苦參堿對放射性肺損傷大鼠氧化應(yīng)激抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究

★ 曾財花 方永青 何志堅 侯本超 林倩霞 羅小泉 劉海云（.江西中醫(yī)藥大學(xué) 南昌 0004；.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院 南昌 0006；.江西省腫瘤醫(yī)院 南昌 009）

放療是治療胸部腫瘤的方法之一，但在放療過程中，肺部組織往往會有不同程度的損傷，這嚴(yán)重限制了胸部腫瘤的放療效果。放射性肺損傷對患者機(jī)體健康造成嚴(yán)重危害，至今尚沒有理想的治療方法，所以預(yù)防尤為重要［1］。目前，西醫(yī)治療最常用方法是糖皮質(zhì)激素及非類固醇消炎藥，但存在巨大副作用，因此并不適合長期預(yù)防性管理和使用，并且對放射性纖維化并沒有很大的療效［2］。運(yùn)用中藥治療放射性肺損傷具有一定的療效，且毒副作用小。

苦參堿是由豆科植物苦參的干燥根、植株、果實(shí)提取的生物堿［3］。在臨床上對放射性肺損傷有一定的治療作用，可提高胸部腫瘤的放療劑量。胸部腫瘤放療的過程中會造成肺部炎癥的發(fā)生，有文獻(xiàn)報道炎癥因子可以激活氧化應(yīng)激，導(dǎo)致肺損傷［4］。前期本課題組研究已證實(shí)苦參堿可以抑制放療后病人炎癥因子的釋放［5］及在不同時間點(diǎn)黃芩苷可以抑制放射性肺損傷大鼠的炎癥因子釋放［6］。故本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究苦參堿對放射性肺損傷大鼠氧化應(yīng)激的影響，證實(shí)苦參堿對放射性肺損傷大鼠氧化應(yīng)激的抑制作用并探索其可能機(jī)制。

1 材料

1.1 試藥苦參堿購于吉林益民堂制藥有限公司（HPLC法測定純度>98 %，批號：33020822）;地塞米松購自河北天成藥業(yè)股份有限公司（批號：H22033003，5 mg/支）；SOD試劑盒（批號：20180121）、MDA試劑盒（批號：20180217）及GSH-PX試劑盒（批號：20180214）均購自南京建成科技有限公司；生理鹽水；戊巴比妥鈉由武漢培全化學(xué)試劑有限公司提供。

1.2 動物清潔級雄性SD大鼠144只,體重（200±20）g,大鼠購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物有限公司,許可證號SCXK（贛）2016-0011,室內(nèi)溫度維持在25～27 ℃，相對濕度維持在50 %～60 %，室內(nèi)空氣良好，正常通風(fēng)，大鼠分籠每天進(jìn)行飼料喂養(yǎng),進(jìn)水不限,標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)4 d左右,無異常者正式選入開始實(shí)驗(yàn)。

1.3 儀器微量進(jìn)樣器（德國Eppendorf公司）；BSG-26數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海博訊公司）；AdventurerTM電子天平（奧豪斯國際貿(mào)易有限公司）；TCL-16G型臺式高速離心機(jī)（上海市實(shí)驗(yàn)儀器總廠）；TECAN酶標(biāo)儀（奧地利 TECAN公司）；sunriseEL3OlsripReader酶標(biāo)儀（北京世貿(mào)遠(yuǎn)東科學(xué)儀器有限公司）；Varian300C 6 MV-X線直線加速器（Varian醫(yī)療系統(tǒng)公司）；550型酶標(biāo)儀（美國BIO-RAD伯樂）。

2 方法

2.1 藥物制備以臨床成年人的治療用量為依據(jù)，按大鼠的等效劑量進(jìn)行折算，地塞米松大鼠用藥劑量為5 mg/kg，苦參堿治療組大鼠用量分別為50、100、200 mg/kg。另用適量生理鹽水將其配置成懸浮液，充分?jǐn)嚢瑁靹?，現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.2 實(shí)驗(yàn)動物分組及給藥選取144只健康SD大鼠，根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為6組，隨機(jī)分配為正常對照組、模型組（單純照射組）、地塞米松組及苦參堿低、中、高濃度（50、100、200 mg/kg）給藥組，每組24只，正常組不予照射，其余組均進(jìn)行X線照射，照射后苦參堿和地塞米松用生理鹽水配置為懸浮液，苦參堿低、中、高濃度組灌胃給藥，每日1次；正常組和模型組每天同一時間注射相同體積的生理鹽水。在照射開始后第2、4、8、12周，6組各任意挑選1只大鼠處死、取樣，取標(biāo)本備用。

2.3 動物模型制備［5］除正常組外，其余組大鼠用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，根據(jù)特定排序?qū)⑵涔潭ㄓ谥委煷采希蛊涑恃雠P位，暴露大鼠胸部，屏蔽頭腹部，并將照射視野調(diào)整好，照射范圍從大鼠前肢兩腋窩中點(diǎn)連線，至劍突水平，照射面積為4 cm×3 cm。在照射過程中，空白照射組大鼠不予以照射，其余各組選用直線加速器（6 MV-X線）對實(shí)驗(yàn)大鼠整個肺進(jìn)行一次照射，單次劑量為15 Gy，照射距離為1 m，輸出功率為300 cGy/min，總劑量為30 Gy,照射前要用紫外線消毒照射部位。

2.4 標(biāo)本留取分別在SD大鼠照射結(jié)束后第2、4、8、12周時，每組隨機(jī)選取6只大鼠，麻醉后迅速取除肺組織，稱重，然后制備肺組織勻漿，隨后將該肺勻漿試管放置于離心機(jī)離心，轉(zhuǎn)速3 000 r/min，溫度在4 ℃，離心時間10 min，離心結(jié)束后吸取上清液制備肺懸液凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.5 血清指標(biāo)檢測按試劑盒的操作要求，利用比色法檢測實(shí)驗(yàn)大鼠血清中MDA含量、SOD活性和GSH-PX活性。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法運(yùn)用分析軟件SPSS 19.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以（±s）表示,各組間采用LSD法對數(shù)據(jù)兩兩比較分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠外觀形態(tài)的觀察正常對照組大鼠各項指標(biāo)檢測均正常，具體表現(xiàn)為飲食進(jìn)水量正常，反應(yīng)迅速，呼吸頻率未產(chǎn)生較大改變，皮毛光澤；而其它組大鼠在照射后開始出現(xiàn)飲食進(jìn)水量減少，精神萎靡，大便干燥，呼吸頻率升高，反應(yīng)遲緩等癥狀；單純照射組大鼠隨著照射時間的延長個別大鼠出現(xiàn)活動遲緩的現(xiàn)象；與之相比，苦參堿和地塞米松給藥組在給藥一段時間后，飲食由差逐漸好轉(zhuǎn)，活動量也有所改善，出現(xiàn)1例大鼠死亡現(xiàn)象。

3.2 各組大鼠肺組織MDA含量變化比較相比于正常對照組，單純照射組大鼠肺組織MDA含量在輻射后明顯升高;相比于單純照射組,苦參堿低、中、高劑量組和地塞米松激素組大鼠肺組織MDA含量水平均逐漸降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

表1 各組大鼠各時點(diǎn)肺組織MDA含量的變化（ ±s，n=6） nmol/mL

表1 各組大鼠各時點(diǎn)肺組織MDA含量的變化（ ±s，n=6） nmol/mL

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。第12周低劑量組大鼠死亡1只，樣本數(shù)為5，下同。

組別 2周 4周 8周 12周正常對照組 2.01±0.32 2.12±0.21 2.08±0.18 2.26±1.01模型組 3.02±0.42* 3.42±1.16* 4.12±1.03* 4.86±2.08**地塞米松組 2.18±1.08** 2.25±0.38## 2.48±0.31 2.85±1.46##苦參堿低劑量組 2.84±1.32# 2.91±1.13# 3.16±0.18# 3.78±1.34苦參堿中劑量組 2.61±0.67# 2.74±1.26## 2.82±0.23# 3.41±1.23#苦參堿高劑量組 2.33±0.48## 2.43±1.24## 2.52±0.86# 3.07±2.14##

3.3 各組大鼠肺組織SOD活性變化比較相比于正常對照組，單純照射組大鼠肺組織SOD活性在輻射后明顯降低;相比于單純照射組,苦參堿低、中、高劑量給藥組和地塞米松激素給藥組大鼠肺組織SOD活性均逐漸升高。見表2。

表2 各組大鼠各時點(diǎn)肺組織SOD含量的變化（ ±s，n=6） U/mL

表2 各組大鼠各時點(diǎn)肺組織SOD含量的變化（ ±s，n=6） U/mL

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。

組別 2周 4周 8周 12周正常對照組 133.24±11.54 131.48±10.24 135.76±9.45 134.36±10.98模型組 90.12±10.24* 85.32±11.24* 76.63±12.48** 68.56±11.24**地塞米松組 126.65±12.49## 121.13±10.17 115.24±14.64## 112.32±12.32##苦參堿低劑量組 100.12±16.16# 95.57±12.67# 90.98±10.31# 80.72±11.52苦參堿中劑量組 124.56±14.23# 112.34±11.68# 101.65±11.24# 90.64±10.49#苦參堿高劑量組 130.45±9.98## 126.16±14.24# 123.43±9.96## 109.65±12.78##

3.4 各組大鼠肺組織GSH-PX活性變化相比于正常對照組，單純照射組大鼠肺組織GSH-PX活性在輻射后明顯降低;相比于單純照射組,苦參堿低、中、高劑量給藥組和地塞米松激素給藥組大鼠肺組織GSH-PX活性均顯著升高。見表3。

表3 各組大鼠各時點(diǎn)肺組織GSH-PX含量的變化（ ±s，n=6） U/mL

表3 各組大鼠各時點(diǎn)肺組織GSH-PX含量的變化（ ±s，n=6） U/mL

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。

組別 2周 4周 8周 12周正常對照組 182.76±14.21 180.23±8.32 183.74 ±10.71 181.16±11.98模型組 126.21±13.32* 116.81±9.68* 110.41±12.24* 92.36±13.09**地塞米松組 170.43±11.08# 159.62±12.65## 146.67±14.36## 135.26±12.45##苦參堿低劑量組 134.391±12.35 120.45±10.12# 115.42±11.28# 110.72±13.26苦參堿低劑量組 146.12±12.35# 136.04±8.78## 126.02±13.45# 118.98±10.43#苦參堿低劑量組 158.14±16.48## 147.69±11.47# 138.74 ±11.26# 126.37±12.25##

4 討論

苦參堿是傳統(tǒng)中草藥苦參的主要成分,具有清熱燥濕功效，目前在臨床上主要用于治療心臟病、病毒性肝炎、抗病毒、抗腫瘤和抗肝纖維化等［8］。目前苦參堿已被證明可以以多種方式來抑制腫瘤細(xì)胞的生長。在接受苦參堿聯(lián)合放療治療的肺癌患者中，苦參堿顯著提高了其治療效果［9］, 此外苦參堿已被證明在治療牛皮癬和濕疹等皮膚病方面具有臨床療效［5,10］。

在胸部腫瘤放射治療過程中，在治療腫瘤的同時也會傷及正常肺組織，給正常組織帶來一定的不利影響，相關(guān)炎癥因子會非?；钴S，造成肺部炎癥的發(fā)生［11］，若無法得到及時控制，后期將轉(zhuǎn)變?yōu)榉卫w維化，前期實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)放射性肺損傷大鼠在不同時間點(diǎn)炎癥因子有所增加［3］。目前對于放射性肺損傷的機(jī)理尚不完全清楚，臨床研究證實(shí)，肺在受照射后引起炎癥反應(yīng)進(jìn)一步激活氧化應(yīng)激，產(chǎn)生氧自由基，而自由基是一種有毒物質(zhì)，它可以攻擊細(xì)胞中的大分子物質(zhì)，引起細(xì)胞內(nèi)各種各樣的反應(yīng)，如DNA的損傷、氧化應(yīng)激、細(xì)胞衰老甚至凋亡等［12］。

SOD是反映機(jī)體氧化應(yīng)激的一項重要指標(biāo)，SOD在體內(nèi)不僅起著清除機(jī)體內(nèi)超氧陰離子自由基（O2-），抑制體內(nèi)自由基反應(yīng)的作用，另外對其它抗氧化酶也可起到保護(hù)作用，減弱輻射對肺組織細(xì)胞造成的損傷［13］。經(jīng)放射線照射后，SOD的活性降低, 不僅會使氧自由基堆積, 而且氧自由基會轉(zhuǎn)變?yōu)榱u自由基,會更大程度地?fù)p傷細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能［14］。因此可以通過各組大鼠SOD的活力測定間接反映所用藥物對SOD活性的影響，體現(xiàn)藥物對肺損傷大鼠的氧化應(yīng)激抑制作用。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，輻射引起大鼠肺組織產(chǎn)生大量自由基，SOD活性降低。與之相比，苦參堿給藥組SOD活性明顯增強(qiáng)，表明苦參堿有減弱肺部炎癥發(fā)生和預(yù)防肺纖維化的療效，從而達(dá)到抑制放射性肺損傷的作用。

MDA也是反映人體氧化損傷程度的指標(biāo)之一。人體組織細(xì)胞在受到自由基攻擊時，會發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，MDA是脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物。因此MDA含量的變化間接反映了人體組織細(xì)胞脂質(zhì)過氧化的嚴(yán)重程度［15］，通過MDA含量的測定可以體現(xiàn)所用藥物對肺損傷大鼠脂質(zhì)過氧化的影響。在本實(shí)驗(yàn)中，單純照射組經(jīng)射線照射后MDA含量上升，給藥后，MDA含量與單純照射組相比已明顯下降，說明中藥苦參堿具有抑制脂質(zhì)過氧化的能力。

GSH-PX是一種存在于機(jī)體中的酶，它可催化過氧化氫的分解。GSH-PX可以在體內(nèi)捕獲自由基, 催化還原型谷胱甘肽對氫過氧化物的還原反應(yīng), 能夠?qū)?xì)胞結(jié)構(gòu)和功能有一定的保護(hù)作用［16］。本實(shí)驗(yàn)觀察到，單純照射組大鼠經(jīng)射線照射后GSH-PX活性降低，而苦參堿給藥組GSH-PX活性與模型組相比有了明顯地增加，揭示苦參堿能夠升高GSHPX活性，減弱自由基的過氧化反應(yīng)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，單純照射組經(jīng)射線照射后MDA含量升高，SOD、GSH-PX活性降低；而經(jīng)苦參堿治療后，血清中MDA含量有所降低，SOD、GSH-PX活性升高，表明苦參堿可以提高肺組織細(xì)胞中抗氧化酶的活性, 阻斷自由基的反應(yīng)，證明中藥苦參堿對放射性肺損傷有一定的療效，其作用機(jī)制可能是減弱自由基反應(yīng)和抑制脂質(zhì)過氧化，為苦參堿的臨床應(yīng)用和肺損傷的防治提供了依據(jù)。