉免疫原性。正痘病毒是包膜磚狀病毒，含有大小約200 000 bp 的雙鏈DNA 基因組，正痘病毒在抗原方面彼此密切相關(guān)，且在基因組水平上顯示出顯著的同源性。與其他DNA 病毒不同，正痘病毒在宿主細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中復(fù)制，其組裝涉及脂蛋白雙層外膜的獲取和脫落。在該復(fù)雜過(guò)程中，產(chǎn)生4 種不同形式的病毒粒子：細(xì)胞內(nèi)成熟病毒（intracellular mature virus，IMV）、細(xì)胞內(nèi)包膜病毒（intracellular enveloped virus，IEV）、細(xì)胞相關(guān)包膜病毒（cell-associated enveloped virus，CEV）和細(xì)胞外包膜病毒（extracellular enveloped virus，EEV）。細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外病毒在發(fā)病機(jī)制中均起重要作用。IMV 和IEV 參與病毒在細(xì)胞之間的傳播，從而使細(xì)胞釋放的病毒能在受感染的生物體內(nèi)傳播。

MPXV 是一種有包膜的雙鏈DNA 病毒，基因組相對(duì)較大，約為197 000 bp，編碼190 個(gè)開(kāi)放閱讀框（open reading frame，ORF），構(gòu)成病毒在細(xì)胞質(zhì)中復(fù)制所需的大部分材料，與正痘病毒屬的典型基因組結(jié)構(gòu)一樣，位于MPXV 的中央編碼區(qū)（central coding region sequence，CRS）高度保守，其兩側(cè)是包含反向末端重復(fù)（inverted terminal repeats，ITR）的可變末端［9］。ITR主要由發(fā)夾結(jié)構(gòu)、串聯(lián)重復(fù)和一些ORF組成。雖然MPXV 是一種DNA 病毒，但其病毒DNA 復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、病毒粒子組裝和釋放所需的所有蛋白質(zhì)的編碼均依賴于宿主細(xì)胞，并在宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中發(fā)生。電鏡下MPXV 顆粒呈磚形或橢圓形，大小為200 nm × 250 nm，有包膜。病毒顆粒中有結(jié)構(gòu)蛋白和DNA 依賴的RNA 多聚酶，雙鏈DNA 核蛋白組成類啞鈴狀核心，外周被脂蛋白雙層外膜所包裹。

MPXV 根據(jù)血凝素、TNFR 基因的限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphisms，RFLP）和基因測(cè)序分析確定了兩個(gè)主要分支：西非（WA）株和剛果盆地（CB）株。這兩個(gè)分支具有明顯的地域劃分、流行病學(xué)和臨床差異，西非分支猴痘患者的病死率約為3.6%，剛果盆地分支猴痘患者病死率可達(dá)10.6%。WA分離株主要來(lái)自尼日利亞、利比里亞、科特迪瓦、塞拉利昂和美國(guó)，而CB 分離株主要來(lái)自加蓬、喀麥隆、剛果和蘇丹。2022年第1 批猴痘病例的基因組序列顯示，從系統(tǒng)發(fā)育上看，這些病毒是2017— 2019年從新加坡、以色列、尼日利亞和英國(guó)診斷的病例中采樣的一個(gè)支系的后代。將來(lái)自葡萄牙、比利時(shí)、美國(guó)、澳大利亞和德國(guó)的2022年基因組與最接近的早期基因組進(jìn)行比較，確定了47 個(gè)單核苷酸差異［10］。由于MPXV 被認(rèn)為是一種人畜共患病毒，人與人之間的傳播有限，該分支的出現(xiàn)可能是MPXV 對(duì)人類適應(yīng)性的證據(jù)，增強(qiáng)了病毒的傳播能力，同時(shí)也增加了研發(fā)高效猴痘疫苗的難度。

1.3 MPXV 蛋白 MPXV 粒子中含有蛋白和DNA 依賴的RNA 多聚酶［11］。MPXV 基因組劃分為A ～P 16個(gè)區(qū)段，編碼200 多種蛋白，目前的研究主要集中在一些具有免疫原性的蛋白。如具有保護(hù)免疫原性的成熟病毒粒子表面蛋白L1、A27、D8、H3 和囊膜病毒粒子的表面蛋白B5 和A33［12］。A 區(qū)的A29L基因編碼的A29L 蛋白是存在于IMV 粒子表面的囊膜蛋白，是MPXV 的單抗靶點(diǎn)［13］。A29L 蛋白介導(dǎo)識(shí)別宿主細(xì)胞，使病毒與宿主細(xì)胞催化融合。A35R 是囊膜病毒粒子的重要成分，在病毒傳播中發(fā)揮重要作用，是疫苗研發(fā)的重要靶點(diǎn)，也是血清學(xué)檢測(cè)的潛在靶點(diǎn)［14］。A6R 是病毒復(fù)制的必要蛋白，為RNA 聚合酶前體（約22 kD）。E8L 是囊膜病毒粒子蛋白，在病毒入侵宿主細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，A6R 和E8L 是潛在的藥物靶點(diǎn)［14］。H3L 蛋白位于病毒粒子的囊膜，是一種糖基轉(zhuǎn)移酶［15］。MPXV 具有正痘病毒的典型特征，在復(fù)制過(guò)程中存在兩種形態(tài)不同的感染形式：IMV 和EEV［11，16］。病毒粒子有兩種離開(kāi)細(xì)胞的方式，最主要的一種是通過(guò)細(xì)胞裂解的方式，IMV被直接釋放；另一種通過(guò)細(xì)胞的分泌轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，利用高爾基體分泌到細(xì)胞外，該方式能夠使病毒額外獲得一層被膜從而產(chǎn)生EEV。IMV 和EEV 表達(dá)不同的病毒蛋白，形成獨(dú)特的抗原特征，以區(qū)分兩種形式的病毒粒子。

2 猴痘疫苗的研究

2.1 目前使用的疫苗現(xiàn)狀 據(jù)WHO 報(bào)道，正痘病毒免疫反應(yīng)能夠提供交叉保護(hù)，觀察性研究表明，接種天花疫苗預(yù)防猴痘的有效性約為85%，之前接種過(guò)天花疫苗可能會(huì)降低MPXV 感染導(dǎo)致的病情嚴(yán)重程度［10］。但1981年以后，全球逐步停止接種天花疫苗，40 歲以下人群對(duì)MPXV 缺乏足夠的免疫力。隨著猴痘疫情的擴(kuò)散，猴痘疫苗將會(huì)成為應(yīng)對(duì)疫情的重要工具。截止目前，改良減毒非復(fù)制型牛痘病毒（安卡拉毒株）疫苗JYNNEOS（Imvamune、Imvanex、MVA-BN，一種復(fù)制缺陷型減毒疫苗）是美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）唯一批準(zhǔn)的猴痘疫苗，除了在接觸MPXV 前接種用于預(yù)防之外，在暴露后接種也可能有助于預(yù)防疾病或減輕其嚴(yán)重程度［17-18］。該疫苗由丹麥生技公司巴伐利亞北歐（Bavarian Nordic）生產(chǎn)，共需免疫2劑，間隔28 d。其安全性好于由美國(guó)Emergent BioSolutions生產(chǎn)的天花疫苗ACAM2000，并可保護(hù)動(dòng)物免除致命的正痘病毒疾病，包括非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物的MPXV感染、兔痘病毒感染和VACA 感染［19-20］。該疫苗于2018年獲得美國(guó)FDA 批準(zhǔn)上市，用于18歲以上高危成年人群天花和猴痘感染的預(yù)防，這是FDA 批準(zhǔn)的唯一一款非復(fù)制型天花疫苗，也是世界上唯一一個(gè)獲批的猴痘疫苗［21-22］。

2.2 正在研發(fā)的疫苗

2.2.1 MPXV 減毒疫苗 MPXV 與天花病毒親緣關(guān)系較近，接種天花疫苗可提供交叉免疫。歷史上用來(lái)預(yù)防天花的天花疫苗屬于減毒活疫苗，對(duì)猴痘的保護(hù)率約為85%，但可能會(huì)產(chǎn)生不良的副反應(yīng)［23］。SCHULTZ 等［24］通過(guò)非洲睡鼠模型評(píng)價(jià)天花疫苗對(duì)MPXV 感染的保護(hù)效力，給疫苗組非洲睡鼠接種1次天花疫苗，4 周后感染MPXV，其存活率為100%，而安慰劑組非洲睡鼠感染MPXV后存活率為0。HATCH等［25］通過(guò)食蟹猴模型評(píng)價(jià)第三代天花疫苗對(duì)MPXV感染的保護(hù)效力，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，單次免疫第三代疫苗不能完全避免嚴(yán)重的致死性感染，而加強(qiáng)免疫后可有效保護(hù)食蟹猴。因此，可考慮在天花疫苗的基礎(chǔ)上再進(jìn)行減毒，研發(fā)MPXV減毒疫苗。以MVA-BN技術(shù)平臺(tái)為基礎(chǔ)，研發(fā)猴痘非復(fù)制型減毒疫苗，通過(guò)基因編輯技術(shù)，將決定細(xì)胞毒性和宿主范圍的特異性基因進(jìn)行敲除或修飾，提高疫苗的安全性，同時(shí)不降低其保護(hù)效力，開(kāi)發(fā)出具有更高安全性和免疫原性的MPXV減毒疫苗。

2.2.2 MPXVmRNA 疫苗 mRNA 疫苗作為新型疫苗，在預(yù)防重大傳染病中發(fā)揮了重要作用。2022年5月24日，mRNA 疫苗研發(fā)企業(yè)Moderna 公司宣布，將利用其mRNA 疫苗研發(fā)平臺(tái)開(kāi)展MPXV mRNA 疫苗的研發(fā)。與其他類型疫苗相比，mRNA 疫苗的設(shè)計(jì)與生產(chǎn)更為簡(jiǎn)便。mRNA 疫苗不通過(guò)體外培養(yǎng)病毒，直接將編碼病毒抗原蛋白的mRNA 導(dǎo)入人體，從而節(jié)省了細(xì)胞培養(yǎng)、病毒收獲和純化等過(guò)程，大大縮短了生產(chǎn)時(shí)間，進(jìn)而更易實(shí)現(xiàn)量產(chǎn)。mRNA 疫苗可同時(shí)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫，通過(guò)多種機(jī)制保護(hù)機(jī)體。MPXV mRNA 疫苗研發(fā)過(guò)程中，目的基因序列和mRNA 遞送系統(tǒng)的設(shè)計(jì)是疫苗研發(fā)的重點(diǎn)和難點(diǎn)。篩選出MPXV 的最佳靶抗原是mRNA序列設(shè)計(jì)的關(guān)鍵點(diǎn)，這將在很大程度上決定疫苗的有效性和保護(hù)效力。另一方面，mRNA 疫苗在體內(nèi)遞送過(guò)程中，極易被降解，進(jìn)而會(huì)影響疫苗的有效性。因此，設(shè)計(jì)高效穩(wěn)定的遞送系統(tǒng)對(duì)mRNA 疫苗順利發(fā)揮作用至關(guān)重要。

3 MPXV實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型

用MPXV 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型來(lái)評(píng)價(jià)猴痘疫苗的有效性和保護(hù)效力是非常重要的方法。此外，這些實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型還應(yīng)用于藥物篩選與評(píng)價(jià)、MPXV 傳播的研究。

3.1 小鼠模型 4周齡BALB／c小鼠腹腔注射105PFU的MPXV 后5 d 內(nèi)表現(xiàn)出被毛粗糙、食欲不振、皮膚水腫和活動(dòng)減少等癥狀，并在感染后約10 d 恢復(fù)；4周齡SCID-BALB／c小鼠（免疫缺陷）腹腔注射105PFU的MPXV 后第9 ～11 天死亡，死亡率為100%［26］?？稍谛∈蟮母巍⒎?、腎、卵巢、腋窩淋巴結(jié)、腸道上皮、足部皮膚、尾部皮膚等位置檢測(cè)到MPXV。6 ～7 周齡C57BL／6 小鼠和BALB／c 小鼠足部皮下注射或滴鼻感染105PFU 的MPXV，可導(dǎo)致體重減輕，但并不會(huì)導(dǎo)致死亡，而C57BL／6小鼠癥狀輕于BALB／c小鼠。在38 個(gè)近交系小鼠品系的篩選中，32 個(gè)經(jīng)典品系均對(duì)MPXV的攻擊具有抗性，而6個(gè)野生型品系中有3 個(gè)品系發(fā)生死亡。小鼠模型對(duì)研究MPXV 與人體免疫系統(tǒng)互作有一定的借鑒意義。

3.2 非洲睡鼠模型 非洲睡鼠是MPXV 的自然宿主之一，感染較低劑量的MPXV 即會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的臨床癥狀，如嗜睡、瞇眼、被毛皺褶、僵硬和體溫降低等，半數(shù)致死劑量（LD50）為12 PFU，肝臟中的病毒載量為109PFU／g，高于其他器官約1個(gè)對(duì)數(shù)［24］。睡鼠模型的多器官出血特性適用于研究天花出血機(jī)制，可用于評(píng)價(jià)疫苗的有效性及保護(hù)效力。

3.3 十三條紋地松鼠模型 十三條紋地松鼠經(jīng)腹膜內(nèi)和鼻內(nèi)感染MPXV 后，會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重疾病，并在感染后第6 ～9 天死亡，在肝、脾、腎、腎上腺、肺、心臟和腦組織中均可檢測(cè)到病毒，感染后第3 天可在血液中檢測(cè)到病毒［27］。MPXV 可通過(guò)氣溶膠在地松鼠之間傳播，感染后的存活時(shí)間更短，病情程度更重，其適用于研究人感染MPXV后重癥的發(fā)病機(jī)制。

3.4 黑尾土撥鼠模型 2 周歲黑尾土撥鼠通過(guò)滴鼻5×104PFU／10 μL MPXV 可有效感染，感染后第6、9、12、17天對(duì)黑尾土撥鼠進(jìn)行安樂(lè)死處理，同時(shí)每天監(jiān)測(cè)發(fā)病率及臨床特征，收集口腔拭子、統(tǒng)計(jì)皮膚病變數(shù)。感染后第11 ～14 天，黑尾土撥鼠均表現(xiàn)出MPXV 相關(guān)臨床特征，且有可見(jiàn)病變，所有黑尾土撥鼠均可檢測(cè)出病毒載量，其中舌頭與皮膚損傷部位最高。成年黑尾土撥鼠通過(guò)滴鼻104PFU／50 μL 病毒液可有效感染，感染后第1、3、5、7、9、11、13 天進(jìn)行活體成像，病毒復(fù)制路徑從鼻腔至腹部頸側(cè)區(qū)城，隨后至胸腹部；血液中病毒滴度在感染后第13 ～18天達(dá)最高；病理結(jié)果顯示，皮膚組織呈現(xiàn)亞急性壞死皮炎，肺組織均有多灶性淋巴漿細(xì)胞性間質(zhì)性肺炎，存在感染死亡及感染后恢復(fù)現(xiàn)象［28］。黑尾土撥鼠模型的特點(diǎn)是可出現(xiàn)典型的猴痘癥狀，且高劑量排毒，適用于猴痘發(fā)病機(jī)制和病毒傳播研究。

3.5 食蟹猴模型

非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物的猴痘模型主要有3 種感染方式：靜脈注射感染、氣溶膠暴露感染和氣管內(nèi)感染途徑。

3.5.1 靜脈注射感染 5 × 107PFU 為致死性劑量，通常用于疫苗、藥物的有效性評(píng)價(jià)。動(dòng)物在接種后7 ～14 d 死亡，表現(xiàn)為全身性水皰膿皰性皮疹和明顯的淋巴結(jié)腫大。

3.5.2 氣溶膠暴露感染 感染劑量在2.51 × 104～9.28 × 105PFU，LD50約為7.8 × 104PFU。感染后第4天，可在部分血液樣本和咽拭子樣本中檢測(cè)到低水平的病毒［29］；感染后第6 天，所有血液樣本中均可檢測(cè)到病毒，大部分咽拭子樣本中可檢測(cè)到病毒；感染第14 天后，在血液和咽拭子樣本中檢測(cè)到的病毒水平極低。

3.5.3 氣管內(nèi)感染 5 × 104PFU 的感染劑量可成功感染，并出現(xiàn)病毒血癥，但不會(huì)造成死亡；5×105PFU的感染劑量有可能出現(xiàn)死亡個(gè)例。食蟹猴模型可模擬猴痘臨床癥狀，適合于疫苗和藥物的評(píng)價(jià)。

4 小結(jié)

猴痘是一種危害極大的病毒傳染病，不僅影響中非和西非等非洲國(guó)家，還影響整個(gè)世界，已成為全球公共衛(wèi)生問(wèn)題。隨著猴痘疫情在世界范圍內(nèi)的快速蔓延，給社會(huì)帶來(lái)巨大的健康威脅和經(jīng)濟(jì)損失。為了有效降低MPXV 的傳播風(fēng)險(xiǎn)，增強(qiáng)猴痘疫情防患意識(shí)、加強(qiáng)MPXV 監(jiān)測(cè)和國(guó)際合作至關(guān)重要。為消除猴痘疫情對(duì)人類健康和生命的威脅，須進(jìn)一步提高人群對(duì)MPXV 的免疫保護(hù)水平，包括提高天花疫苗和抗MPXV 藥物的儲(chǔ)備，對(duì)高風(fēng)險(xiǎn)人群進(jìn)行猴痘疫苗的預(yù)防接種，加快研發(fā)更加安全有效的猴痘疫苗，為猴痘疫情的防控提供切實(shí)有效的保障。