基于網絡藥理學探討“白術-白芍”藥對治療潰瘍性結腸炎的作用機制

★ 王艷茹 安明偉 唐勇 湯盧偉 易思彬 付文強（.江西中醫(yī)藥大學 南昌 330004；.江西省中醫(yī)院 南昌 330006）

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種比較特殊的腸道炎性疾?。?-2］，其病因已排除細菌及病毒的感染，目前研究更傾向于屬于免疫系統(tǒng)疾?。?-4］，是外源物、基因和免疫力相互作用的結果。病理主要表現為糜爛及潰瘍的持續(xù)性進展［5］。根據流行病學調查，遺傳、種族、免疫、心理等因素都會影響UC的發(fā)病和進展［3,6-7］，其臨床表現嚴重影響患者的工作及生活，如果不積極治療，容易引發(fā)并發(fā)癥，而且存在惡變的可能性。

目前，UC的發(fā)病機制并不明確［8-9］，臨床上治療方案多以PAS制劑、抗菌藥物、激素治療、生物制劑、益生菌制劑、腸道糞菌移植等［10-12］，再加上部分藥物保留灌腸治療［13］，患者癥狀確有改善，但終究達不到根治的目的，且部分治療方案價格昂貴，所需藥物成分不易提取，服用后副作用大，后期復發(fā)率高。因此，尋求一種安全可靠、物美價廉的治療方法成為了當代的需求。

UC癥狀與中醫(yī)學中的“泄瀉”“痢疾”“腸澼”及“臟毒”等疾病的癥狀極其相似［6,14-15］。說明中醫(yī)在UC治療方面經驗豐富。不管在古代醫(yī)案中，還是在臨床和學術研究上，經典名方—痛瀉要方均被提及且應用頻率頗高?！夺t(yī)方集解》在對痛瀉要方進行方解時以“苦燥濕”“補脾溫中”“瀉肝火”和“緩中止痛”的闡述，說明“白術-白芍”作為該方的君藥和臣藥，在方中的補脾柔肝、祛濕止瀉的功效中起到關鍵作用［15-17］；《保命集》對于太陰病瀉痢不止的患者，主張用芍藥和白術來進行保命治療，強調了此病的兇險和棘手，同時指明了此病的診治方向和體現兩味中藥聯(lián)合使用的價值［18］。中藥方劑中，把“白術-白芍”藥對作為核心地位的有朱丹溪的痛瀉要方、李杲的當歸芍藥湯、還有張景岳的調胃白術散等，以上方劑主治相似，在調和肝脾的基礎上進行隨癥加減和變通。目前，“白術-白芍”藥對被廣泛運用于UC與腸易激綜合征的臨床治療中［19-21］，且療效顯著。為進一步明確該藥對治療UC的作用機制，本文在網絡藥理學的基礎上，篩選出“白術-白芍”的有效活性成分及作用靶點，并構建“藥物-成分-基因-疾病”可視化網絡圖，實現藥物有效成分與疾病基因的有效對接，為中醫(yī)藥在UC治療作用中提供依據。

1 資料與方法

1.1 “白術-白芍”藥對有效成分的篩選及作用靶點的獲取進入中藥系統(tǒng)藥理學技術（TCMSP數據庫）平臺,自定義生物利用度≥30 %，類藥性指數≥0.18為篩選條件［22-23］，分別篩選出白術、白芍的有效活性成分，構建“白術-白芍”數據庫，并進一步利用該平臺得到藥物相關有效成分的作用靶點，構建靶點數據庫。

1.2 疾病靶點篩選以“ulcerative colitis”為關鍵詞 ，運用 Genecards數據庫、人類基因和基因表型綜合數據庫（OMIM）獲取疾病“潰瘍性結腸炎”的相關靶點。

1.3 可視化網絡圖的構建與分析運用Cytoscape 3.7.2軟件，將“白術-白芍”的有效成分的靶點與疾病的靶點進行匹配。以藥物-疾病共有活性成分、成分對應基因、Ulcerative colitis相關靶點、藥物主要成分共四個節(jié)點建立對應的關系，并導入 Cytoscape 3.7.2軟件，構建“藥物-成分-基因-疾病”可視化網絡關系圖。

1.4 “白術-白芍”藥對治療UC的蛋白互作網絡構建將“Drug-Disease”基因上傳 STRING 數據庫，將organism局限于Homo sapiens,進一步構建蛋白相互作用網絡圖（PPI），并隱藏脫落的基因。

1.5 生物學過程和信號通路富集分析在GO和KEGG富集分析下，描述基因功能及獲得顯著富集的信號通路，從而進一步探討“白術-白芍”藥對治療UC的生物學過程及主要的信號通路。

2 結果

2.1 藥物活性成分、靶點及基因的轉化通過利用TCMSP數據庫，搜尋“baizhu”“baishao”有效成分共141個，添加自定義篩選條件后，共獲取符合條件的有效成分20個。見表1。在該數據庫中獲取“baizhu”“baishao”相關靶點共1 764個；利用Strawberry-perl軟件，對有效成分及藥對靶點進行匹配，并篩除重復靶點后得到146個靶點；把成分對應的靶點名稱轉化為相對應的基因簡稱共113個，形成藥物基因數據庫。見表2。

表1 白術、白芍活性成分

表2 白術、白芍基因簡稱數據庫

2.2 疾病靶點數據庫的建立 在Genecards及OMIM數據庫中搜集UC的疾病靶點共4 165個，在R 3.6.2運行幫助下，把“baizhu-baishao”靶點數據庫與疾病靶點數據庫中Gene Symbo進行匹配，并制作venny圖尋找共同基因，藥對疾病共44個。見圖1。

圖1 藥物-疾病共有作用靶點

2.3 白術-白芍藥對“藥物-成分-基因-疾病”可視化運用Cytoscape 3.7.2軟件，將“白術-白芍”的有效成分的靶點與疾病的靶點進行匹配，構建“藥物-成分-基因-疾病”可視化網絡關系圖，綠色三角形表示藥對-疾病共有的44個靶點，大紅色菱形表示疾病UC，玫紅色的橢圓表示藥對“色的橢圓表示藥對對對疾病點進行，9個黃色的菱形表示藥物的主要有效成分，內部的線段表示相互之間的關系。由此可以看出“白術-白芍”藥對對疾病UC的治療具有多靶點、多成分的特點。見圖2。

圖2 藥物-成分-基因-疾病可視化網絡圖

2.4 具白術-白芍”藥對治療潰瘍性結腸炎蛋白互作網絡將“Drug-Disease”基因上傳STRING數據庫，將organism局限于Homo sapiens,進一步構建蛋白相互作用PPI網絡圖。見圖3。可知共有44個共有靶點的蛋白，未有脫落的游離蛋白，再根據44個靶點的蛋白的count值，由大到小進行排序。見圖4。

圖3 蛋白互作網絡圖（PPI 網絡）

2.5 生物學GO和KEGG富集分析在GO富集分析下可知共有74個GO生物學過程，截取前20個GO條目，制成柱狀圖和氣泡圖。見圖5-6?？芍幬锘钚猿煞之a生作用與血紅素、四吡咯、肽、酰胺等結合、氧化還原酶活性等相關。

圖5 GO富集分析（柱狀圖）

圖6 GO富集分析（氣泡圖）

在KEGG通路富集分析下可得到121條通路。截取前20個KEGG通路，制成柱狀圖、氣泡圖和通路圖，見圖7-9?？芍帉χ械闹饕煞謪⑴cAGE-RAGE、TNF、Toll樣受體、IL-17、C型凝集素受體、NF-素受、PI3K-Akt、NOD樣受體和MAPK等多條信號通路，且與乙型肝炎、結核、麻疹、甲型流感及各種病毒感染等相關，說明藥對的主要成分可以直接或通過121信號通路間接作用于UC的相關受體靶點，而且與多種疾病相關，在其它疾病的治療當中本藥對也具有研究價值。

圖7 KEGG富集分析（柱狀圖）

3 討論

《內經》中“腸澼”注重對大便的觀察，認為該病所排大便質黏滑，排便時因泄瀉辟辟作響［24］；《醫(yī)學發(fā)明》強調氣滯致痛，利則氣順痛減；《千金要方·熱痢》認為冷痢見膿白便，熱痢見血紅便，疳痢見膿血赤白便，蠱痢見純瘀血便；《醫(yī)方考》認為痢疾病因在濕熱，熱傷血下赤，熱傷腸道，里急后重感明顯。綜上所述，不管是“腸澼”，還是痢疾，從其描述的癥狀分析，與西醫(yī)學的UC歸屬于同一種疾病，且中醫(yī)學對于疾病病因及發(fā)病機制有較多研究。

圖8 KEGG富集分析（氣泡圖）

圖9 KEGG通路富集分析

對于本病的治療，中醫(yī)體現了自身的優(yōu)勢，其中運用最為廣泛的當屬中藥，不管是內服還是灌腸，都能起到很好的對疾病的控制和治療作用。白術-白芍作為補脾柔肝、祛濕止瀉的經典藥對，在組方中使用頻率很高?，F代藥理研究表明白術在胃腸道領域應用廣泛，不僅能影響胃腸動力、抗?jié)儽Ｗo胃腸黏膜、增強人體免疫功能［9,25］，還具有保肝、利尿、抗應激、抗氧化等多種功能［26-27］。白芍同樣具有抗炎抗菌、抑制胃酸、調節(jié)機體免疫系統(tǒng)等作用［28］。白術-白芍應既能對癥抗炎抗感染，改善腸內環(huán)境，又能增強人體免疫功能，起到治標固本的作用。因此本研究利用網絡藥理學，剖析白術-白芍的作用靶點，并尋找其作用通路，為該藥對治療UC提供數據支撐。

本研究發(fā)現：“白術-白芍”藥對中成分較多，起主要治療作用有：（3S,5R,8R,9R,10S,14S）-3,17-dihydroxy-4,4,8,10,14-pentamethyl-2,3,5,6,7,9-hexahydro-1H-cyclopenta［a］phenanthrene-15,16-dione（甜菊糖）、paeoniflorin（芍 藥 苷）、beta-sitosterol（β-谷 甾醇）、sitosterol（谷甾醇）［10］、kaempferol（山奈酚）、（+）-catechin［（+）-兒 茶 素 ］、14-acetyl-12-senecioyl-2E,8Z,10E-atractylentriol［14-乙?；?12-酰基-8-順式折術三醇甘草黃酮（多炔類化合物）］、3β-acetoxyatractylone（3β-乙酰氧基蒼術酮）和8β-ethoxy atractylenolide Ⅲ（8β-乙氧基白術內酯Ⅲ）。查閱相關資料發(fā)現，因甜菊糖具有促進新陳代謝、降血壓和治療胃酸過多的功能［29-31］，臨床上可用于高血壓、胃炎等疾病的控制和治療。芍藥苷常作為心血管用藥保護心肌細胞［32］，此外還具有抗炎、抗?jié)儭⒄{節(jié)免疫力等藥理作用［33-34］。近年來，芍藥苷還被運用于胃腸道的炎癥治療［35］，如可通過TNF信號通路，減少機體白細胞來減輕炎癥反應，來保護胃腸黏膜。β號谷甾醇作為谷甾醇的一種［36］，因其具有很好的降膽固醇作用，被廣泛運用于高脂血癥［37］；此外，藥理學研究還發(fā)現具有止咳、抑制腫瘤和修復組織的作用，因此可用于呼吸道疾病和皮膚粘膜的修復。山奈酚用于腫瘤的預防和治療最為常見［38］，此外還可以抗炎抗氧化［39］，對于潰瘍面有很好的保護和抑菌作用，（+）-兒茶素經小鼠等實驗被證實具有調節(jié)抗凋亡蛋白、化學預防、抑制環(huán)氧酶活性及延遲腫瘤等作用，并廣泛運用于臨床，如預防人類前列腺癌等。多乙酰氧基蒼術酮和8酰氧乙氧基白術內酯Ⅲ作為白術揮發(fā)油的組成成分，具有抑菌抗炎、抗氧化及提高人體免疫力等作用。綜上所述，9種有效成分自身均具有特定的功效，對于UC疾病的治療具有多靶點、多途徑、多成分、多層次的特點，但在中藥特色劑型高溫煎煮的物理及化學作用下，湯劑成分表現為多樣性和復雜性。

從“白術-白芍”藥對治療UC蛋白互作網絡結果來看，IL6、AKT1、JUN、MAPK8、PTGS2等都是該藥對治療UC的關鍵靶點。IL-6屬于多效細胞因子，其表達的主要激活因子是IL-1b和腫瘤壞死因子［40］，而以上三種因子都屬于炎癥因子，參與炎癥和疼痛反應。此外，IL6的形成還可以通過其他途徑，比如藥對中的成分通過Toll樣受體信號通路刺激單核細胞和巨噬細胞，從而產生大量的IL6，而其可作為急性炎癥反應中的敏感指標。從KEGG信號通路圖分析可知，AKT1通過PI3KAkt信號通路參與包括細胞凋亡和葡萄糖代謝在內的生物學過程，發(fā)揮新陳代謝的作用［41］；MAPK8通過MAPK信號通路發(fā)揮抑制疼痛的作用；PTGS2與腫瘤的生成相關，該因子的啟動，與NF-的生、NF-IL-6結合點位有關［42］。

通過對74個GO生物學過程和121條KEGG信號通路分析發(fā)現，“白術-白芍”藥對治療UC主要體現在參與炎癥和疼痛反應、氧化還原反應、調節(jié)胃腸道運動、抗?jié)兒驮鰪姍C體免疫功能，同時與AGE-RAGE、TNF、Toll樣受體、IL-17、C型凝集素受體、NF-素受和PI3K-Akt等多條信號通路有關。研究表明，AGE與RAGE是糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)［43-44］，能夠激活NF-激活等因子，發(fā)揮氧化應激反應；二者在相互作用的同時可以激活PI3K-Akt信號通路。張濤等［45］在觀察UC相關癌性小鼠的過程中發(fā)現，該信號通路可以介導CDK1表達，誘導炎性緩解，達到修復黏膜的作用。而在本研究過程中，AGE-RAGE、PI3KAkt信號通路在治療UC過程中占有重要地位，因此，有較大的可能認為此兩條信號通路治療UC的作用機制與氧化應激、腫瘤相關。Toll樣受體屬于天然免疫，本身及其信號通路與抗感染免疫相關，主要體現在與巨噬細胞和中性粒細胞等結合，產生炎癥效應，并產生大量炎癥介質，如IL-6，TNF-a等；激活DCs，誘導免疫反應。IL-17和NF-17是免疫反應中的關鍵細胞因子，既參與炎癥、免疫反應，又能調控細胞凋亡。研究發(fā)現，IL-17、NF-17［6,46］及其誘導產生物、所組建的信號通路在UC、腫瘤、哮喘等多種炎癥及免疫問題上發(fā)揮重大作用。

通過疾病作用靶點及信號通路探究可知：“白術-白芍”藥對的主要成分通過多個信號通路直接或者間接作用于疾病受體靶點，一方面能夠抗炎抗感染、調節(jié)胃腸道運動、抗?jié)円员Ｗo胃腸黏膜來治標；另一方面又能增強機體免疫力來固本，使中藥藥對治療相關疾病多了數據支撐，提高了中醫(yī)中藥治病救人的可信度和科學性，為進一步明確“白術-白芍”藥對治療潰瘍性結腸炎的作用機制提供一定理論基礎。