青光眼動(dòng)物模型在青光眼研究中的應(yīng)用

宋 碩，孟 永，李 華2，*

1中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)研究總院國(guó)家上海新藥安全評(píng)價(jià)研究中心，上海201203；2上海益諾思生物技術(shù)股份有限公司，上海201203；3益諾思生物技術(shù)南通有限公司，江蘇 南通226133

1 青光眼簡(jiǎn)介

“青光眼（glaucoma）”這一術(shù)語(yǔ)源自希臘語(yǔ)“glaukós”，指綠色或淺灰色的，因此又稱(chēng)為綠內(nèi)障，是一種常見(jiàn)的視網(wǎng)膜神經(jīng)退行性疾病［1］。盡管該疾病的病理生理學(xué)過(guò)程仍不完全明確，但其與眼壓（intraocular pressure，IOP）升高、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（retinal ganglion cell，RGC）死亡以及視神經(jīng)軸突變性的相關(guān)性已得到證實(shí)［2］。青光眼是世界范圍內(nèi)導(dǎo)致不可逆失明的主要原因，預(yù)計(jì)到2040年，青光眼患者將達(dá)到1.118億［3］。青光眼有幾個(gè)已知的危險(xiǎn)因素，如眼壓升高、家族史、高度近視以及心血管疾病等，其中眼壓升高是最重要的危險(xiǎn)因素。然而，在眼壓正常或治療后恢復(fù)正常眼壓的青光眼患者中，神經(jīng)退行性變?nèi)钥赡芾^續(xù)進(jìn)展。神經(jīng)損傷的發(fā)病機(jī)制多種多樣，包括谷氨酸所致的神經(jīng)毒性、一氧化氮以及神經(jīng)炎癥和神經(jīng)保護(hù)調(diào)節(jié)的失衡等［4］。

鑒于此，青光眼一直是眼科疾病臨床前和臨床研究中的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。青光眼臨床前研究主要依賴(lài)動(dòng)物模型，利用動(dòng)物模型模擬人類(lèi)青光眼的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，研究其危險(xiǎn)因素、發(fā)病機(jī)制，以促進(jìn)抗青光眼藥物的開(kāi)發(fā)和治療手段的改進(jìn)。按不同的分類(lèi)方法，當(dāng)前青光眼動(dòng)物模型可分為急性、慢性模型，高眼壓、正常眼壓模型，體內(nèi)、體外模型，以及自發(fā)產(chǎn)生或誘導(dǎo)產(chǎn)生的模型等［5］。本文將介紹當(dāng)前青光眼動(dòng)物模型建立的方法及在青光眼研究中的應(yīng)用，以期改進(jìn)當(dāng)前青光眼動(dòng)物模型，并為新模型的構(gòu)建提供思路和啟發(fā)。

2 青光眼動(dòng)物模型

2.1 自發(fā)型青光眼動(dòng)物模型

自發(fā)型青光眼動(dòng)物模型是動(dòng)物自發(fā)產(chǎn)生（遺傳）或者人為對(duì)其進(jìn)行基因改造（轉(zhuǎn)基因）得到的，對(duì)青光眼臨床前體內(nèi)研究具有重要價(jià)值。遺傳性青光眼的發(fā)生常見(jiàn)于比格犬等多個(gè)犬種，其中比格犬原發(fā)性青光眼是一種常染色體隱性遺傳病，多在9～18個(gè)月大時(shí)發(fā)病［6］。多個(gè)種屬的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物自發(fā)型青光眼模型已得到廣泛應(yīng)用，包括犬、小鼠、雞、家兔等，其中以小鼠研究和應(yīng)用最多。小鼠眼球在多個(gè)方面與人眼相似、發(fā)育周期短、價(jià)廉，可以根據(jù)造模需求進(jìn)行青光眼相關(guān)致病基因的插入、敲除、修飾等轉(zhuǎn)基因操作，成為研究青光眼發(fā)病的分子機(jī)制、遺傳學(xué)因素及藥物治療機(jī)制等較為理想的動(dòng)物模型。但是小鼠眼球小，相關(guān)眼科檢查和檢測(cè)難度較大，限制了小鼠青光眼模型的發(fā)展。DBA/2J小鼠是背景信息最豐富的小鼠模型之一，與人類(lèi)青光眼有許多相似之處，作為一種年齡依賴(lài)性的遺傳性高眼壓青光眼模型被廣泛用于青光眼研究。其自發(fā)出現(xiàn)前節(jié)異常（前房加深、角膜水腫等）、虹膜萎縮、虹膜外周粘連和色素分散，導(dǎo)致眼壓約從8月齡開(kāi)始升高，具有典型的青光眼損傷特點(diǎn)，但不同小鼠間RGC損傷的程度有很大差別［7-8］。有研究報(bào)道視網(wǎng)膜中過(guò)表達(dá)Norrin的轉(zhuǎn)基因小鼠（Pax6-Norrin）與DBA/2J小鼠雜交得到DBA/2J/Pax6-Norrin小鼠，1歲DBA/2J/Pax6-Norrin組小鼠的視神經(jīng)軸突存活率明顯高于同窩DBA/2J組，該研究為青光眼治療提供了一個(gè)可能的新靶點(diǎn)［9］。轉(zhuǎn)基因青光眼動(dòng)物的主要優(yōu)點(diǎn)在于個(gè)體間眼壓升高、視網(wǎng)膜和視神經(jīng)損傷等方面的反應(yīng)更加一致，個(gè)體差異小。更重要的是，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的使用有助于識(shí)別引起疾病的基因座之間的相互作用。

除了自發(fā)型高眼壓青光眼模型，自發(fā)的正常眼壓青光眼（normal tension glaucoma，NTG）小鼠模型也有研究報(bào)道。谷氨酸/天冬氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體（glutamate/aspartate transporter，GLAST）和興奮性氨基酸載體1（excitatory amino acid carrier 1，EAAC1）的缺失可導(dǎo)致RGC自發(fā)死亡和視神經(jīng)退行性變，不伴隨眼壓升高，病理過(guò)程與NTG類(lèi)似。Harada等［7］總結(jié)了目前已經(jīng)建立的多種青光眼動(dòng)物模型，包括GLAST敲除小鼠、EAAC1敲除小鼠、視神經(jīng)蛋白E50K敲入小鼠、DBA/2J小鼠和實(shí)驗(yàn)性誘導(dǎo)模型，并分析了各自的優(yōu)點(diǎn)和局限性。其中GLAST敲除小鼠、EAAC1敲除小鼠和視神經(jīng)蛋白E50K敲入小鼠雖然發(fā)生了RGC變性，但眼壓表現(xiàn)正常，這些小鼠的視網(wǎng)膜變性始于3～5周齡，具有比人類(lèi)青光眼預(yù)期更早更快的時(shí)間進(jìn)程。高眼壓模型的研究結(jié)果對(duì)NTG也是有用的，綜合考慮NTG模型和高眼壓模型治療的結(jié)果可能會(huì)促進(jìn)針對(duì)非眼壓因素的新治療方法的開(kāi)發(fā)。

2.2 誘導(dǎo)型青光眼動(dòng)物模型

誘導(dǎo)型青光眼動(dòng)物模型是通過(guò)一定誘因人為誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物發(fā)生青光眼而得到的，是研究青光眼發(fā)病機(jī)制及藥理藥效的重要手段。與自發(fā)型模型相比，其優(yōu)勢(shì)在于，在同一只動(dòng)物中提供了一個(gè)對(duì)照眼，即一只眼睛接受誘導(dǎo)，另一只眼睛作為對(duì)照，大大節(jié)省了動(dòng)物使用量。為開(kāi)展對(duì)照實(shí)驗(yàn)創(chuàng)造了合適的條件，將解決自發(fā)型青光眼模型的發(fā)病時(shí)機(jī)和疾病過(guò)程難以控制的問(wèn)題。

2.2.1 眼壓依賴(lài)性青光眼動(dòng)物模型

眼壓依賴(lài)性青光眼動(dòng)物模型，即動(dòng)物眼壓隨著誘導(dǎo)因素的施加而升高，表現(xiàn)為高眼壓，伴或不伴有RGC凋亡、視神經(jīng)軸突變性等視神經(jīng)損害。由于當(dāng)前高眼壓癥的動(dòng)物模型研究較少，本文所述眼壓依賴(lài)性青光眼動(dòng)物模型僅指伴高眼壓的青光眼動(dòng)物模型。眼壓依賴(lài)性動(dòng)物模型的建立方法多種多樣，但目前單個(gè)模型僅能模擬某一種類(lèi)型青光眼的疾病表型，或其表型某一方面的特點(diǎn)。因此，建立相似性高、標(biāo)準(zhǔn)化、可重復(fù)、適用、可控、易行、經(jīng)濟(jì)的高眼壓模型對(duì)青光眼基礎(chǔ)及臨床研究具有重要意義。

高眼壓被認(rèn)為是青光眼最主要的危險(xiǎn)因素，大多數(shù)的青光眼模型都是通過(guò)阻止房水排出而升高眼壓。房水處于動(dòng)態(tài)循環(huán)中，它由睫狀體的睫狀突上皮產(chǎn)生后到達(dá)后房，通過(guò)瞳孔進(jìn)入前房，然后由前房經(jīng)小梁網(wǎng)進(jìn)入Schlemm管，再經(jīng)集液管和房水靜脈最后進(jìn)入鞏膜表層的睫狀前靜脈而回到血液循環(huán)，為壓力依賴(lài)性外流途徑。另有少部分房水從葡萄膜鞏膜途徑引流（占10%～20%）或經(jīng)虹膜表面隱窩吸收（微量），為非壓力依賴(lài)性排出途徑。房水循環(huán)通道任一部位受阻，都將導(dǎo)致眼壓升高［10］，因此模型建立的關(guān)鍵部位主要為小梁網(wǎng)及上鞏膜靜脈［5］。

2.2.1.1 前房注射特定物質(zhì)

通過(guò)向?qū)嶒?yàn)動(dòng)物前房?jī)?nèi)注射一定量的特定物質(zhì)，增加房水外流阻力或者堵塞小梁網(wǎng)，從而減緩或阻斷房水流出，導(dǎo)致眼壓升高。目前文獻(xiàn)報(bào)道的用于前房注射的物質(zhì)包括透明質(zhì)酸鈉、甲基纖維素、復(fù)方卡波姆、微球、水凝膠、自體血細(xì)胞、S-抗原等。Yu等［11］通過(guò)向Sprague-Dawley大鼠前房單次注射7 μL由羧甲基透明質(zhì)酸和聚乙二醇二丙烯酸酯以4∶1的比例預(yù)先混合而成的原位交聯(lián)水凝膠，來(lái)升高其眼壓。并評(píng)估了與青光眼相關(guān)的重要視覺(jué)功能變化、常見(jiàn)降眼壓藥物的降壓效果以及原位交聯(lián)水凝膠前房注射對(duì)角膜內(nèi)皮的安全性影響。閃光視覺(jué)誘發(fā)電位（flash visual evoked potential，F(xiàn)VEP）的P1潛伏期和振幅變化表明該模型能有效誘導(dǎo)視神經(jīng)功能損害。除匹羅卡品的降壓效果不明顯，其余所評(píng)估的藥物均有效。第2、4和8周對(duì)角膜內(nèi)皮的組織學(xué)分析、TUNEL和CCK-8檢測(cè)結(jié)果與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異。因此，認(rèn)為前房單次注射水凝膠對(duì)高眼壓青光眼的建模有效，對(duì)多數(shù)常用的降眼壓藥物有反應(yīng)，且對(duì)角膜內(nèi)皮無(wú)毒性。Hazlewood等［12］向3月齡C57BL/6J小鼠右眼前房注射2 μL粒徑為6 μm聚苯乙烯微球和1 μL透明質(zhì)酸鈉，誘導(dǎo)眼壓升高。從注射微球的當(dāng)天，飼喂小鼠含或不含替米沙坦的固體顆粒飼料。盡管兩組小鼠IOP升高的幅度和持續(xù)時(shí)間相似，但相比替米沙坦治療小鼠，未喂食替米沙坦的小鼠視神經(jīng)軸突的變性率顯著增加（49.00%vs.0.58%），表明替米沙坦具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用。

相對(duì)于聚苯乙烯或乳膠微球，可以定向吸引的磁性微球和方便觀察的熒光微球，因?yàn)榫哂凶⑸浜罂杀欢ㄏ蛭练拷?，不?huì)大量積聚于瞳孔區(qū)而影響通過(guò)瞳孔的眼底檢查和便于觀察微球的分布位置等優(yōu)點(diǎn)，越來(lái)越多被應(yīng)用。更為重要的是，使用磁性微球時(shí)僅需要更少的注射次數(shù)即可實(shí)現(xiàn)眼壓持續(xù)升高，大大提高了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。Tribble等［13］向Brown Norway大鼠前房單次注射6～8 μL（1.6×106個(gè)/μL）直徑4.5 μm的環(huán)氧樹(shù)脂磁性微球，并使用手持磁鐵吸引使其堵塞房角，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Brown Norway大鼠磁性微球模型再現(xiàn)了人類(lèi)青光眼的許多臨床相關(guān)特征，表現(xiàn)出與人類(lèi)青光眼相似的RGC退行性變、相一致的血管損害以及伴有高眼壓的眼球整體尺寸擴(kuò)大。

2.2.1.2 類(lèi)固醇誘導(dǎo)

高眼壓是臨床上眼科應(yīng)用慢性類(lèi)固醇藥物治療時(shí)最常見(jiàn)的并發(fā)癥，約90%的青光眼患者和30%的疑似青光眼患者在使用類(lèi)固醇制劑治療4周后出現(xiàn)了中度眼壓升高。類(lèi)固醇誘導(dǎo)的青光眼模型類(lèi)似于原發(fā)性開(kāi)角型青光眼（primary open angle glaucoma，POAG），患者小梁網(wǎng)的形態(tài)變化，房水流出受阻。在一些動(dòng)物模型中使用類(lèi)固醇誘導(dǎo)小梁網(wǎng)變性已被廣泛報(bào)道，局部、全身和眼周等途徑給予類(lèi)固醇制劑均可導(dǎo)致動(dòng)物模型眼壓升高［14］。Rybkin等［15］總結(jié)了從嚙齒類(lèi)動(dòng)物到靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物的體外細(xì)胞和器官培養(yǎng)以及體內(nèi)動(dòng)物模型，用于研究類(lèi)固醇誘導(dǎo)眼壓升高在特定方面的優(yōu)點(diǎn)和局限性，并提供了這些模型系統(tǒng)用于理解類(lèi)固醇誘導(dǎo)高眼壓的例子。盡管體外模型無(wú)法完全模擬體內(nèi)的復(fù)雜性，但它們對(duì)于了解類(lèi)固醇誘導(dǎo)高眼壓的分子機(jī)制，以及篩選針對(duì)性的治療藥物都不可或缺。了解每種模型的優(yōu)點(diǎn)和局限性，對(duì)于選擇最佳系統(tǒng)來(lái)解決問(wèn)題至關(guān)重要，將推動(dòng)對(duì)類(lèi)固醇誘導(dǎo)眼壓升高的病理生理學(xué)機(jī)制的理解。

2.2.1.3 激光光凝房水流出通道

通過(guò)激光單獨(dú)或聯(lián)合光凝小梁網(wǎng)、角膜緣靜脈叢和鞏膜外血管等房水引流相關(guān)組織，減少房水流出，可導(dǎo)致眼壓升高。12～16周齡、體重40～45 g的雄性Swiss白化小鼠麻醉后，左眼接受二極管激光光凝。激光束直接瞄準(zhǔn)并發(fā)射到角鞏膜緣和上鞏膜靜脈，不透過(guò)任何透鏡。激光光斑大小為50～100 μm，照射時(shí)間0.5 s，輸出功率為0.3 W，每只眼睛光凝55～76處。光凝后第1～3天，激光眼的眼壓顯著高于對(duì)照眼，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；第5天，眼壓開(kāi)始下降，第7天接近對(duì)照眼眼壓值［16］。為了探討激光誘發(fā)的高眼壓對(duì)食蟹猴視錐細(xì)胞和視網(wǎng)膜厚度的長(zhǎng)期影響，Liu等［17］用氬激光光凝5只雄性食蟹猴右眼，左眼作為對(duì)照眼。激光光斑大小50 μm，功率11.5 W，暴露時(shí)間0.5 s，在小梁網(wǎng)中段光凝燒傷60～150處。首次光凝2周后，對(duì)眼壓低于30 mmHg的食蟹猴，再對(duì)剩余的小梁網(wǎng)進(jìn)行激光光凝。激光眼反復(fù)給予激光光凝后，高眼壓可維持?jǐn)?shù)年。6年后行光學(xué)相干斷層掃描（optical coherence tomography，OCT）和藍(lán)色背景下紅色閃光的視網(wǎng)膜電圖（electroretinogram，ERG）檢查。結(jié)果顯示，和對(duì)照眼相比，激光眼視盤(pán)杯盤(pán)比增大；神經(jīng)纖維層和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞復(fù)合體明顯變?。幻饕曍?fù)波ERG的平均振幅、平均最大圓錐框幅均顯著降低。表明激光誘發(fā)的長(zhǎng)期高眼壓影響了食蟹猴視錐細(xì)胞作為光感受器的功能。

激光誘導(dǎo)的青光眼模型相對(duì)可靠、簡(jiǎn)單，是研究青光眼視神經(jīng)保護(hù)的一種很好的方法，但該方法需要昂貴的設(shè)備和對(duì)操作人員專(zhuān)門(mén)的訓(xùn)練，需要多次重復(fù)激光操作才能維持較長(zhǎng)時(shí)間高眼壓。不同物種對(duì)激光能量的吸收也不同，使用時(shí)需要摸索激光參數(shù)。此外，眼壓升高的幅度和持續(xù)時(shí)間差別也很大，也可能會(huì)引起前房積血和角膜水腫等眼部炎癥［14］。

2.2.1.4 上鞏膜靜脈注射高滲生理鹽水

將高滲生理鹽水注入鞏膜表面靜脈使小梁網(wǎng)硬化，房水流出阻力增加，可引起實(shí)驗(yàn)動(dòng)物眼壓升高，其中最常使用的動(dòng)物是大鼠。Morrison等［18］詳述了Brown Norway大鼠鞏膜靜脈注射操作的過(guò)程和技巧，在眼睛的赤道部放置一個(gè)塑料環(huán)，塑料環(huán)留有一個(gè)缺口便于注射目標(biāo)靜脈，同時(shí)阻塞所有引流的血管，避免高滲生理鹽水大量流失。盡量選擇較大、分支少的上鞏膜靜脈，將其仔細(xì)與鞏膜分離后，插入一個(gè)連接注射器的玻璃微針，緩慢注射50 μL濃度為1.5～2.5 mol/L的高滲鹽水。鹽水逆行進(jìn)入Schlemm管并穿過(guò)小梁網(wǎng)進(jìn)入眼睛，角膜周?chē)軈沧儼?、前房加深，由此產(chǎn)生炎癥和前房角、小梁網(wǎng)瘢痕。剛開(kāi)始眼壓可能低于正常值，但隨著房水生成恢復(fù)和前房角瘢痕的形成，術(shù)后7～10 d眼壓將開(kāi)始高于正常水平。

除了包括操作所必需的設(shè)備和具體方法等注射技術(shù)之外，大鼠品系的選擇、高滲鹽水的濃度范圍、眼壓測(cè)量的時(shí)間和頻率、眼壓升高的峰值和持續(xù)時(shí)間、視神經(jīng)損傷模式等也有文獻(xiàn)報(bào)道［19］。高滲鹽水模型依賴(lài)于房水流出的解剖結(jié)構(gòu)，小梁網(wǎng)和前房角產(chǎn)生瘢痕，房水流出梗阻導(dǎo)致眼壓升高，這可能會(huì)重現(xiàn)人類(lèi)青光眼角膜、鞏膜和視盤(pán)的應(yīng)力和張力的特征。此外，眼壓升高的過(guò)程是漸進(jìn)性的，仔細(xì)規(guī)劃和記錄眼壓，捕捉峰值和中度眼壓，可減少獲得準(zhǔn)確眼壓病史的難度，而且可以獲得良好的眼壓變化與神經(jīng)損傷的相關(guān)性。因此，該模型可以被用來(lái)研究壓力誘發(fā)的視神經(jīng)損傷機(jī)制，并評(píng)估潛在的神經(jīng)保護(hù)療法。

2.2.1.5 激光、燒灼或結(jié)扎上鞏膜靜脈

房水從Schlemm管和集合管引流匯入上鞏膜靜脈，然后進(jìn)入靜脈循環(huán)，因此，可以通過(guò)激光、燒灼或結(jié)扎來(lái)封閉兩條或多條上鞏膜靜脈，減少房水流出，從而增加眼壓。眼壓升高的幅度取決于所封閉的上鞏膜靜脈的數(shù)目。兩種或兩種以上的上鞏膜靜脈封閉術(shù)會(huì)導(dǎo)致長(zhǎng)期的眼壓升高和ERG改變。一次燒灼上鞏膜靜脈的成功率為36%～100%，可使眼壓持續(xù)升高10 d至24周，而聯(lián)合上鞏膜靜脈結(jié)扎術(shù)可使眼壓持續(xù)升高6個(gè)月以上［20］。

激光光凝上鞏膜靜脈產(chǎn)生高眼壓的原理與上鞏膜靜脈燒灼法類(lèi)似，燒灼法需燒灼2～3 mm的上鞏膜靜脈，燒灼范圍較大；而激光可光凝1 mm以內(nèi)的上鞏膜靜脈，光凝范圍較小，由于小鼠眼球小、鞏膜薄，使得激光光凝鞏膜上靜脈建立高眼壓模型的方法特別適用于小鼠［21］。Zhang等［22］比較了單純鞏膜外靜脈閉塞和合并2700角膜緣血管閉塞的5～8周齡CD1小鼠激光光凝誘導(dǎo)眼壓升高的差異。單純或聯(lián)合激光光凝后，IOP在術(shù)后1～6 d內(nèi)顯著升高，在7 d恢復(fù)到基線水平；前段OCT檢查顯示單純或聯(lián)合激光前，房角粘連較少，角膜緣血管正常；單純或聯(lián)合光凝后角膜厚度均明顯增加，前房未檢出炎性細(xì)胞，視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層（retinal nerve fiber layer，RNFL）厚度和RGC密度均顯著降低。結(jié)果顯示，單純激光鞏膜外靜脈和合并激光2700角膜緣血管的兩種激光方法的檢測(cè)結(jié)果無(wú)顯著性差異。

2.2.1.6 環(huán)角鞏膜緣縫合

環(huán)角鞏膜緣縫合是一種簡(jiǎn)單、微創(chuàng)、經(jīng)濟(jì)有效的方法，可誘導(dǎo)大鼠和小鼠高眼壓，導(dǎo)致神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損傷。升高眼壓的機(jī)制可能是改變了虹膜根部、睫狀肌、脈絡(luò)膜和鞏膜間隙的生理功能，破壞了葡萄膜鞏膜流出途徑?？p線壓迫導(dǎo)致睫狀肌內(nèi)的間距減小，鞏膜突對(duì)房水的泵送減少，從而減少房水流出。其他機(jī)制包括對(duì)鞏膜內(nèi)靜脈和鞏膜淺層靜脈叢的壓迫，從而升高上鞏膜靜脈壓，進(jìn)而導(dǎo)致眼壓升高［23］。Long Evans大鼠和C57BL/6小鼠在全身麻醉的情況下，分別用7/0和10/0尼龍縫合線在眼球赤道部周?chē)慕Y(jié)膜上進(jìn)行環(huán)形縫合，不穿透鞏膜，打一個(gè)活結(jié)將縫合線系緊。通過(guò)調(diào)節(jié)活結(jié)的松緊度，以達(dá)到目標(biāo)眼壓。大鼠的IOP可維持穩(wěn)定升高至少8周，小鼠的IOP可維持升高12周，同時(shí)暗視閾 值 反 應(yīng)（positive Scotopic Threshold Response，pSTR）、RNFL厚度和RGC密度降低。更為重要的是，該模型可以在需要時(shí)拆除縫線，使眼壓恢復(fù)到基線值。眼壓正常化可能有助于研究可逆及不可逆RGC損傷的細(xì)胞和分子相關(guān)性機(jī)制［24］。有研究比較了CD1小鼠激光光凝上鞏膜靜脈和角膜緣血管、環(huán)角膜緣縫合所引起的IOP和視網(wǎng)膜病變。根據(jù)即刻眼壓峰值的水平，環(huán)角膜緣縫合模型又分為急性（＞55 mmHg）和慢性（＜55 mmHg）。激光組IOP在5 h達(dá)到峰值，7 d內(nèi)恢復(fù)正常。所有縫合組IOP最初即出現(xiàn)峰值并逐漸下降，但在第7天時(shí)仍顯著升高。與慢性縫合模型相比，急性縫合模型在7 d內(nèi)產(chǎn)生RNFL和RGC的快速丟失，這可能是由于縫合后數(shù)小時(shí)內(nèi)視網(wǎng)膜缺血再灌注所致。激光模型介于急性和慢性縫合模型之間，RNFL和RGC損失比急性縫合模型少，但明顯多于慢性縫合模型。這些結(jié)果提示，在應(yīng)用環(huán)角膜緣縫合模型時(shí)，首先要考慮初始眼壓峰值，并根據(jù)不同的研究目的，合理選擇急性和慢性模型［25］。

2.2.2 眼壓非依賴(lài)性青光眼動(dòng)物模型

同樣地，眼壓非依賴(lài)性青光眼動(dòng)物模型，即動(dòng)物眼壓不隨著誘導(dǎo)因素的施加而升高，表現(xiàn)為正常眼壓，但多伴有視神經(jīng)損害。臨床上單純控制眼壓的治療方法并不能完全阻止青光眼惡化，因此，直接損傷視神經(jīng)或視網(wǎng)膜的非眼壓依賴(lài)性青光眼動(dòng)物模型也被廣泛研究和應(yīng)用，旨在解決和研究這些特定的與壓力無(wú)關(guān)的病理生理機(jī)制。在眼壓未升高的情況下，基于視網(wǎng)膜和視神經(jīng)損傷的動(dòng)物模型在很大程度上是通過(guò)直接誘導(dǎo)眼結(jié)構(gòu)損傷來(lái)實(shí)現(xiàn)的。這些直接損傷模型與青光眼發(fā)生發(fā)展的進(jìn)程并不接近，然而卻是研究青光眼發(fā)病所涉及的細(xì)胞和分子機(jī)制以及研究神經(jīng)保護(hù)策略的有用工具。Pang等［26］全面總結(jié)了已經(jīng)開(kāi)發(fā)的嚙齒類(lèi)動(dòng)物眼壓非依賴(lài)性動(dòng)物模型，包括視神經(jīng)橫斷或擠壓模型、視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷模型、玻璃體注射興奮性毒性物質(zhì)（如谷氨酸、N-甲基天冬氨酸、內(nèi)皮素-1等）誘導(dǎo)的RGC損傷模型等，并對(duì)視網(wǎng)膜缺血再灌注模型建立的不同方法進(jìn)行了詳細(xì)介紹。

研究報(bào)道，眼壓升高可誘導(dǎo)自體反應(yīng)性T細(xì)胞滲入視網(wǎng)膜，通過(guò)與表達(dá)熱休克蛋白（heat shock protein，HSP）的RGC發(fā)生交叉反應(yīng)而導(dǎo)致神經(jīng)變性，HSP被鑒定為與青光眼小鼠和人青光眼患者T細(xì)胞反應(yīng)的靶抗原。此外，正常眼壓青光眼患者的HSP27和HSP60特異性T細(xì)胞也增加，表明上述發(fā)現(xiàn)可能與青光眼患者有關(guān)［27］。為了能夠更準(zhǔn)確地分析人類(lèi)青光眼患者的免疫反應(yīng)改變，建立了一種實(shí)驗(yàn)性自身免疫性青光眼模型。用HSP27、S100B等抗原免疫該模型誘導(dǎo)青光眼樣損傷，在眼壓未改變的情況下，大鼠表現(xiàn)出RGC損傷和丟失、視神經(jīng)退行性變［28-29］。

3 總結(jié)和展望

青光眼發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及多種因素。選擇能緊密代表人類(lèi)青光眼特點(diǎn)的動(dòng)物模型是將臨床前研究成功轉(zhuǎn)化為臨床實(shí)踐的關(guān)鍵，本文從自發(fā)產(chǎn)生和人為誘導(dǎo)以及眼壓是否升高的角度，對(duì)常見(jiàn)的青光眼動(dòng)物模型進(jìn)行了介紹。嚙齒類(lèi)動(dòng)物應(yīng)用最多，家兔、非人靈長(zhǎng)類(lèi)、犬、小型豬、貓、斑馬魚(yú)也都有應(yīng)用。可以看出，目前可用的模型僅能確保視神經(jīng)的低至中度損傷，結(jié)果差異大，重復(fù)性差，甚至在同一只動(dòng)物的兩只眼睛之間也是如此。模型建立大多使用幼年動(dòng)物，忽略了疾病的危險(xiǎn)因素與患者年齡的增加直接相關(guān)這一因素，可能會(huì)改變研究結(jié)果，阻礙對(duì)疾病的認(rèn)識(shí)和臨床轉(zhuǎn)化［30］。

理想的青光眼動(dòng)物模型應(yīng)能概括人類(lèi)青光眼的形態(tài)學(xué)、生化和病理生理改變，具有類(lèi)似的生物學(xué)機(jī)制以及對(duì)治療藥物有類(lèi)似的反應(yīng)。而當(dāng)前的青光眼動(dòng)物模型遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到此要求，如何改進(jìn)或開(kāi)發(fā)新的模型將是今后青光眼臨床前研究的重點(diǎn)。首先，需要精確、可重復(fù)、非麻醉和無(wú)創(chuàng)的眼壓測(cè)量方法，并進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。其次，CRISPR-Cas9技術(shù)、干細(xì)胞技術(shù)、體外芯片模型等技術(shù)的應(yīng)用將極大地推動(dòng)青光眼臨床前研究。例如，利用CRISPR-Cas9技術(shù)編輯某些疾病患者多能干細(xì)胞中突變的基因，以中和突變，該項(xiàng)技術(shù)正被用于小鼠青光眼模型研究［31］。最后，隨著對(duì)青光眼發(fā)病機(jī)制的進(jìn)一步了解，臨床技術(shù)的提高也將有助于青光眼的診斷和臨床分類(lèi)，并應(yīng)用到動(dòng)物模型中去。