枸櫞酸噴托維林緩釋微囊的制備

馬曉星，李永吉，朱文全，劉英楷，杜偉東，馮宇飛（.黑龍江中醫(yī)藥大學 藥學院，哈爾濱 50040；.齊齊哈爾醫(yī)學院 藥學院，黑龍江 齊齊哈爾 6006）

枸櫞酸噴托維林（pentoxyverine citrate，PC），又名咳必清，是一種廣泛應用的成癮性鎮(zhèn)咳藥。其不僅對呼吸中樞有直接抑制作用，而且還有微弱的阿托品作用，可以輕度抑制支氣管內(nèi)的感受器，減弱咳嗽反射，大劑量可使痙攣的支氣管松弛，常配合祛痰藥治療伴有劇烈干咳的急性呼吸道炎癥[1-2]。臨床上多用于上呼吸道感染引起的無痰干咳和百日咳等，尤其適用于兒童用藥[3]。一次口服給藥后作用可持續(xù)4～6 h，藥物半衰期為2～3 h[4]。目前上市劑型主要為片劑、滴丸劑和溶液劑，因藥物作用時間短，一日需給藥3～4次，患者順應性不佳。

殼聚糖和海藻酸鈉是自然界廣泛存在的天然高分子多糖，兩者具有良好的生物相容性和可降解性，安全性良好。殼聚糖溶于稀醋酸后會在分子鏈上產(chǎn)生大批帶有正電荷的伯氨基，海藻酸鈉溶于水后可產(chǎn)生大量帶負電荷的羧基，兩溶液可以通過正、負電荷相互反應形成微囊[5-6]。將藥物制成微囊，可掩蓋藥物的不良氣味，延長藥物作用時間，維持穩(wěn)定的血藥濃度，滿足患者用藥需要，提高藥物穩(wěn)定性等[7]。目前，微囊已作為一種契合臨床用藥需求的緩、控釋制劑和靶向制劑，應用于多種藥物[8-10]。本研究制備PC緩釋微囊，作為一種緩釋制劑中間體，能夠有效地降低血藥濃度波動，減少給藥次數(shù)，從而提高患者的順應性，為進一步研發(fā)PC緩釋制劑提供參考。

1 材料

1.1 儀器

T6紫外-可見分光光度計（北京普析通用儀器有限公司），全自動酸度計（美國奧豪斯儀器有限公司），冷凍干燥機（寧波雙嘉儀器有限公司），低溫高速離心機（德國艾本德股份有限公司），高效液相色譜儀（日本島津）。

1.2 試藥

PC原料藥（鎮(zhèn)江市康富生物工程有限公司，批號：170215），殼聚糖、海藻酸鈉（上海市展云化工有限公司），三乙胺（天津科密歐試劑有限公司），無水氯化鈣（天津市凱通化學試劑有限公司），磷酸鹽緩沖溶液（博士德生物工程有限公司），其他試劑均為分析純或藥用輔料。

2 方法與結(jié)果

2.1 PC微囊的制備

2.1.1 溶液的制備 取海藻酸鈉0.4 g、PC 0.4 g分散在20 mL純化水中，50℃加熱溶解后，靜置，待其充分溶脹，制得2% PC海藻酸鈉溶液。取殼聚糖0.5 g，溶解在50 mL 1%醋酸溶液中，50℃加熱溶解后，靜置，待其充分溶脹，制得1%殼聚糖溶液。取無水氯化鈣0.5 g，分散在50 mL純化水中，制得1%氯化鈣溶液。精密稱取枸櫞酸噴托維林0.2 g，置50 mL的量瓶中，用甲醇-水（1∶1）定容，溶解混勻，再取10 mL置100 mL量瓶中，用甲醇-水（1∶1）定容，溶解混勻，得PC儲備液。取PC儲備液5 mL置100 mL量瓶中，用甲醇-水（1∶1）定容，混合均勻，得PC對照品溶液。

2.1.2 復凝聚法制備PC微囊[11-12]室溫下將2% PC海藻酸鈉溶液以2 mL·min－1的速度滴加到1%氯化鈣溶液中，并不斷攪拌，用冰醋酸調(diào)節(jié)pH至3。同時用冰醋酸調(diào)節(jié)殼聚糖溶液pH至3。將兩溶液混合，加入1 mL戊二醛并不斷攪拌，10℃水浴下反應1.5 h，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至5～6，再反應0.5 h，過濾，純化水洗滌3次，冷凍干燥，即得干燥微囊?？瞻孜⒛业闹苽洌患尤隤C，方法同上。

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件[13]色譜柱為Besil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以1%三乙胺溶液（用磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.0）-甲醇（45∶55）為流動相；進樣量為20 μL；流速為1.0 mL·min－1，檢測波長為215 nm。

2.2.2 專屬性 分別取載藥微囊和空白微囊用純化水洗滌3次，烘箱50℃干燥1 h后，用適量甲醇-水（1∶1）溶解，研缽研碎，4000 r·min－1離心10 min，取上清液至100 mL量瓶中，用甲醇-水（1∶1）定容，混勻。再取1 mL至50 mL量瓶中，用甲醇-水（1∶1）定容，混勻，分別配成含藥樣品和空白樣品。0.45 μm微孔濾膜過濾，按照“2.2.1”項下色譜條件進樣。結(jié)果PC保留時間為20.065 min，輔料對其測定無干擾，專屬性良好（見圖1）。

圖1 PC對照品溶液（A）、空白樣品（B）及含藥微囊樣品溶液（C）的HPLC圖Fig 1 HPLC chromatography of PC control solution（A），blank sample（B）and micro-capsule sample solution containing medicine（C）

2.2.3 標準曲線 取“2.1.1”項下PC儲備液0.5、1、2、4、8、10 mL至10 mL量瓶中，用流動相稀釋成20.10、40.20、80.40、160.8、321.6、402.0 μg·mL－1的溶液，0.45 μm微孔濾膜過濾，進樣測定。以峰面積（y）為縱坐標，PC質(zhì)量濃度（x）為橫坐標進行線性回歸，得標準曲線方程：y＝9.945×103x＋1.337×105，R2＝0.9994。PC在20.10～402.0 μg·mL－1與峰面積線性關(guān)系良好。

2.2.4 精 密度 取“2.2.3”項下40.20、80.40、160.8 μg·mL－1的PC對照品溶液，重復進樣3次，連續(xù)進樣3 d，記錄峰面積，分別考察日內(nèi)和日間精密度。結(jié)果峰面積RSD分別為0.90%和0.96%，日內(nèi)和日間精密度良好。

2.2.5 重復性 取“2.2.2”項下含藥樣品，重復進樣5次，結(jié)果峰面積RSD為1.7%，表明方法重復性良好。

2.2.6 穩(wěn)定性 取“2.2.2”項下含藥樣品，分別于0、4、8、12、24 h進樣，結(jié)果峰面積RSD為2.2%，說明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.7 加樣回收率 精密量取已知含量的PC微囊共9份，向其中分別加入相當于PC含量80%、100%和120%的PC對照品溶液，各3份平行樣。進樣測定，計算回收率。結(jié)果高、中、低質(zhì)量濃度的平均回收率分別為97.63%、99.57%和98.97%，RSD分別為1.7%、2.0%和1.8%，表明方法回收率良好。

2.3 包封率和載藥量的測定

2.3.1 微囊包封率的測定方法 載藥微囊干燥后，用甲醇-水（1∶1）溶解，研缽研碎，4000 r·min－1離心10 min，取上清液至100 mL的量瓶中，用甲醇-水（1∶1）定容至刻度，混勻。再取1 mL至50 mL量瓶中，用甲醇-水（1∶1）定容至刻度，混勻。用0.45 μm微孔濾膜過濾，進樣，計算實際含藥量M1，M0為精密稱取理論含藥量。包封率（%）＝M1/M0×100%。

2.3.2 最佳研磨時間的確定 載藥微囊干燥后，用研缽分別研磨5、10、15、20、25、30 min時測得PC質(zhì)量濃度分別為25.3、32.8、36.1、36.5、35.9、36.4 μg·mL－1。研 磨15、20 min時，藥物濃度基本達到最大值，兩者沒有顯著性差異。最終選擇15 min作為最佳研磨時間。

2.3.3 載藥量的測定 按“2.3.1”項下微囊包封率的測定方法，計算實際含藥量M1，精密稱定載藥微囊重量M2。載藥量（%）＝M1/M2×100%。

2.4 正交試驗優(yōu)化微囊的制備處方及工藝

根據(jù)前期單因素考查結(jié)果，選擇對包封率影響較大的因素：殼聚糖質(zhì)量濃度（A）、成囊溫度（B）、囊材溶液pH（C）進行正交試驗。每個因素分為三個水平，因素和水平見表1，結(jié)果見表2。

表1 正交試驗的因素和水平 Tab 1 Factor and level of orthogonal test

由表2可知：各因素對指標影響的順序為：C＞B＞A，最佳組合為A2B1C1，即殼聚糖濃度為1%，成囊溫度為10℃，囊材溶液pH為3。

表2 正交試驗結(jié)果 Tab 2 Orthogonal test

2.5 最佳工藝的驗證

在最佳工藝及處方條件下制得3批PC微囊，測定微囊包封率與載藥量，見表3。同時在顯微鏡下觀察微囊的形態(tài)，見圖2，微囊外形圓整，分布較均勻，符合要求。使用帶標尺的顯微鏡測定300個PC微囊的粒徑，繪制粒徑分布圖，見圖3，平均粒徑在60 μm左右。

表3 3批微囊包封率和載藥量的測定結(jié)果(n＝3) Tab 3 Encapsulation rate and drug loading of 3 batches of microcapsules (n＝3)

圖2 PC微囊電子顯微鏡圖（400×）Fig 2 Electron microscope of PC microcapsules（400×）

圖3 PC微囊的粒徑分布圖Fig 3 Particle size distribution of PC microcapsules

2.6 PC緩釋微囊釋放度測定

按照溶出度測定法第二法，以純化水為介質(zhì)，轉(zhuǎn)速100 r·min－1，溶出介質(zhì)溫度（37±0.5）℃，用量900 mL。分別在20、40 min以及1、2、4、6、8、10、12 h取樣10 mL（每個時間點取出10 mL，同時補加相同溫度、相同介質(zhì)10 mL），將各時間點取出的溶液用0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液1 mL置10 mL量瓶中，加水定容至刻度，測定并計算PC及其微囊在不同時間點的累積釋放百分率。釋放度結(jié)果見圖4。PC釋放較快，1 h已經(jīng)釋放在90%以上。與之相比，PC微囊在2 h釋放量為30%左右，4 h時接近50%，12 h的累積釋放量達到95%以上，具有一定的緩釋效果。同時，測定3批PC微囊的累計釋放曲線基本一致，重現(xiàn)性良好。

圖4 PC微囊的體外累積釋放曲線Fig 4 Release curve of PC microcapsules

2.7 釋放方程的擬合

根據(jù)PC微囊釋放數(shù)據(jù)，分別用零級方程、一級方程和Higuchi方程擬合，結(jié)果見表4。一級方程的r值最接近于1，說明PC微囊的釋放符合一級方程，具有一定的緩釋作用。

表4 釋放方程擬合 Tab 4 Release equation fitting

3 討論

本試驗以殼聚糖-海藻酸鈉為囊材，采用復凝聚法制備PC緩釋微囊[14-15]，制備工藝簡單、可行，微囊成形性好，同時具有一定的緩釋效果，但包封率不高。滴加過程中，因含PC的海藻酸鈉溶液較為黏稠難以全部滴進氯化鈣溶液中，導致包封率不高。此外，所用針頭孔徑稍大，如若能施加外力，微囊粒度將進一步減小，微囊總表面積隨之變大，從而包裹更多的藥物，包封率可能隨之升高。本研究制備的PC微囊，可進一步為其制備成緩釋制劑，提供參考和依據(jù)，以改善現(xiàn)有劑型的不足，滿足臨床需求。