UPLC-MS/MS法同時測定三葉青中13種黃酮類成分的含量

★ 李春華 袁桂平 王誠遠 何倌發(fā) 陳?。?撫州市食品藥品檢驗所 江西 撫州 44000；.江西省藥品檢驗檢測研究院 南昌 009；.江西共青江中食療科技有限公司 江西 共青城 00）

三葉青為葡萄科崖爬藤屬植物三葉崖爬藤（Tetrastigma hemsleyanumDiels et.Gilg）的塊根，又名蛇附子、石老鼠等［1-2］。主要分布于我國江西、浙江、福建等南方各省，生山坡灌叢、山谷、溪邊林下巖石縫中，具有解毒、化痰、活血散瘀、護肝、抑制腫瘤細胞等作用［2-8］。其在江西民間有著廣泛的應(yīng)用。

不同產(chǎn)地的三葉青黃酮類成分含量的測定方法已有報道［9-16］，但是同時測定三葉青中13種黃酮類成分較為少見。本實驗應(yīng)用UPLC-MS/MS法同時對三葉青中13種黃酮類化合物進行定量研究摸索，以期為三葉青的質(zhì)量控制及開發(fā)利用提供一定的參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器Nexera X2 LC-30A超高效液相色譜（日本島津公司）；TRIPLE QUAD 5500三重四級桿質(zhì)譜（美國AB SCIEX公司）；BP-211D十萬分之一天平（德國賽多利斯公司）；DZKW-S-4電熱恒溫水浴鍋（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）。

1.2 材料對照品信息見表1。乙腈為色譜純(德國Merck公司)，水為Milli-Q超純水(美國Millipore公司)，其他試劑為分析純。8批三葉青樣品于2018年8月—2018年10月采自江西分宜、玉山、萬載、黎川、資溪和浙江衢州等地，經(jīng)江西省藥品檢驗檢測研究院袁桂平主任藥師鑒定為葡萄科崖爬藤屬植物三葉崖爬藤（Tetrastigma hemsleyanumDiels et.Gilg），臘葉樣本存放于撫州市食品藥品檢驗所資料室。2批購自云南。見表2。

表1 對照品信息

表2 三葉青樣品來源

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1 %甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0～0.5 min，8 %→10 %A；0.5～2.5 min，10 %→15 %A；2.5～3.5 min，15 %→18 %A；3.5～6.5 min，18 %→20 %A；6.5～8.0 min，20 %→22 %A；8.0～10 min，22 %→40 %A；10～11 min，40 %→60 %A；11～12 min，60 %→60 %A；12～13 min，60 %→8 %A；13～15 min，8 %→8 %A）；參數(shù)：進樣量為1 μL; 流速為0.25 mL/min；柱溫為40 ℃。

2.2 質(zhì)譜條件離子源：電噴霧離子源，MRM模式進行定量分析；采用負離子檢測模式；離子噴霧電壓為4 500 V；離子源溫度為550 ℃；霧化氣、輔助氣和氣簾氣壓力分別為55、55、35 units。多反應(yīng)監(jiān)測模式定量。監(jiān)測成分離子對，解簇電壓（DP）和碰撞能量（CE）見表3?；旌蠈φ掌芳叭~青樣品的總離子流圖見圖1。

圖1 混合對照品溶液（A）及三葉青供試品溶液（B）的總離子流圖

表3 三葉青中13種成分的質(zhì)譜參數(shù)

2.3 溶液的制備

2.3.1 對照品溶液分別精密稱取表1中所述對照品適量，加入甲醇溶解并稀釋至刻度，分別制成質(zhì)量濃度分別為0.100 2、0.102 7、0.105 7、0.112 6、0.100 2、0.115 5、0.105 4、0.105 1、0.090 6、0.095 3、0.105 9、0.101 8、0.110 3 mg/mL的對照品儲備液。其他不同質(zhì)量濃度的對照品溶液用60 %甲醇稀釋儲備液得到。

2.3.2 樣品溶液三葉青藥材粉碎后過篩；精密稱取0.5 g，加入60 %甲醇50 mL，加熱回流45 min，再用同等濃度的甲醇補足減失重，搖勻，濾過得濾液，取濾液適量，用同等濃度的甲醇稀釋25倍，搖勻，0.22 μm濾膜過濾，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系相關(guān)回歸方程、相關(guān)系數(shù)、定量 限（LOQ）、檢測限（LOD）等見表4。

表4 13種成分線性關(guān)系 ng/mL

2.4.2 重復(fù)性試驗精密吸取同一混合對照品溶液1 μL，連續(xù)進樣6次，記錄峰面積。原花青素B1、兒茶素、原花青素B2、蘆丁、異槲皮苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、紫云英苷、槲皮苷、丁香亭-3-O-葡萄糖苷、阿福豆苷、槲皮素、山柰酚、異鼠李素的峰面積RSD值分別為1.30 %、2.29 %、2.04 %、1.99 %、1.51 %、1.21 %、1.88 %、0.51 %、1.91 %、1.41 %、2.51 %、1.84 %、1.52 %。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗取相同的三葉青供試品（S1）按2.3.2項下方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、6、10、24 h依法測定。計算得到供試品中原花青素B1、兒茶素、原花青素B2、蘆丁、異槲皮苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、紫云英苷、槲皮苷、丁香亭-3-O-葡萄糖苷、阿福豆苷、槲皮素、山柰酚、異鼠李素的含量RSD值分別為0.72 %、1.63 %、1.77 %、0.75 %、2.14 %、0.67 %、2.50 %、0.63 %、0.47 %、0.24 %、2.32 %、1.61 %、0.45 %，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4 重復(fù)性試驗取相同的三葉青供試品（S1）按2.3.2項下方法平行制備6份供試品溶液，依法測定。計算得到供試品中原花青素B1、兒茶素、原花青素B2、蘆丁、異槲皮苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、紫云英苷、槲皮苷、丁香亭-3-O-葡萄糖苷、阿福豆苷、槲皮素、山柰酚、異鼠李素的含量RSD值分別為0.91 %、2.41 %、2.67 %、2.40 %、1.66 %、1.68 %、1.08 %、1.38 %、1.24 %、1.05 %、1.41 %、0.96 %、0.83 %，表明方法重復(fù)性良好。

2.4.5 加樣回收試驗精密稱取已知含量的三葉青供試品（S4）約0.25 g，共取9份，分別精密加入三個濃度梯度的對照品，按“2.3.2”項下方法，每個濃度平行制備3份加樣回收溶液，依法測定，計算得到13中成分的平均加樣回收率為95.84 %～107.38 %，RSD為0.84 %～2.65 %，表明方法回收率良好。

2.5 樣品含量測定取10批三葉青樣品，按“2.3.2”項方法平行制備樣品溶液，按確定的色譜條件和質(zhì)譜條件進行測定，按外標(biāo)法，計算各樣品中原花青素B1、兒茶素、原花青素B2、蘆丁、異槲皮苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、紫云英苷、槲皮苷、丁香亭-3-O-葡萄糖苷、阿福豆苷、槲皮素、山柰酚、異鼠李素的含量。見表5。

表5 10批三葉青中13種成分的含量測定結(jié)果 μg/g

3 討論

本實驗中考察了水、不同濃度甲醇作為提取溶劑和提取時間對三葉青黃酮提取效果的比較，結(jié)果表明，60 %甲醇作為溶劑，加熱回流提取45 min，所測成分含量較高。同時對不同流動相進行了考察（乙腈-水、甲醇-水、甲醇-0.1 %甲酸水、乙腈- 0.1 %甲酸水、甲醇-0.1 %醋酸銨水、乙腈-0.1 %醋酸銨水等），發(fā)現(xiàn)以乙腈-0.1 %甲酸水作為流動相進行梯度洗脫時，所測成分峰型對稱、出峰時間穩(wěn)定、重復(fù)性好。

本實驗采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)同時測定三葉青中13種黃酮類成分的含量，許文等［10］采用內(nèi)標(biāo)法同時測定三葉青中10種黃酮類成分，而本實驗采用外標(biāo)法測定，通過Manual Tuning 針對13種黃酮類成分質(zhì)譜參數(shù)進行優(yōu)化，先在負離子模式下確定母離子，再子離子、碰撞能量和出簇電壓進行優(yōu)化，使每種成分的母離子與特征碎片離子產(chǎn)生的離子對強度達到最佳。質(zhì)譜與液相色譜連接后，對離子源溫度、霧化氣壓力、輔助氣壓力、氣簾氣壓力進行優(yōu)化，使13種黃酮類化合物的離子化效率最佳。對手性異構(gòu)體原花青素B1和原花青素B2分別選擇最佳定量離子對577.2→289.1和577.2→406.9以減少相互之間的干擾。通過流動相梯度的優(yōu)化，在15 min內(nèi)實現(xiàn)了13種化合物在色譜上基本分離，在13種化合物的質(zhì)譜通道上均基線完全分離互不干擾。

對于10批三葉青含量測定的結(jié)果表明，不同產(chǎn)地三葉青中13種黃酮含量有差異，與范世明等［9］、許文等［10］研究結(jié)果一致，有的批次中，未檢出槲皮苷和丁香亭-3-O-葡萄糖苷。13種黃酮類成分含量在不同產(chǎn)地三葉青藥材中存在較大差異，其中S6的原花青素B1最高，其余9批的兒茶素最高；S2的丁香亭-3-O-葡萄糖苷最低，S8紫云英苷最低，其余8批以槲皮苷最低。總黃酮含量S4最高，S7最低。

收集的樣品來自不同的種源，江西玉山縣繁育基地收集了多地的品種，江西萬載縣和分宜縣種植基地系購買江西玉山縣繁育基地幼苗，江西黎川縣種植基地系利用本地野生三葉青育苗、種植，浙江衢州在浙江本地苗圃購幼苗。收集的樣品生長環(huán)境也差別比較大，江西玉山縣為大棚種植，江西萬載縣、黎川縣和分宜縣為坡地露天種植，浙江為林下種植和太陽能板遮陽營養(yǎng)袋種植。不同產(chǎn)地三葉青樣品中13種黃酮含量差異懸殊,可能與各種植基地三葉青引種來源不一致和不同生態(tài)環(huán)境有關(guān)。據(jù)文獻報道，不同產(chǎn)地三葉青樣品中黃酮含量差異懸殊,許文等［10］檢測30批三葉青根黃酮類成分含量為203～2 591 μg/g。不同種源三葉崖爬藤的表型性狀存在豐富的變異，三葉崖爬藤塊莖中總黃酮也存在變異，窄葉的總黃酮含量比闊葉高77.53 %［17］。自然環(huán)境的時空異質(zhì)性會導(dǎo)致不同的選擇壓力，處于不同環(huán)境的種源則可能在次生代謝產(chǎn)物方面產(chǎn)生分化［18-19］。不同種質(zhì)之間三葉青進行統(tǒng)一人工栽培后，產(chǎn)量、有效成分并不相同［19］，塊莖中總黃酮和多糖含量與莖粗、新稍長、葉長、葉寬、單葉面積、塊莖直徑和單株塊莖鮮質(zhì)量總體上呈極顯著負相關(guān)［19］，同時三葉青塊莖總黃酮含量隨著生長年限的增長而不斷上升［20］。

本實驗建立了超高效液相色譜串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜法測定三葉青中13種黃酮類化合物的含量測定，該分析方法簡便可行、快速準(zhǔn)確，可為三葉青中黃酮成分的分析和質(zhì)量控制提供一定的參考。